פרוטוקול מפורט לאפיון לקו הסלולרי Murine C1498 דגם Associated לוקמיה העכבר שלה

סיכום

כתב יד זה מספק הליך טכני, שניתן להשתמש בהם כדי לאפיין בתרביות תאים C1498 במבחנה ואת לוקמיה חריפה הנגרמת בעכברים לאחר ההזרקה שלהם. פנוטיפי ניתוחים תפקודיים מבוצעים באמצעות זרימה cytometry, מיקרוסקופיה immunofluorescence, cytochemistry ומאי-גרונוולד מכתים Giemsa.

תקציר

הזרקה של תאים C1498 לעכברים syngeneic או congenic שבוצעה מאז 1941. זריקות אלו לגרום להתפתחות של לוקמיה חריפה. עם זאת, אופי המחלה הזאת לא תועד היטב בספרות. כאן, אנו מספקים פרוטוקול טכני לאפיון תאי C1498 במבחנה לקביעת האופי לוקמיה מושרה in vivo. החלק הראשון של הליך זה מתמקד בקביעת שושלת hematopoietic והן שלב התמיינות של תאים בתרבית C1498. כדי להשיג זאת, מכתים תזרים cytometric רב פרמטריים משמש לזיהוי סמנים תא hematopoietic. מיקרוסקופיה immunofluorescence, cytochemistry וכן מכתים מאי-גרונוולד Giemsa מבוצעות ואז להעריך את הביטוי של myeloperoxidase, הפעילות של esterases ומורפולוגיה הסלולר, בהתאמה. החלק השני של פרוטוקול זה מוקדש לתיאור המחלה לוקמיה מושרהvivo. זו האחרונה יכולה להיות מושגת על ידי קביעת התדרים של תאי leukemic הטבועים בדם, איברי hematopoietic (למשל, מח עצם וטחול) ורקמות שאינן הלימפה (למשל, הכבד וריאות) באמצעות מכתים ספציפי cytometry זרימת מנתח. טבעו של לוקמיה הוא אישר מכן באמצעות מאי-גרונוולד Giemsa מכתים מכתים עבור esterases ספציפיים במח העצם. כאן, אנו מציגים את התוצאות שהושגו באמצעות פרוטוקול זה לפי גילאים C1498- ועכברים PBS מוזרק.

מבוא

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) מאופיין בריבוי בלתי מבוקרת של תאים מיאלואידית hematopoietic הנחסמים בשלבים שונים של הבשלה. חוסר ויסות זה יכול להשפיע על granulocytic, monocytic, האריתרוציטים או מסלולי בידול megaryocytic ^1. תאים AML מצטברים במוח העצם, מה שמוביל hematopoiesis פגום, שתוצאתה thrombopenia, lymphopenia ואנמיה. התאים leukemic גם לפלוש דם ואיברים שאינם הלימפה.

מודל העכבר C1498 שימש במשך עשרות שנים כמודל לוקמיה חריפה מאז תאים סרטניים בודדו עכברה 10 בן חודש leukemic C57BL / 6 (H-2 ^ב) בשנת 1941. הספרות מתארת את הפלישה אל הדם , איברי hematopoietic (למשל, בלוטות הטחול הלימפה) ואיברים שאינם hematopoietic (למשל, הכבד, ריאות, שחלות, וכליות) על ידי תאי שגשוג C1498 מאוד אחרי שהם הוזרקו דרך בtravenous, תת עורית או מסלול תוך הצפק לעכברים רגישים ^2-4. עם זאת, במודל של עכברים זה נמסר לגרום ^2,5 granulocytic או או myelomonocytic ⁶ לוקמיה. לאחרונה, מחקר שפורסם בשנת 2002 תיאר סוג זה של סרטן כמו לוקמיה של תאים NKT murine ^7. לפיכך, ספרות שונה לגבי אופי הקו הסלולרי C1498 זה ואת לוקמיה הקשורים זה גורם בעכברים. סטיות אלה נקראות בעיקר בשל חוסר מפורט ומידע שפורסם עודכן על התאים ומחל leukemic בכלל כי מחקרים רבים בוצעו ב 1950 - של 70.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט לתאר כיצד לאפיין תאים C1498 ולנתח את אופי המחלה leukemic כי הוא המושרה על ידי הזרקה תוך ורידית שלהם לעכברים. החלק הראשון של פרוטוקול זה מוקדש לתיאור תאי C1498 כי כבר מתורבת במבחנה. אנטי פלורסנטהגופים המכוונים נגד משטח וסמני hematopoietic תאיים ששמשו לקביעת הפנוטיפ שלהם באמצעות cytometry זרימה. הנוכחות של myeloperoxidase הוערכה באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence, בשלב השושלת והבחנה hematopoietic שלהם הוערכו באמצעות cytochemistry להעריך את הפעילות של esterases, ומאי-גרונוולד Giemsa מכתים בוצע. תאי C1498 אז הוזרקו לעכברים, והמחלה לוקמיה החריפה כי הושרה מתוארת בחלק השני של כתב היד הזה. אותן טכניקות ששימשו לקביעת התדרים פנוטיפים של תאים leukemic ו הגלום מח עצם, דם היקפי, הטחול ואיברים שאינם hematopoietic (הכבד והריאות).

פרוטוקול זה הוא מאוד לשחזור, ואת הנתונים המוצגים כאן יסייעו לחוקרים להעריך את ההשפעות של אסטרטגיות טיפוליות חדשות. במודל של עכברים לוקמיה זה כבר נעשה שימוש כדי לבדוק אימונותרפיה מתקרבnd כימותרפיות סרטן שונים תרופות ^8,9. יעילותם הוערכה על ידי קביעת האבולוציה של נטל הגידול ושיעורי ההישרדות. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לספק מידע נוסף על החלוקה והמחייה של אוכלוסיות תאי hematopoietic leukemic ואחרות במהלך טיפול.

פרוטוקול

דיור בעלי חיים וכל הפרוצדורות אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית טיפול בבעלי חיים, CEEA.NPDC (no.512012 הסכם), וכל הניסויים בוצעו בהתאם להנחיות הצרפתית והאירופית לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. אפיון במבחנה של הקו הסלולרי C1498

