בידוד של אוכלוסיות תאי perivascular מולטיפוטנטיים המבשרים מרקמות אדם לב

Summary

ברקמת לב אדם מטפחת אוכלוסיות תאי מבשר perivascular מולטיפוטנטיים שעשויה להיות מתאים התחדשות שריר לב. הטכניקה המתוארת כאן מאפשרת בידוד סימולטני וטיהור שתי אוכלוסיות תאי סטרומה מולטיפוטנטיים קשורות כלי דם מקומיים, כלומר CD146 ⁺ CD34 ^- pericytes ו CD34 ⁺ CD146 ^- תאי adventitial, מן שריר הלב האנושי.

Abstract

תאי גזע/סטרומה מזנכימליים מולטיפוטנטיים (MSC) בודדו באופן קונבנציונלי, באמצעות הדבקותם הפלסטית, מעיכול רקמות ראשוניות בעוד שמיקומם האנטומי נותר לא ברור. הגילוי האחרון של ביטוי סמן perivascular מוגדר ותאי MSC על ידי תאים perivascular ברקמות מרובות על ידי קבוצתנו וחוקרים אחרים סיפק הזדמנות לבודד ולטהר באופן פרוספקטיבי תת-אוכלוסיות הומוגניות ספציפיות של תאי מבשר perivascular רב-פוטנטיים. הדגמנו בעבר את השימוש במיון תאים מופעלים פלואורסצנטיים (FACS) לטיהור ^{פריציטים} מיקרווסקולריים CD146⁺CD34 ותאי הרפתקאות CD34⁺CD146 משריר השלד האנושי. כאן אנו מתארים שיטה לבודד בו זמנית את שתי תת-קבוצות התאים הפרי-וסקולריות הללו משריר הלב האנושי על ידי FACS, בהתבסס על ביטוי של קבוצה מוגדרת של סמני פני התא לבחירות חיוביות ושליליות. שיטה זו מאפשרת אפוא שתי תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאי מבשר דמויי MSC לבביים רב-פוטנטיים לשימוש במחקר בסיסי ו/או חקירות טיפוליות.

Introduction

הלב מזה זמן רב נחשב איבר שלאחר mitotic. עם זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו נוכחות של מחזור cardiomyocyte מוגבל בלבות בני האדם המבוגר ^1. תאי גזע / אב Native עם פוטנציאל התמיינות cardiomyocyte גם זוהו בתוך שריר הלב ב מכרסמים מבוגרים בליבותיהם, כולל SCA-1 ^+, c-kit ^+, cardiosphere יוצרים, ולאחרונה, ^2,3 תאי מבשר perivascular. תאים אלה מייצגים מועמדים אטרקטיביים עבור טיפולים שמטרתם הגברת תיקון / התחדשות לב באמצעות השתלה תאית או גירוי של התפשטות in-situ.

גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSC) בודדו כמעט מכל רקמה אנושית....

Protocol

עיבוד 1. לדוגמא אדם לב

1. ודא כי כל הנוזלים, מכולות, המכשירים, והשטח המבצעי הייעודי הם עקרים.
2. מניחים את המדגם ברקמת הלב (רכש על ידי בנק רקמות או צוות המנתחים) במדיום אחסון מורכב בינוני הנשר שונה של צונן Dulbecco (DMEM) המכילה סרום שור העובר 20% (FBS) ו -1% סטרפטומיצין פניצילין (P / S) על הקרח לתחבורה ^3.
3. הסר את מדגם הלב ממדיום האחסון ולשטוף עם מדיום כביסה מורכב פוספט שנאגר מלוח (PBS) בתוספת 2% FBS ו -1% P / S. בעת טיפול המדגם, השתמש ....

Results

תאים בודדים נבדלו פסולת כפילויות על בסיס חלוקות פיזור קדימה והצד. תאים חיים זוהו על ידי הכישלון שלהם לקחת את צבען DAPI. האסטרטגיה gating נבחר על בסיס תיוג אלוטיפ של חיה זו, דיסוציאציה התא כולו-לב (איור 1). מתוך תאי חיים, CD45 ⁺ תאים היו מגודרים החוצה ראשונה, ואחריו CD56 ⁺ תאים. תאי CD144 ⁺ אנדותל ואז הוצאו מן CD56 ^- חלק. מתוך אוכלוסייה זה סופי, CD146 ⁺ / CD34 ^- peric.......

Discussion

ראיות הגדלת תומך יכולת התחדשות מוגבלת של הלב האנושי המבוגר לאחר פציעה. זיהוי ואפיון של תאי מבשר יליד אחראים תגובות התחדשות כאלה לבבות פגועים הם קריטיים עבור שני להבנת מנגנונים הקשורים מסלולי איתות ופיתוח הגישות לנצל תאים אלה טיפוליים.

פרוטוקולים קודמים תיארו את הבידוד של תת תאים מבשר perivascular מ ²⁵ שרירי השלד האנושי. עם זאת, היישום הישיר של טכניקות אלה לרקמות לב לעתים קרובות לייצר יבולי תא עניים מאו.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ערכת חרוזים נגד עכבר AbC	בדיקות מולקולריות	A-10344
קולגנאז I	Gibco	17100-017	להרכיב מחדש אבקה לפי הצורך ולסנן לעקר
קולגנאז II	Gibco	17101-015
קולגנאז IV	Gibco	17104-019
אנטי אנושי CD34-PE	BD Pharmingen	555822	לשמור על סטרילי
CD45-APC-Cy7	BD Pharmingen	557833	שמור על סטרילי
אנטי אנושי CD56-PE-Cy7	BD Pharmingen	557747	שמור על סטרילי
אנטי אנושי CD144-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	561566	שמור על
סטרילי אנטי אנושי CD146-AF647	AbD Serotec	MCA2141A647	שמור על סטרילי
EGM2-BulletKit	Lonza	CC-3162	לאיסוף תאים ותרבית עד להדבקה
ב-DMEM, גלוקוז גבוה, GlutaMAX ללא נתרן פירובט	ThermoFischer Scientific	10566-016
סרום בקר עוברי	ThermoFischer Scientific	10500-064	להקפיא בכמוסות ולשמור על
ג'לטין	Sigma Aldrich	G1393	לדלל במים סטריליים
IgG1k-PE	BD Pharmingen	559320	שמור על
IgG1k-APC-Cy7	BD Pharmingen	סטרילי 557873	שמור על
IgG1k-PE-Cy7	BD Pharmingen	סטרילי 557872	שמור על
IgG1k-PerCP-Cy5.5	BD Pharmingen	סטרילי 561566	שמור על סטרילי
IgG1k-647	AbD Serotec	MCA1209A647	שמור על
סרום עכבר	Sigma Aldrich	M5905	שמור
סרט פרפין סטרילי - Parafilm M	Sigma Aldrich	P7793
פניצילין-סטרפטומיצין	Gibco	15979-063	להקפיא בכמויות ולשמור על
חוצץ פוספט סטרילי pH מלוח pH 7.4	ThermoFischer Scientific	10010-023
תאי דם אדומים סטרילי Hybri-Max	Sigma Aldrich	R7757	שמור על
טריפן סטרילי Blue Solution	Sigma Aldrich	T8154
Trypsin-EDTA 0.5% (10x)	Invitrogen	15400-054
FACSARIA FUSION	BD Pharmingen		סדרן תאים מופעל פלואורסצנטי