1. בתרבות במבחנה של תאי C1498
   1. הכן RPMI להשלים (מכון ממוריאל פארק Roswell) 1640 בינוני על ידי הוספת 50 מ"ל של סרום שור העובר (FBS), 5 מ"ל של פניצילין (100 U / ml) -streptomycin (100 מיקרוגרם / מ"ל), 500 μl של 50 מ"מ β-mercaptoethanol , 5 מ"ל של N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-אתאן חומצה sulfonic (HEPES), 5 מ"ל של חומצות אמינו לא חיוניות ו -5 מ"ל של פירובט נתרן ל -500 מ"ל של מדיום RPMI.
   2. לגדל את שורת תאי C1498 ב RPMI להשלים. קציר התאים בתרחיף על ידי pipetting, ולהעביר את התאים צינור 50 מ"ל. צנטריפוגה ב XG 350 במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant.
   3. הוסף 20 מ"ל של תמיסת מלח פוספט שנאגרו (PBS) (1x) פתרון, צנטריפוגות ב XG 350 במשך 10 דקות, ולהסיר את supernatant.
   4. Resuspend התאים 10 מ"ל של חיץ סדרן תא הקרינה הופעל (FACS) (2.5 גרם של אלבומין בסרום שור (BSA) אבקת ו -2 מ"ל של 0.5 M חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) פתרון 500 מ"ל של תמיסת PBS). ספירת התאים באמצעות תא תומת ספירה קאמרית לאחר מכתים את התאים עם trypan הכחול.
2. אפיון פנוטיפי של הקו הסלולרי C1498 באמצעות immunostaining וזרימה ניתוח cytometry
   1. תא שטח מכתים
      1. כן חיץ FACS.
      2. התאם את התאים שנקטפו במאגר FACS 10 ⁷ תאים / מ"ל ו לוותר 10 ⁶ תאים (100 μl) עבור כל ניסוי מכתים לתוך זרימת cytometry צינורות.
      3. לייבל את התאים עם 100 μl של נוגדנים הבאים או בקרות אלוטיפ הקשורים בהם מדולל במאגר FACS:
         1. טופסarkers של מבשר תאים מובחנים, לתייג את התאים עם אנטי CD11b / אנטי CD18 (1), אנטי-Ly-6G (1), אנטי CD19, אנטי-B220 (2), אנטי-NK1.1, אנטי CD49b, אנטי CD4 (1), אנטי CD8 (2), אנטי CD3 (3), אנטי-CD21 / 35, אנטי-CD115 ואנטי TCRVβ נוגדנים.
         2. עבור סמנים בתאי גזע / אבות היווצרות הדם, משתמשים בשילוב של אנטי CD34 / אנטי-CD117 / אנטי SCA-1, אנטי-CD150 / אנטי-CD117 / אנטי SCA-1, אנטי-CD117 / אנטי-CD127 או אנטי CD16 / 32 ביוטין נוגדנים לבד.
         3. עבור סמנים של התא פונקציות (למשל, הדבקה, מצגת אנטיגן, מולקולות גירוי שיתוף קולטנים), להכתים את התאים עם אנטי CD18 (2) / אנטי CD11a, אני בכיתה אנטי MHC, אנטי-MHC class II, אנטי CD31, אנטי CD44, אנטי CD80 ביוטין, אנטי CD86, ואנטי-CD274 נוגדנים.
      4. דגירה כל הזרימה cytometry צינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      5. שוטפים את התאים פעמיים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד, צנטריפוגות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
      6. הוספת 100 μl של חיץ FACS על צינור אחד והמשך מכתים המשני על ידי הוספת 100 μl של streptavidin ניאון (1/100 במאגר FACS עבור דילול הסופי של 1/200) אל נוגדנים biotinylated מצומדות. דגירת הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      7. פעמיים לשטוף את התאים כדלקמן: להוסיף 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד, צנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant ידי pipetting.
      8. Resuspend התאים 500 μl של PBS קר ומניחים את התאים על הקרח, שמירה על אותם בחושך באמצעות רדיד אלומיניום לכיסוי צינורות. נתחו את התוצאות באמצעות cytometer ^10.
   2. מכתים תאיים
      1. הכן חיץ קיבעון על ידי הוספת 125 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% (PFA) ל 375 מ"ל של תמיסת PBS.
         הערה: כדי להכין 500 מ"ל של 4% PFA, חום 400 מ"ל של תמיסת PBS כ 60 ° C על צלחת ומערבבים במנדף מאוורר. הוסף 20 גר 'אבקת PFA, ולהעלות את רמת החומציותעד PFA נמס. אפשר פתרון להתקרר, להתאים את ה- pH ל 6.9, ולעשות את הווליום עד 500 מ"ל עם PBS.
      2. הכן את החיץ permeabilizing ידי הוספת 0.5 גרם של saponin ו -0.5 גרם של BSA 500 מ"ל של תמיסת PBS.
      3. התאם את התאים שנקטפו במאגר FACS 10 ⁷ תאים / מ"ל ולהפיץ 10 ⁶ של תאים (100 μl) עבור כל ניסוי מכתים לתוך זרימת cytometry צינורות. צנטריפוגה התאים ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
      4. תקן את התאים ב 200 μl של פתרון 1% PFA דגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C.
      5. הוסף 2 מ"ל של חיץ permeabilizing על צינור אחד, צנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant ידי pipetting. הוספת 100 μl של חיץ permeabilizing על צינור אחד.
      6. לייבל את התאים עם 100 μl של נוגדנים הבאים או בקרות אלוטיפ המתאימים לאחר דילול אותם permeabilizing חיץ: אנטי CD3 (2) / אנטי CD8 (1), אנטי CD3 (3) / aNTI-CD4 (2), אנטי-CD107b ואנטי-CD3 (3) / אנטי TCRVβ.
      7. דגירת התאים ב 4 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
      8. פעמיים לשטוף את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ permeabilizing על צינור אחד. בצנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant.
      9. הוספת 100 μl של חיץ permeabilizing אל התאים. המשך מכתים המשני על ידי הוספת 100 μl של streptavidin פלורסנט מדולל permeabilizing חיץ נוגדנים biotinylated מצומדות. דגירת הצינורות ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
      10. הוסף 2 מ"ל של חיץ permeabilizing על צינור אחד, בצנטריפוגה צינורות ב XG 350 במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת.
      11. Resuspend התאים 500 μl של קר PBS, ולאחר מכן למקם את התאים על הקרח בחושך. לנתח את התוצאות באמצעות cytometer זרימה ^10.
3. הכנת ההשעיה תא בשקופיות למיקרוסקופיה
   1. שטפי 10 ^-6 דונםrvested C1498 תאים (שהושגו בשלב 1.1.4) עם 5 מ"ל של FACS קר חיץ פעמיים, לדלל את התאים ב 1 מ"ל של חיץ FACS קר. מניחים את הצינורות על הקרח.
   2. מניחים שקופיות לתוך תאי הפנויה עם כרטיסי מסנן מראש מצ"ב במקום אלה לתוך cytocentrifuge.
   3. הוספת 100 μl של חיץ FACS לכל קלף קאמרי המסנן, ומסובב אותם 2 דקות ב g 4.52 x.
   4. הוספת 100 μl של תאים לכל קלף קאמרי לסנן, לסובב את התאים ב 4.52 XG למשך 2 דקות.
   5. מוציאים בזהירות את השקופיות מתאי ואוויר-לייבש את השקופיות לפני השארתם myeloperoxidase (שלב 1.4), esterases (שלב 1.5) או מאי-גרונוולד Giemsa (שלב 1.6).
4. מכתים Myeloperoxidase עבור immunofluorescence
   1. תקן את התאים בשקופיות ידי טבילת השקופיות מתנול קרה: אצטון (1: 1) פתרון עבור 2 דקות, ולאחר מכן להתייבש באוויר השקופיות.
   2. כדי להגביל את הנוזל לאזור של השקופית המכילה את התאים, לצייר CIrcle סביב התאים באמצעות עט דוחה מים.
   3. שוטף את תאי 200 μl של פתרון קר PBS במשך 10 דקות.
   4. חסום את התאים 200 μl של 3% BSA / PBS חיץ המכיל 10 μl של חמור בדם נורמלי ו -10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של מטוהרים אנטי CD16 / 32 נוגדנים.
   5. החל 200 μl של myeloperoxidase אנטי עכבר (מדולל ל 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ב חיץ 3% BSA / PBS). דגירת התאים O / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא לחות.
   6. שוטפים את התאים עם 200 μl של 0.1% BSA / PBS קר.
   7. החל 200 μl של נוגדנים מסוג IgG נגד עז מדולל ב 1/250 ב 3% BSA / PBS חיץ. דגירת התאים למשך שעה 2 ב RT בתא לחות.
   8. שוטפים את התאים 3 פעמים עם 200 μl של חיץ 0.1% BSA / PBS ופעמיים בקור PBS.
   9. הכתם גרעיני תאים עם 200 μl של Hoechst מדולל ב 1 / 1,000 PBS (לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 2 דקות ב RT.
   10. שטפו את השקופיות עם מים ולאפשר להם אוויר יבש לפני מאונטיןז. החל טיפה אחת של הרכבה בינונית 1 אל התאים, להציב קצה אחד של זכוכית מכסה לשקופית, ובזהירות ומוריד אותה אל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר.
5. אסטראז cytochemistry
   הערה: טרום חם כל ריאגנטים RT.
   1. הכנה מקבעת
      1. כדי להכין את הפתרון ציטראט-אצטון-פורמלדהיד (CAF), להוסיף 2.5 מ"ל של תמיסת ציטרט, 6.5 מ"ל של אצטון 0.8 מ"ל של 37% פורמלדהיד בקבוק זכוכית. מערבבים בעדינות ולאחסן על 4 מעלות צלזיוס.
   2. Naphthol AS-D אסטראז Chloroacetate assay פעילות (CAE)
      1. מים ללא יונים חמים 37 ° C.
      2. בתוך צינור 50 מ"ל, להוסיף 1 מ"ל של תמיסת סודיום ניטריט עד 1 מ"ל של תמיסת צבע. מערבבים בעדינות ולתת לעמוד במשך 2 דקות. הוסף 40 מ"ל מים ללא יונים מחומם מראש, 5 מ"ל של תרכיז pH 6.3 חיץ 1 מ"ל של Naphthol AS-D פתרון Chloroacetate. מערבבים ומעבירים לצנצנת Coplin.
      3. תקן את התאים עלשקופיות (ראו סעיף 1.3) למשך 30 שניות עם פתרון CAF (ראה שלב 1.5.1.1), ולשטוף את השקופיות עבור 45 שניות עם מים ללא יונים.
      4. העברת שקופיות לתוך התמיסה כי היה מוכן בשלב 1.5.2.2, דגירה השקופיות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתא לחות מוגן מפני אור.
      5. לייבש את השקופיות ולאחר מכן לשטוף אותם באמצעות טבילה במים deionized במשך 2 דקות.
      6. Counterstain את התאים על ידי הוספת כמה טיפות של תמיסת Hematoxylin דוגרים אותם דקות 1.
      7. שטפו את השקופיות במים ניטרליים (pH 7) ולאפשר להם אוויר יבש. החל טיפה אחת של הרכבה בינונית 2 לתאים, להציב קצה אחד של זכוכית מכסה לשקופית ובזהירות ומוריד אותה אל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר.
   3. assay פעילות אלפא-Naphthyl אסטראז בוטיראט (Nbe)
      1. פתרון בוטיראט α-naphthyl חם 37 ° C לפני השימוש.
      2. לדלל טבליה אחת של ניט נתרןטקס ב 6.25 מ"ל של מים ללא יונים.
      3. בתוך צינור 50 מ"ל, להוסיף 1.5 מ"ל של פתרון Tablet סודיום ניטריט ו -1.5 מ"ל של פתרון Pararosaniline. מערבבים בעדינות ולאפשר הפתרון לעמוד במשך 5 דקות. מוסף הפתרון עם 40 מ"ל של תמיסת פוספט שנאגרו. מביאים pH 6 על ידי הוספת בקפידה 10 N NaOH dropwise. הוסף 5 מ"ל של הפתרון בוטיראט α-naphthyl, לערבב את הפתרון כולו, ולהעביר אותו לתוך צנצנת Coplin.
      4. תקן את התאים על השקופיות עבור 10 שניות באמצעות פתרון CAF ב RT ולשטוף במשך 45 שניות עם מים ללא יונים.
      5. העברה מחליקה לתוך צנצנת Coplin המכילה את הפתרון כי היה מוכן בשלב 1.5.3.2 דגירה יחד עבור שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס בתא לחות תוך מוגן מפני אור.
      6. יש לשטוף את השקופיות עבור 2 דקות במים ניטרליים (pH 7) ואוויר יבש.
      7. Counterstain את התאים עם פתרון כחול מתילן על ידי הוספת כמה טיפות בשקופית דגירה במשך 4 דקות.
      8. לטבול את השקופיות deionized מים למשך 2 דקות ולאפשר להם להתייבש באוויר. כדי לעגן את השקופיות, להחיל טיפה אחת של הרכבה בינונית 2 לתאים, להציב קצה אחד של כיסוי זכוכית לשקופית, ובזהירות ומוריד אותה אל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר.
6. מאי-גרונוולד Giemsa (MGG) מכתים
   1. כתם התאים (מוכן בסעיף 1.3) על ידי טבילת השקופיות לתוך צנצנת Coplin המכילה פתרון מאי-גרונוולד במשך 3 דקות.
   2. העברת שקופיות לתוך צנצנת Coplin המכיל את פתרון חיץ pH 6.8 דקות 1.
   3. כתם השקופיות ידי הצבת לתוך צנצנת Coplin המכילה את פתרון R Giemsa (מדולל ל 1/20 בתמיסת pH 6.8 חיץ) במשך 10 דקות. שטפו את השקופיות במים ניטרליים (pH 7) למשך 10 שניות.
   4. מסננים ואוויר-לייבש את השקופיות. הר שקופיות על ידי החלת טיפה אחת של הרכבה בינונית 2 על התאים. מניחים בקצה אחד של זכוכית המכסה לשקופית ובזהירות להורידו עלאל התאים באמצעות מלקחיים. לחץ בעדינות על מכסה הזכוכית כדי להסיר בועות אוויר.

2. Vivo פיתוח ואפיון של לוקמיה חריפה

הערה: congenic נקבה בת ארבעה שבועות עכברים C57BL / 6J-Ly5.1 נשמרו בתנאים הפתוגן ללא ספציפי (כלומר, בסביבה סטרילית). העכברים הוזרקו כשהיו בין 5 ל -6 שבועות.

1. מתן תוך ורידי עם תאים C1498
   1. קציר תאי C1498 בתרבית השעיות ידי pipetting. מעבירים את התאים צינור צנטריפוגות 50 מ"ל ב 350 XG במשך 10 דקות. שוטפים את התאים ב 10 מ"ל של קר PBS פעמיים, ולהכין ההשעיה תא 10 מ"ל ⁷ תאים / PBS. מניחים את ההשעיה הסלולר על הקרח לפני ביצוע ההזרקה.
   2. מניחים את העכבר בתוך עוצר ולבצע הזריקה בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית.
   3. שימוש במחט 29G עם מזרק כדי להזריק את התאים לתוךוריד הזנב. אחוז הזנב בקצה הדיסטלי, ולחטא אותו עם ספוג גזה טבול אתנול 70%. בדוק כדי לוודא שאין בועות אוויר בתוך המזרק, ואז לאט לאט להזריק 100 μl של השעית תא C1498 (10 ⁶ תאים) לתוך וריד הזנב.
   4. לאחר הזריקה, להוציא את המחט מזנב, ולשלוט בכל הדימום על ידי הפעלת לחץ בעזרת ספוג גזה סטרילי באזור הזריקה. מחזירים את החיה לכלוב שלה, ולבדוק הבריאות שלה בזהירות מעל בשעות ובימים הבאים.
2. איסוף דם רטרו מסלולית
   1. מעקב אחר ההתנהגות של עכברים שהוזרק C1498 PBS- ו סימנים של המחלה leukemic (למשל, piloerection, בידוד מהקבוצה, והקטינו או לא תנועות בכלוב).
      הערה: זו מתרחשת בדרך כלל בין 17 עד 19 ימים לאחר התאים מוזרקים.
   2. בצע רטרו איסוף דם מסלולית רק לפני המתת חסד (ראה שלב 2.2.7) בתנאים סטריליים זרימה למינריתמכסה מנוע תחת מנורת חימום כדי למנוע היפותרמיה.
   3. עבור הרדמה, להשתמש קטמין ב 150 מ"ג / ק"ג ו xylazine ב 10 מ"ג / ק"ג. הכן את ההרדמה על ידי דילול 1.5 מ"ל של קטמין ו 0.5 מ"ל של xylazine ב 18 מ"ל של תמיסת PBS.
   4. להרדים את מלאת עכברי leukemic. המשך עם זריקה intraperitoneal של 200 μl של הפתרון הרדמה לכל 10 גרם של העכבר באמצעות מחט 26G ו מזרק 1 מ"ל. בדוק על אובדן רפלקס הדוושה כדי לאשר הרדמה.
   5. הכנס צינור נימים לתוך canthus המדיאלי של העין. דם יעלה מ הסינוס מסלולית לתוך צינור הנימים. להשתלט על הדימום על ידי הפעלת לחץ בעדינות על העין עם ספוג גזה סטרילי.
      הערה: נפח של 100 עד 200 μl של דם ניתן לאסוף באמצעות טכניקה זו.
   6. אסוף את הדם לתוך צינור EDTA, ולאחסן את המדגם על הקרח לפני לבודד את התאים mononuclear.
   7. להרדים את העכבר באמצעות פריקה צוואר הרחם, ולהמשיך לבודד את האיברים (סעיף 2.3).
3. בידוד איברים ותאים
   1. בידוד איברים
      1. מניחים את העכבר מורדמים על הגב שלה על לוח פלסטיק ולהשתמש מחטים להצמיד את הרגליים של החיה כדי להקל בידוד איברים. לחטא את העכבר באמצעות אתנול 70% לפני ביצוע חתך.
      2. בעזרת מספרי סטריליות, לבצע חתך גחון מעור הבטן עד הצוואר. חותכים דרך דופן הבטן כדי לגשת הכבד. חותכים דרך כלוב הצלעות הסרעפת לגשת הריאות. הזז את המעי לצד ולהסיר את הטחול באמצעות מספריים מלקחיים סטרילית.
      3. כדי לבודד את מח העצם, לחתוך את הרגליים בחלק העליון של עצמות הירך מעל המפרק באמצעות מספריים סטרילית. נתק את השוקה מן הירך על ידי משיכה עדינה, ולהסיר את העור והשרירים מהעצמות באמצעות מלקחיים ומספריים.
      4. מניחים כל איבר ועצמות בתוך שפופרת 50 מ"ל המכיל קר PBS, ומניחים אותם על הקרח.
   2. בידוד של תאים מהאיברים
      1. לשקול את הטחול לפני לשבש את התאים. מבחינה מכנית לשבש את הטחול, הריאות והכבד ידי לחיצה אותם דרך מסננת 70 מיקרומטר באמצעות הבוכנה במזרק בתוך שפופרת 50 מ"ל, לאסוף את התאים לתוך 30 מ"ל של קר PBS.
      2. כדי לאסוף תאי מח עצם, לשים את עצמות הירך לבין שוקיים בצלחת פטרי על קרח, לחתוך את הגפיים באמצעות מספריים סטרילי, לשטוף את מוח העצם על ידי החדרת מחט 26G מצורף מזרק 10 מ"ל המכיל 5 מ"ל של קר PBS.
         1. לשבש את תאי מח העצם על ידי עובר ההשעיה התא דרך מחט / מזרק, ולסנן את ההשעיה התא דרך מסננת 70 מיקרומטר בתוך שפופרת 50 מ"ל.
      3. צנטריפוגה כל צינורות המכילים כל אחד האיברים ואת תאי מח העצם ב XG 350 במשך 10 דקות. בטל supernatant, ו resuspend התאים שנאספו ממח הריאות העצם ב 2 מ"ל של חיץ תמוגה (1x) והתאשעות מבודד מהכבד והטחול ב 5 מ"ל של חיץ תמוגה (1x) על ידי pipetting את התערובת בעדינות מעלה ומטה. ממלאים את צינורות עד 50 מ"ל עם קר PBS.
      4. צנטריפוגה התאים ב XG 350 במשך 10 דקות. Resuspend התאים חיץ FACS עבור ניתוח תזרים cytometry או להכין את התאים במיקרוסקופ. ספירת התאים באמצעות תא ספירת תאי תומה לאחר השאיר trypan הכחול.
4. מכתים פני התא של תאים מבודדים מאיברים עבור ניתוח תזרים cytometry
   1. בשנת זרימה cytometry צינור, תווית 10 ⁶ תאים שהיו מבודדים מאיברים עם 10 מיקרוגרם / מ"ל של נוגדנים מטוהרים אנטי CD16 / 32 ב 100 μl של חיץ FACS.
   2. עד 10 ⁶ תאים במח העצם, להוסיף 100 μl של נוגדנים הבאים או שילובים של נוגדנים ובקרות אלוטיפ המתאימים מדולל במאגר FACS: אנטי CD11b / אנטי CD3 (1) / אנטי Ly6C / אנטי Ly6G (2), אנטי-B220 (1) /anti-CD45.2/anti-CD19, אנטי-CD115 / אנטי CD3 (1) /TI-Ly6C / אנטי Ly6G (2),-CD45.2, אנטי Ly6G (2), אנטי-CD11b, אנטי-CD115 או אנטי CD19 לבד הגדרות פיצוי.
   3. כדי splenocytes, להוסיף 100 μl של נוגדנים הבאים ובקרות אלוטיפ המתאימים מדולל במאגר FACS: שילוב של אנטי-CD11b / אנטי CD3 (1) / אנטי Ly6C / אנטי Ly6G (2), אנטי-B220 (1 /anti-CD45.2/anti-CD19, אנטי CD45.2), אנטי-Ly6G (2), אנטי-CD11b או-CD19 אנטי עבור הגדרות פיצוי.
   4. כדי לתאי ריאה וכבד, להוסיף 100 μl של נוגדנים נגד CD45.2 ובקרה אלוטיפ המתאים מדולל ב 1/100 במאגר FACS.
   5. דגירה כל פתרונות התא למשך 30 דקות ב 4 ° C.
   6. שוטפים את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד. צנטריפוגה צינורות במשך 5 דקות ב 350 XG ולהשאיר את supernatant ידי pipetting. חזור על פעולה זו עוד פעם אחת.
   7. Resuspend התאים שכותרתו 500 μl של PBS קר. שמור את התאים על הקרח מוגן מפני אור לפני ביצוע זרימת cytometry עבור acquisition וניתוח ^10.
5. בידוד של תאים mononuclear דם מכתים immunofluorescent עבור ניתוח תזרים cytometry
   1. לפני שמתחילים בפרוטוקול, מראש לחמם הפתרון הפרדת RT.
   2. מעבירים את דגימת דם (100 עד 200 μl; המתקבל צעד 2.2) לתוך צינור microcentrifuge, ולהוסיף פתרון PBS / 1 mM EDTA עד נפח הפתרון הוא 500 μl. בזהירות שכבת 500 μl של הפרדת פתרון תחת תמיסה המכילה את הדם באמצעות מחט 30G ו מזרק 1 מ"ל. אין לערבב את הדם ואת פתרון ההפרדה.
   3. צנטריפוגה צינורות ב 800 XG (ללא בלם) במשך 20 דקות ב RT. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את טבעת הסלולר (ההשכבה הלבנה האטומה) בעזרת פיפטה. מעבירים את התאים לצינור microcentrifuge.
      הערה: ההשכבה הלבנה האטום מכילה לימפוציטים וכן מונוציטים ומופיעה בין השכבה התחתונה - פתרון הפרדה - ואת השכבה העליונה.
   4. הוסף 1 מ"לשל פתרון PBS, ו צנטריפוגות הצינור ב XG 350 במשך 10 דקות. Resuspend התאים 600 μl של חיץ FACS.
   5. הוסף 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של אנטי CD16 / 32 נוגדנים מטוהרים ולהפיץ 100 μl של השעיה התא לתוך שישה צינורות נפרדים (100 μl כל אחד).
   6. לייבל את התאים עם 100 μl של נוגדנים הבאים או בקרות אלוטיפ הקשורים בהם מדולל במאגר FACS: שילוב של-CD3 אנטי (1) / אנטי-B220 (1) /anti-CD45.2 ואנטי Ly6C / אנטי-CD115 /anti-CD45.2 או אנטי-CD45.2 ואנטי-CD115 לבד הגדרות פיצוי.
   7. דגירה כל הצינורות על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   8. שוטפים את התאים על ידי הוספת 2 מ"ל של חיץ FACS על צינור אחד, ואז צנטריפוגות צינורות במשך 10 דקות ב 350 XG, וזורקים supernatant בעזרת פיפטה.
   9. Resuspend התאים שכותרתו 500 μl PBS קר. שמור את התאים על קרח מוגן מפני אור לפני ביצוע זרימת cytometry רכישה וניתוח ^10.
6. הכנת תרחיפים תא מח עצם בשקופיות למיקרוסקופיה
   1. פעל על פי השלבים המתוארים בסעיף 1.3, אבל בשלב 1.3.1, השתמש 10 ⁵ תאים במח העצם, בשלב 1.3.4, לסובב את התאים לתוך כל תא ב 72.26 XG במשך 10 דקות.
7. מבחני פעילות אסטראז באמצעות תאי מח עצם
   1. כדי לבצע את מבחני cytochemistry אסטראז מח עצם, להמשיך מן הצעדים 1.5 עד 1.5.3.7.
8. מאי-גרונוולד Giemsa מכתים של תאים במח העצם
   1. כדי להכתים תאים במח העצם, לעקוב אחר פרוטוקול כמתואר בסעיף 1.6, אבל בשלב 1.6.1, דגירה את השקופיות פתרון מאי-גרונוולד למשך 5 דקות.

תוצאות

כדי לאפיין את מודל עכבר C1498, המשכנו עם שני שלבים עיקריים. ראשית, תאי C1498 התאפיינו לקבוע בשלב השושלת והתבגרות hematopoietic שלהם במבחנה (איור 1). תאים אלה הוזרקו אז לעכברים congenic, ואופי המחלה leukemic המושרה הוערך לקבוע תכונות שונות: חדירת תא leukemic, פנוטיפ שלהם, כימות של תאים hematopoietic (בוגרת אבות / מבשרי) במח העצם, התדרים של C1498 תאים ותאי hematopoietic בוגרים בדם והערכת נפיחות איבר (בטחול, בכבד, וריאות) ואת רכב הסלולר.

כדי לאפיין את פנוטיפים תא C1498 במבחנה, התאים תויגו עם נוגדנים המכוונים נגד מולקולות אשר מתבטאים על ידי מבשרי hematopoietic ותאי בוגרת (טבלה 1), ואת התוצאות נותחו באמצעות זרימת cytometר"י. תאי C1498 היו חיוביים עבור ביטוי פני תא של Mac-1 (CD11b / CD18) (~ 7%), B220 (> 25%), והם מוצגים ביטוי תאי של CD3ε, קולטן T-Cell (TCR) שרשרות Vβ ו- Mac -3 (איורים 2A ו- B). התאים היו שליליות על שטח פני התא סמנים Ly6G, Ly6C, CD115, CD21 / CD35, CD19, CD3, CD4, CD8, NK1.1, והפאן-NK מולקולות על מנת לתת ביטוי תאיים של CD4 ו CD8 (מידע לא מוצג) . הם נבדקו אז עבור סמנים של תאי גזע hematopoietic ואת אבות (טבלה 1). הם היו גם שליליים לביטוי פני תא של CD117, CD34, SCA-1, CD150 ו CD16 / 32 (מידע לא מוצג). תאים leukemic אלו נבדקו מכן כדי לקבוע את הביטוי של הידבקות, מצגת אנטיגן ומולקולות גירוי שיתוף. התאים הביע סמנים משטח LFA-1 (CD11a / CD18), CD44, CD31 (PECAM-1), ו- H-2 ד ^ב ו היו שליליות עבור הכיתה MHC II, CD80, CD86 ו CD274 (מידע לא מוצג). t תאי C1498herefore לידי ביטוי הן מיאלואידית (Mac-1, Mac-3) וסמנים הלימפה (B220, CD3, TCR).

כדי להיטיב לאפיין השושלת שלהם hematopoietic, ביטוי myeloperoxidase הוערך באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence. כל התאים היו חיוביות עבור myeloperoxidase, אשר אומת המוצא מיאלואידית שלהם (איור 3 א). רוב התאים גם מוכתם חיובית esterases בוטיראט α-naphthyl (איור 3B, בחלונית הימנית), וחלק מהם מוכתם עבור naphthol AS-D esterases chloroacetate (חיצים שחורים) (איור 3B, פאנל מימין). תוצאות המחקר מראות כי התאים הכילו תערובת של תאי monocytic ו granulocytic. לאחר מאי-גרונוולד Giemsa מכתים בוצע, התאים C1498 נצפו להציג מורפולוגיה הפיצוץ דמוי עם יחס גבוה Nucleo-cytoplasmic, 3 עד 5 nucleoli בגרעין, הילה perinuclear, vacuoles רבים וכן הציטופלסמה basophilic (איור 3 ג ). thלנו, הקו הסלולרי C1498 מורכב monoblasts ו myeloblasts.

התאים C1498 (CD45.2 ⁺⁾ אז היו מוזרק לווריד לתוך CD45.1 ⁺ עכברים. העכברים נכנעו 17 עד 19 ימים לאחר התאים הוזרקו. עכברים אלו הוקרבו כך הסוג לוקמיה שלהם יכול להיות מנותח לפני שהם מתו מהמחלה. העכברים המלאים, אשר הוזרקו PBS, נותחו באותו מועדים לפי שעון להשוואה. C1498 תא מוזרק עכברים מוצג חדירה מסיבית של תאים C1498 לתוך מח העצם שלהם, כפי שהוכח על ידי הופעתו הפיצוץ דמוי של תאים לאחר מכתים מאי-גרונוולד Giemsa בוצע (איור 4 א). הם גם נשמרים monocytic שלהם פנוטיפים granulocytic (איור 4 ב ו-ג), הוכחת הצטברות של תאי monoblastic ואת מוח העצם האופייני של לוקמיה חריפה myelomonocytic.

כדי דetermine אם מספרי תאי hematopoietic מדולרי היו נמוכים לאחר פלישת תאי leukemic, CD45.2 ⁺ C1498 תאים, לימפוציטית B, monocytic ואוכלוסיות granulocytic (כולל אבות, מבשרים ותאי מבוגר) כומתו באמצעות מכתים immunofluorescent ותזרים רב פרמטריים ניתוח cytometry. תאי leukemic מיוצגים 16 ל -36% של תאי hematopoietic (מידע לא מוצג). סוגי התאים האחרים היו כל נוכחים במספרים נמוכים משמעותי בעכברים המוזרקים C1498 מאשר העכברים המוזרקים PBS (על ידי פי 5 בממוצע תת תא B, פי 4 בממוצע עבור תאי granulocytic ו פי 3 בממוצע עבור תת monocytic) (איור 5 א ג).

מבדיקה של התדרים של תאי mononuclear בדגימות דם leukemic ושליטת עכבר הראתה כי הם מכילים אחוז דומה של לימפוציטים (איור 6 א), אלא בתדירות גבוהה יותר של monocytic ותאי leukemic. מאפיינים אלה הם נציג של לוקמיה חריפה myelomonocytic ¹¹ (איור 6).

בין התכונות האחרות של לוקמיה החריפה myelomonocytic ^12, העכברים המוזרקים C1498 מוצגים עם כבדי נפוחות (hepatomegaly), ריאות טחול (splenomegaly) (איור 7 א). תדרים שונים של תאים CD45.2 ⁺ C1498 אותרו באיברים אלה באמצעות מכתים immunofluorescent ו cytometry ניתוח תזרים (איור 7). כפי splenomegaly יכול לנבוע מספרים גבוהים של מונוציטים הסתננו, אנחנו גם הערכנו את הפרופורציות של אוכלוסיות טחול. המספרים של תאים לימפוציטית B, monocytic ושברי תא granulocytic היו גדולים יותר משמעותי, בשיעור ממוצע של פי 2, פי 2.5 ו 3-לקפל, בהתאמה, ב spleens leukemic מאשר טחול ביקורת (איור 7C).

דק-page = "1">
ייצוג סכמטי באיור 1. לפרוטוקול הגדרה לאפיון שורות תאים במבחנה המתורבת C1498 וב תיאורי vivo של לוקמיה החריפה. שושלת hematopoietic ושלב ההתמיינות של תאי C1498-מתורבת רקמות נקבע ראשון. תאים C1498 הוזרקו לעכברים אז congenic לגרום להתפתחות של לוקמיה חריפה. בידודו של מח עצם, דם היקפי, טחול, כבד ורקמות ריאה בוצע על מנת לקבוע את התדרים, פנוטיפים שינויים מורפולוגיים לאחר חדירת תאי C1498. IV: MGG תוך ורידי:. מאי-גרונוולד Giemsa אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

המודעה / 54,270 / 54270fig2.jpg "/>
איור 2. פנוטיפי ניתוח של C1498 תאים לאחר במבחנת תרבות. תזרים נציג cytometry מגרש נקודה היסטוגרמות של פני תא (א) ו התאי (B) C1498-הביע מולקולות שהיו קשורים עם התמיינות תאי בוגרי hematopoietic מוצגות. תאי C1498 נבצרו מתרבויות, שטף ומסומן באמצעות נוגדני ניאון שהיו ספציפיים פני התא CD11b, CD18 וסמני B220 או בקרות אלוטיפ שלהם. עבור מכתים תאיים, התאים היו קבועים, permeabilized ומסומן באמצעות נוגדנים המכוונים נגד Mac-3, CD3ε, וכן epitope המשותף של TCR (T-Cell Receptor) שרשרת Vβ או בקרות אלוטיפ שלהם. ניתוחים בוצעו באמצעות gating עם תאים חיים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ntent "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 3. פונקציונלי מורפולוגי אפיון תאים בתרבית C1498. תאים C1498 נבצרו מתרבויות centrifuged על שקופיות מיקרוסקופ. (א) מכתים לביטוי myeloperoxidase בוצעה באמצעות immunofluorescence. (ב) תגובות Cytochemical שימשו לנתח את אסטראז בוטיראט α-naphthyl (Nbe) ו naphthol AS-D אסטראז chloroacetate (CAE) פעילויות בתאי C1498. תאים נחשבו חיובי עבור כל תווית כאשר חום ואדום-סגולים, גרגירים ציטופלסמית גדולים, בהתאמה, נצפו. (C) מאי-גרונוולד Giemsa (MGG) מכתים של C1498 תאים. עבור כל ניסוי מכתים, הגדלת מטרת מיקרוסקופיה מותווה. כל תמונה מייצגת של שלושה ניסויים נפרדים.large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. מח עצם מורפולוגיות ב PBS- ו C1498-מוזרק עכברים. תאי מח עצם בודדו PBS- ועכברים C1498-מוזרק תא centrifuged על שקופיות עבור מיקרוסקופיה. (א), רשאי-גרונוולד Giemsa (MGG) מכתים. (B אסטראז בוטיראט α-naphthyl) (Nbe) ו- (ג) naphthol AS-D אסטראז chloroacetate (CAE פונקציות) הוערכו באמצעות cytochemistry. בפנל, הלהקה (בוסר) או בפילוח שונה (בוגרים) נויטרופילים הם פחות גלויה במח העצם של העכברים המוזרקים C1498 מאשר העכברים המוזרקים PBS. לוח B ו- C עולה כי חלה הצטברות של תאי monocytic ו granulocytic במח העצם leukemic לעומת המספרים שנצפתה במח העצם שליטה. את כלניתוחים מיקרוסקופים בוצעו באמצעות מטרה בהגדלת 100x. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. ניתוח כמותי של מדולרי אוכלוסיות ב PBS- ו C1498-מוזרק עכברים. תאי מח עצם בודדו PBS- ו C1498 עכברים מוזרק תא והעריך לאחר ספירת תאים בוצעה. התדרים של אוכלוסיות התאים השונות נקבעו לאחר immunostaining ותזרים מגודר תא חי cytometry ניתוח. (א) תת תא B כלל CD19 ⁺ B220 ⁺ תאים בשלבים מתאים-B Pro להבשיל לימפוציטים מסוג B (B) תאי granulocytic ב CD3 ^- ו CD11b ⁺ Ly6G ⁺ שושלות, שכלל מבשרי. nd גרנולוציטים בשלה ובוגרת (ג) תת monocytic הוגדר CD3 ^- CD115 ⁺ וכלל תאים ובתאים להבשיל בשלבים מונוציטים. n = 7 עכברים / קבוצה, והנתונים מוצגים היסטוגרמות מראות את אמצעי ± SEM. *** P <0.0001 ו **, p <0.01, מבחן T- של סטודנטים מזווגים השוואת PBS- ועכברי C1498-מוזרקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בדיקות דם איור 6. של תת תא mononuclear ב PBS- ו C1498-מוזרקות עכברים. תזרים נציג cytometry מגרשים נקודה של (א) T ו- B אחוזי הלימפוציטים, אשר הוגדרו בהתאמה כמו CD3 ⁺ ו- B220 ⁺ התאים PBS- ו C1498 תא מוזרק. עכברים (B) תא תדרי monocytic ב C1498 leukemic ובקרה (PBS) עכברים נקבעו על ידי ניתוח CD115 ⁺ Ly6C ^- ו CD115 ⁺ Ly6C תאים ^{גבוהים.} הניתוח בוצע על ידי gating תאים חיים. כדי להשוות עכברים leukemic ובקרה, CD45.2 ⁺ C1498 תאים לא נכללו במחקר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

הערכת איור 7. אוכלוסיות הטחול ב leukemic ובקרה עכברים. (א) תמונות נציג של הכבד, הריאות והטחול נפיחות בעכברים leukemic לעומת שליטה עכברים. טחול נאסף שקל, splenocytes נספר בא שיבוש רקמות. (ב) היסטוגרמה מייצג תדרים סלולריים leukemic ב different איברים לאחר immunostaining בוצע עבור CD45.2 ⁺ תאים והתוצאות נותחו באמצעות cytometry הזרימה. (C) אומדנים B הטחול, granulocytic ומספרי טלפונים monocytic לאחר immunostaining וזרימה cytometry gating ניתוח בוצעו לזהות CD19 ⁺ B220 חי ⁺ , CD3 ^- CD11b ⁺ Ly6G ^+, CD3 ^- CD11b ⁺ Ly6C ^- ו CD3 ^- CD11b ⁺ Ly6C תאים ^גבוה. ברי המידה לראות את הריאות, הטחול וכבד עולים 1 סנטימטר. .. n = 5 - 8 עכברים / קבוצה, והנתונים מיוצגים היסטוגרמות כאמצעי ± SEM *, p <0.05; **, p = 0.0033, מבחן T- של הסטודנטים מזווג השוואת PBS- ועכברים C1498-מוזרק אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

סוג התא	ממברנה או מולקולות תאיות
מבשרים ותאים למבוגרים
תאי NK	NK1.1 +, פאן-NK +
תאי NKT	NK1.1 +, פאן-NK +, TCR Vbeta + (8.2), CD3 +
לימפוציטים מסוג T	TCR Vbeta +, CD3 +, CD4 +, CD8 +
מבשרי תאי B ו- B לימפוציטים	B220 +, CD19 +, CD21 / 35 +
מבשרי גרנולוציטים granulocytic	Ly6G +, Mac-1 +, CD11b +
מבשרי monocytic ומונוציטים / מקרופאגים	CD11b +, Mac-1 +, Mac-3 +, CD21 / 35 +, CD115 +, Ly6Chi
אבות
אבות multipotent	CD117 + Sca-1+ CD34 + (Lin- CD150-)
אבות multipotent-דרוך הלימפה	CD117hi SCA-1hi CD127 + (Lin-)
אבות הלימפה משותפים	CD117lo SCA-1lo CD127 + (Lin-)
אבות מיאלואידית משותפים	CD16 / 32lo CD117 + CD34int (Lin- SCA-1-)
אבות גרנולוציט-מקרופאג	CD16 / 32hi CD117 + CD34hi (Lin- SCA-1-)
אבות megakaryocyte-erythroid	CD16 / 32lo CD117 + CD34lo (Lin- SCA-1-)
תאי גזע hematopoietic	CD117 + SCA-1 + CD150 + (Lin- CD34-)

טבלה 1. סמנים של שושלות תאים Hematopoietic והבחנה.
CD: מקבץ של בידול; לין: סמנים של תאים בוגרים; והנה:ביטוי נמוך; היי: ביטוי גבוה; int: ביטוי הביניים; NK: תאי הרג טבעיים; TCR: קולטן T-cell.

דיון

במחקרים קודמים, הקו הסלולרי C1498 תואר inducer של granulocytic החריפה ^5, myelomonocytic ⁶ או לוקמיה של תאי NKT ^7. עם זאת, נתונים הפגנתיים בספרות היו נעדרים או חלקיים. הפרוטוקול המובא כאן משתמש בטכניקות שונות, כגון cytometry זרימה, immunofluorescence, מכתים MGG מבחני cytochemical, לאפיין תאי C1498 תרבותיים ולקבוע את האופי לוקמיה מושרה בעכברים אחרי שהם מוזרקים.

כשאנחנו phenotyped בתאים C1498 מתורבת במבחנה לאחר immunostaining ותזרים cytometry ניתוחים בוצעו, אנו מקיימים כמה מגבלות, מאחר תאים אלה הביעו כמה סמנים hematopoietic תא השטח כי תוארו בעבר בספרות ^6,7. בהסכם עם התוצאות שלנו, Labelle et al. לא שומר את הביטוי על פני קרום התא של TCR בוגר על תאי C1498 באמצעות זרימת cytometמכתים ר"י. עם זאת, הם ראו בהם להיות קו התא NKT אחרי שהם מזוהים CD3ε ו TCRVβ8.2 mRNAs ^7. גם ראינו את הביטוי התאי של שרשרות TCRVβ ומולקולות CD3ε במרבית התאים (> 70%), אבל שושלות hematopoietic שלהם לא ניתן לקבוע כי לא היה גם ביטוי תאי קשור של מולקולת Mac-3.

מכתים והערכות Myeloperoxidase, MGG לנתח esterases תפקודית באמצעות cytochemistry הוכיחו כי הקו הסלולרי C1498 היה ממוצא מיאלואידית והורכב של monoblasts ו myeloblasts. תוצאות אלו היו שתואמים את אחוז Mac-3 ⁺ התאים התקבלו ניתוח תזרים cytometry מכתים. אמנם לא כמותיים, צעדים אלה מייצגים ניסויי מפתח להתבצע. ואכן, הם נשארים, עד כה, השיטות קיימות הטובות ביותר לאפיון במת שושלת התמיינות של תאי hematopoietic מבטאים לא או f סמנים פנוטיפי ספציפיים EW.

Cytometry זרימה מכתים היה מועיל עבור הוכחת התפתחות לוקמיה חריפה בעכברים congenic לאחר C1498 התאים היו מוזרק לווריד. CD45.2 ⁺ C1498 התאים שחדרו לתוך הדם ההיקפי ואיברים שונים היו מבודדים, והתדרים שלהם נקבעו. כימות בוצעו גם לנתח מדולרי טמון ותאי טחול לאחר immunophenotyping. מגבלות נתקלו כאשר פנוטיפ התא C1498 נבדק באיברים כפי שהם הביעו כמה סמנים hematopoietic (רק מעטים מהם היו ⁺ B220). כדי להגדיר את אופיו של לוקמיה חריפה ציין, מכתים מאי-גרונוולד Giemsa וניתוח של פעילות monocytic ו esterases granulocytic בוצעו באמצעות מח עצם. התוצאות הראו כי C1498 תאים נשמרו מורפולוגיה מוח העצם ואת monoblastic שלהם ותפקוד, חושפים את התחלתה של לוקמיה myelomonocytic.

s = "jove_content"> בתמורת השלבים הקריטיים המתואר בפרוטוקול זה, יש לתת תשומת לב מיוחדת pH בעת ביצוע תגובות cytochemical והכתים MGG בגלל שגיאות ב- pH יכולות להוביל לפרשנויות שגויות של תוצאות. למשל, פעילות אסטראז בוטיראט α-naphthyl היא ספציפית לתאי monocytic רק ב- pH של 6.0 בגלל גרנולוציטים ו לימפוציטים יכולים להכתים גם חיוביים לבדיקה זו בערכי pH גבוהים יותר. Fixating התאים אינו מומלץ לפני ביצוע מכתים MGG, והראינו כי קיבעון CAF רק בתנאי תוצאות משביעות רצון בעת ​​ביצוע esterases התגובות cytochemical באמצעות C1498 תאים. כדי לשמר את הביטוי של מולקולת CD115 וזיהוי על ידי cytometry זרימה, כל הדגימות (למשל, דם, מח עצם, תאי טחול) יש לשמור על הקרח במהלך ההליך. אם לא מכתים הוא ציין זרימת cytometry או / וניסויים immunofluorescence, ההתייחסות של נוגדנים, מחדש האחסון שלהםלשבח הדילולים שלהם צריכים להיבדק. ההתייחסויות המפורטות בטבלת חומרים / ציוד נבחרו עבור יישומי cytometry זרימה או immunofluorescence. בפריימריס / נוגדנים משני או fluorophores מצומדות שלהם עלולים לאבד את פעילותם בשל אחסון לא הולם (למשל, חשיפה לאור או חום), דילול פסול, הקפאה / פשרה נרחבת או שימוש מאגרים מזוהמים. הפעל בקרות חיוביות כדי לוודא שהם פועלים כראוי. השתמש במח עצם עכבר או נגזרות תאי טחול שידועים כי הם מבטאים את החלבונים של עניין. כדי למנוע רקע גבוה מכתים הלא ספציפי, לוודא כי התאים נשטפים כראוי והמשיכו ב לחות גבוהה (עבור immunofluorescence) וכי הנוגדנים הם בדילול כפי שהורה. השתמש באותו הריכוז ודילול עבור נוגדן אלוטיפ ואת הנוגדן הראשוני כדי לקבוע את רמת הרקע במדויק במדגם. בניסויים אסטראז cytochemistry, אתריאגנטים יכול להיבדק באמצעות שקופיות בקרה חיוביות ושליליות המכילות granulocytic טחול עכבר מטוהר (Ly6G ⁺⁾ ו monocytic (CD115 ⁺⁾ תאים.

ההליך המתואר במחקר זה הראה כי חלק ניכר מן תכונות leukemic נצפו בעכברים לאחר ההזרקה של תאי C1498 משותף היכר משותף עם לוקמיה החריפה myelomonocytic אדם ^11,12. תאי leukemic פלשו הביאו לירידה של (אבות ומבשרים) בוגרת בשלה תאי hematopoietic מדולרי. תאי C1498 נוכחים בתדר גבוה (> 20%) בדם ההיקפי, כמו גם תאי monocytic. Hepatomegaly ו splenomegaly נצפו לנבוע חדירת תאים leukemic, ולשיפור משמעותי לימפוציטים מסוג B ותאי מיאלואידית נצפו גם ללוות splenomegaly. Thrombopenia נצפתה גם כאשר מספרים טסיות דם נאמדו באמצעות נתח המטולוגיה.

זו הייתה הצגהn, באמצעות בניסויים במבחנה, כי C1498 תאים לעכב hematopoiesis בעכברים נורמליים ידי הפרשת גורמים מסיסים ^13. בכמה מודלי עכבר גידול, תאי מיאלואידית מפותחים (כולל monocytic ותאי granulocytic) יש גם הוכחו להגר ממח העצם אל הטחול, שם הם לעכב הפעלת תא T ספציפית אנטי סרטנית ושגשוגם ^14. לפיכך, הפחתת תאים hematopoietic כי נצפתה במח העצם יכולה להסתיים משני מחסור hematopoiesis ו / או הגירתם. מנגנון אחרון זה יכול להסביר את נוכחותם של monocytosis בדם ההיקפי או התצפית של שברי מיאלואידית מוגדלים בטחול. זה גם מתקבל על דעת כי התאים האלה יכולים כבר נגזרו hematopoiesis טחול המשופר. ואכן, בתנאים יציבים, כמה תת קבוצות של תאי B טחול זוהו סימנים מקדימים של הבוגרת B לימפוציטים ^15. יתר על כן, בתנאים דלקתיים, medגזע ואת אבות ullary תאים הוכחו לעבור הטחול כדי לגרום לייצור מונוציטים בוגר ^16. פרוטוקול זה אינו מאפשר לנו להסיק מסקנות לגבי המנגנונים מעורבים בהתפתחות של לוקמיה, ונוספים פונקציונליים כמו גם צריכים להיות מועסקים מבחנים מולקולריים לעשות זאת. עם זאת, נתונים אלה כוללים מידע מפורט על המאפיינים הקליניים של לוקמיה myelomonocytic האקוטית יסייעו לחוקרים להעריך ולהבין את ההשפעות של תרופות חדשות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
קו תאים C1498	ATCC	TIB 49
C57BL / 6J-Ly5.1	צ'ארלס ריבר	B6.SJL-Ptprc a Pep3 b / BoyCrl
ריאגנטים לתרבית תאים< / חזק>
2-מרקפטואתנול, Gibco	ThermoFisher Scientific	21985
סרום בקר עוברי (FBS)	ThermoFisher Scientific	10270
HEPES, Gibco (1 מ')	ThermoFisher Scientific	15630
תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות, Gibco	ThermoFisher Scientific	11140
פניצילין-סטרפטומיצין, גיבקו	ThermoFisher Scientific	15140
RPMI 1640 בינוני (Gibco, תוסף GlutaMAX)	ThermoFisher Scientific	61870
נתרן פירובט, גיבקו (100 מ"מ)	ThermoFisher Scientific	11360
<ריאגנטים לצביעה ציטומטרית זרימה>
אנטי-עכבר B220 APC (1)	ebiosciences	17-0452	שיבוט RA3-6B2, דילול סופי 1/100
נגד עכבר B220 ביוטין (2)	ebiosciences	13-0452	שיבוט RA3-6B2, 1/400
נגד עכבר CD3 eFluor450 (1)	ebiosciences	48-0032	שיבוט 17A2, 1/100
נגד עכבר CD3 PE (2)	BD biosciences	555275	שיבוט 17A2, 1/100
נגד עכבר CD3 PE-Cy5 (3)	ebiosciences	15-0031	שיבוט 145-2C11, 1/100
נגד עכבר CD4 APC (1)	ebiosciences	17-0041	שיבוט GK1.5, 1/500
נגד עכבר CD4 PE (2)	ebiosciences	12-0041	שיבוט GK1.5, 1/200
נגד עכבר CD8 ביוטין (1)	ebiosciences	13-0081	שיבוט 53-6.7, 1/100
נגד עכבר CD8 eFluor450 (2)	ebiosciences	48-0081	שיבוט 53-6.7, 1/500
נגד עכבר CD11a ביוטין	eBiosciences	13-0111	שיבוט M17/4, 1/100
נגד עכבר CD11b PE	ebiosciences	12-0112	שיבוט M1/70, 1/200
נגד עכבר CD16/32 ביוטין	ebiosciences	13-0161	שיבוט 93, 1/400
מטוהר נגד עכבר CD16/32 (חסימת FCR)	BD biosciences	553141	שיבוט 2.4G2
נגד עכבר CD18 ביוטין (1)	ebiosciences	13-0181	שיבוט M18/2, 1/100
נגד עכבר CD18 FITC (2)	ebiosciences	11-0181	שיבוט M18/2, 1/50
נגד עכבר CD19 PE	ebiosciences	12-0193	שיבוט 1D3, 1/200
נגד עכבר CD21/35 PE	ebiosciences	12-0211	שיבוט 8D9, 1/50
נגד עכבר CD31 PE	ebiosciences	12-0311	שיבוט 390, 1/100
נגד עכבר CD34 eFluor660	ebiosciences	50-0341	שיבוט RAM34, 1/20
נגד עכבר CD44 PE	BD biosciences	553134	שיבוט IM7, 1/50
נגד עכבר CD45.2 FITC	eBiosciences	11-0454	שיבוט 104, 1/100
נגד עכבר CD49b/Pan NK PE	BD biosciences	553858	שיבוט DX5, 1/50
נגד עכבר CD80 ביוטין	ebiosciences	13-0801	שיבוט 16-10A1, 1/200
נגד עכבר CD86 ביוטין	ebiosciences	13-0862	שיבוט GL1, 1/200
נגד עכבר CD107b (Mac-3) PE	ebiosciences	12-5989	שיבוט M3/84, 1/40
נגד עכבר CD115 PE	ebiosciences	12-1152	שיבוט AFS98, 1/100
נגד עכבר CD117 eFluor450	ebiosciences	48-1171	שיבוט 2B8, 1/100
נגד עכבר CD127 PE	ebiosciences	12-1271	שיבוט A7R34, 1/100
נגד עכבר CD150 APC	ebiosciences	17-1501	שיבוט 9D1, 1/20
נגד עכבר CD274 (PD-L1) ביוטין	ebiosciences	13-5982	שיבוט MIH5, 1/200
נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1) PE	ebiosciences	12-5981	שיבוט D7, 1/100
נגד עכבר Ly-6C APC	ebiosciences	17-5932	שיבוט HK1.4, 1/200
נגד עכבר Ly-6G  (Gr-1) ביוטין (1)	ebiosciences	13-5931	שיבוט RB6-8C5, 1/400
נגד עכבר Ly-6G FITC (2)	ebiosciences	11-9668	שיבוט 1A8, 1/50
אנטי עכבר MHC Class I (H-2Db) ביוטין	ebiosciences	13-5999	שיבוט 28-14-8, 1/50
נגד עכבר MHC Class II (I-A/I-E) PE-Cy5	ebiosciences	15-5321	שיבוט M5/114.15.2, 1/1000
נגד עכבר NK1.1 PE	BD biosciences	557391	שיבוט PK136, 1/50
נגד עכבר TCRVb FITC	BD biosciences	553170	שיבוט H57-597, 1/50
סטרפטווידין PE-Cy5	ebiosciences	15-4317	1/200
			לצביעה אימונופלואורסצנטית
מיאלופרוקסידאז נגד עכבר (נוגדן שרשרת כבדה)	סנטה קרוז ביוטכנולוגיה	sc-16129	1/10 (20 ומיקרו; גרם/מ"ל)
IgG נגד עזים (נוגדן מצומד טקסס אדום)	Jackson Immunoresearch	705-076-147	1/250
סרום חמור רגיל	Jackson Immunoresearch	017-000-001
תמיסת Hoechst	BD Biosciences	561908	1/1000
מדיום הרכבה 1 (Fluoromount)	סיגמא-אולדריץ'	F4680
אצטון	VWR	20066
מתנול	Merck Millipore	106009
<חזק>אסטראז ריאגנטים לצביעה ציטוכימית
נפטול AS-D תמיסת כלורואצטט	סיגמא-אולדריץ'	911
תמיסת צבע (תמיסת בסיס LB סגול אדום מהיר)	סיגמא-אולדריץ'	912
pH6.3 (TRIZMAL)	סיגמא-אולדריץ'	913
תמיסת נתרן ניטריט	סיגמא-אולדריץ'	914
תמיסת ציטראט	סיגמא-אולדריץ'	915
תמיסת המטוקסילין	סיגמא-אולדריץ'	GHS3
אצטון	VWR	20066
תמיסת פורמלדהיד, 37%	סיגמא-אולדריץ'	F1635
&אלפא;-תמיסת נפתיל בוטיראט	סיגמא-אולדריץ'	1801
תמיסת חיץ פוספט	סיגמא-אולדריץ'	1805
טבלית נתרן ניטריט	סיגמא-אולדריץ'	1809
תמיסת פרוסאנילין	סיגמא-אולדריץ'	1804
תמיסה כחולה מתילן	Sigma-Aldrich	1808	1/10
הרכבה בינונית 2 (Clearmount)	Invitrogen	00-8010
<חזק>May-Grü ריאגנטים לצביעה של nwald Giemsa
May-Grü פתרון	nwald RAL Diagnostics	320070
פתרון Giemsa R	RAL דיאגנוסטיקה	320310	תמיסת חיץ 1/20
pH 6.8	RAL Diagnostics	330368
<חזק>חומרים אחרים, ריאגנטים וציוד
קטמין 1000 (100 מ"ג/מ"ל)	VIRBAC	3597132111010
קסילזין סדקסילן (20 מ"ג/מ"ל)
Bovin (BSA)	ThermoFisher Scientific	BP671
תמיסת PBS (תרכיז 1x)ThermoFisher	Scientific	14190
פרפורמלדהיד (PFA)	סיגמא-אולדריץ'	158127
סאפונין	Sigma-Aldrich	47036
תמיסת EDTA טהורה במיוחד 0.5 מ', pH 8.0	ThermoFisher Scientific	15575
תמיסת הפרדה (עכבר פנקול)	PANBIOTECH	P04-64100
מאגר ליזה (מאגר ליזה של תאי דם אדומים) (10x)	BD Biosciences	555899	1/10
NaOH 10 N	ThermoFisher Scientific	SS267
תמיסה כחולה טריפאן (0.4%)	ThermoFisher Scientific	15250-061	1/2
שפופרת 50 מ"ל (פלקון)	פישר סיינטיפיק	14-432-22
70 ומיקרו; מסננת תאים m (פלקון)	קורנינג מדעי החיים	352350
קאמרית & כרטיס סינון (EZ Cytofunnel Shandon)		Thermo Scientific
, 24 x 24 מ"מ	Knittel Glass	VD1 2424 Y100
שקופיות (Starfrost - קצוות קרקע 90)	Knittel Glass	VS1137# 077FKB
EDTA	Tube Greiner Bio-One
פסטר פיפטה 150 מ"מ (צינור נימי)	Fisherbrand	1154-6963
מחט 26 גרם	Terumo	NN-2613R
מזרק ומחט אינסולין 29 גרם	טרומו	BS05M2913
30 גרם מחט	בקטון & Dickinson	304000
צינורות ציטומטריה זרימה (כחול)	בקמן קולטר	2523749
עט דוחה מים (Dakopen)	Dako	S200230
מספריים סטריליים חדים	Nessi-care	SCI-01
מלקחיים סטריליים	דומיניק דוצ'ר	956506
תא ספירת תאים	תומא VWR	631-0397
צלחות פטרי (פלסטיק פישרברנד)		ThermoFisher Scientific
(1.5 מ"ל)	ThermoFisher Scientific	05-408-129
ריסון גלילי 15 - 30 גרם	Stoelting	51338
שנדון ציטוספין 3 ציטוצנטריפוגה	ThermoFisher Scientific
מזרק 10 מ"ל	Terumo	SS-10L
אתנול	Merck	1.08543
ספוגי גזה סטריליים	URGO	501580