מאמר שיטה

גאפ junctional אינטר תקשורת: ביומרקר פונקציונלית להערכת תופעות לוואי של toxicants ורעלים, ואת היתרונות הבריאותיים של מוצרים טבעיים

DOI:

10.3791/54281

⸱

25 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Department of Pediatrics & Human Development, Institute for Integrative Toxicology, Michigan State University, 2RECETOX — Research Centre for Toxic Compounds in the Environment, Faculty of Science, Masaryk University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר טכניקה העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינת מודד תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער. תקשורת בין תאית גאפ junctional היא תהליך הסלולר עיקרי שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות מתוחזק שיבוש איתות התא הזה יש השפעות בריאותיות שליליות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מתאר העברה לצבוע אזמל-ניאון טעינה (SL-DT) טכניקת מודדת תקשורת בין תאית בערוצי צומת פער, אורכת בין תאית עיקרית שבאמצעותו הומאוסטזיס רקמות נשמר. הפרעה של תקשורת בין תאית junctional הפער (GJIC) על ידי toxicants, רעלים, תרופות, וכו 'נקשר לנזקים בריאותיים רבים. מחל אנושיות גנטיות מבוסס רבות נקשרו מוטציות בגני צומת פער. טכניקת SL-DT היא assay שימושי פשוט עבור ההערכה סימולטני של GJIC ב אוכלוסייה גדולה של תאים. את assay כרוך תאים טרום העמסה עם צבע פלואורסצנטי ידי perturbing בקצרה קרום התא באמצעות להב סקלפל דרך אוכלוסייה של תאים. צבע פלואורסצנטי מותר אז לעבור דרך ערוצי צומת פער עם תאי שכנים במשך זמן מיועד. Assay הוא הסתיים אז על ידי תוספת של פורמלין אל התאים. ההתפשטות של fluoלצבוע rescent דרך אוכלוסייה של תאים נבחן עם מיקרוסקופ epifluorescence ואת התמונות מנותחות עם כל מספר של חבילות תוכנת morphometric זמינות, כוללים חבילות תוכנה חופשיות למצוא באתר הרשות הרבה. Assay זה גם הותאם ללימודי in vivo באמצעות בחתכי רקמה מאיברים שונים מחיות מטופלים. בסך הכל, assay SL-DT יכול לשרת מגוון רחב של במבחנה לצרכימים תרופתיים טוקסיקולוגית, והוא יכול להיות מותאם באופן פוטנציאלי למערכות הגדרת קצב העברת נתונים גבוהות עם הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי להבהיר יותר דגימות בתוך זמן קצר יותר.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המטרה הכללית של שיטה זו היא לספק טכניקה פשוטה, מקיפה וזולה יחסית להעריך את הרעילות הפוטנציאלית של תרכובות. זוהי גישה במבחנה כי ניתן להשתמש שורות תאים מרובות. מעבדות ביולוגיה של התא תקן מצויד מיקרוסקופים epifluorescence יכול לערוך מחקר באמצעות assay.

הידע הבסיסי שלנו של תא פונקציות כבר תלוי מאוד bioassays במבחנה, הפך מרכיב חיוני בהערכות טוקסיקולוגית של תרופות, מזהמים סביבתיים, ומזהמים נולדים מזון. למרבה הצער, אין מערכת מבדק אחת במבחנה שיכולה לעמוד בדרישות מקיפות עבור כל ההערכות טוקסיקולוגית. רבי מבחני חוץ גופיית מתוכננים מותאמים להעריך וכן להעריך נקודות קצה ביוכימיים או מולקולריים ייחודית. אלה די קרובות משולבים תפוקה גבוהה להגדיר לשקף הפרעות שלמסלול הולכת אותות מסוימים, כגון קולטן אסטרוגן איתות 1. אסטרטגיה זו כבר די מוצלחת, אבל מספר הרב של מסלולי העברת אותות מעורבים ביטוי גנים הופך את המשימה של בחירת מסלול איתות ספציפית להעריך מורכב למדי. פרוטוקולים גבוהים דרך-לשים כיום מפותחים והשתמשו למדוד בו זמנית מסלולים רבים איתות, אשר כבר גישה כלשהו כדי להתגבר על כמה מן המגבלות של מבחני יחיד. עם זאת, לא כל מסלולי איתות שולבו בהצלחת גישות מקיפות יותר, פלוס מסלולי איתות חדשים מתגלים כל זמן זה מסבך עוד יותר תהליך הערכה זו. שימוש במספרים נרחבים של גישות במבחנה, גבוהה במיוחד דרך-לשים מערכות עבור ערכות טוקסיקולוגית מקיפות הם גם מאוד יקרות והם לא תורמים ביותר חוקר יחיד הוביל פרויקטים מחקריים.

GJIC הוא תהליך tightly בשליטת משינוי מתח, ריכוז סידן, pH, איזון חיזור, מוסדר על ידי מסלולים ואינטראקציות הולכת אותות תאיים גדולים עם חלבונים בממברנה ואת שלד התא 2,3. לכן, עיכוב של GJIC יכול לשקף סוגים שונים של מתח הסלולר, שיבוש תפקודים תאיים שונים, או הפרעות של מסלולי העברת אותות שונים. גישה נוספת כדי להתגבר על שימוש bioassays הולכת אות המוגבלות היא לנצל את התופעות הביולוגיות כי רבים, אם לא ביותר, מסלולי העברת אותות הם מווסתים עוד יותר על ידי מערכות איתות אינטר שיתופיות בערוצי צומת פער 4-8. בעוד שמערכות איתות אינטר תוכלנה למצוא שפע ותחת שליטת מסלול מרובה, האיתות אינטר בערוצי צומת פער היא בסופו של דבר פונקציה של הערוצים להיות פתח, סגורה חלקי או סגורה לחלוטין. זה מספק נקודת קצה שניתן למדוד בקלות באמצעות שוניםבמערכות מבדק במבחנה 7. בהתחשב בכך נקודת הסט ההומיאוסטטית של רקמות דורשת ערוצים פתוחים, קביעת השפעת התרכובות על תקשורת בין תאית junctional הפער (GJIC) הוא גישה כוללת יותר בקביעת השפעות רעילות פוטנציאליות של תרכובות 4,8. בעיקרו של דבר, תופעה ביולוגית קריטית זה שמשחק תפקיד מרכזי תיאום אירועים הולכים אותות מרובים שליטת ביטוי גנים מאפשרת הערכה רחבה של השפעות רעילות. לפיכך, bioassays כי להעריך GJIC מהווה נקודת התחלה מצוינת להעריך את הפוטנציאל הרעיל של תרכובות.

הטכניקות הנרחבות ביותר בשימוש על מנת להעריך GJIC מבוססות על preloading תאים עם בדיקת ניאון ולאחר מכן ניטור הנדידה לצבוע מהתא או התאים הטעונים לתאים סמוכים. טכניקות לטעון מראש לצבוע כללו microinjection 9, לגרד טעינת 10, ו מתיל אסטרים של חלליות 11 . האיזמל העברת צבען פלורסנט הטעינה (SL-DT) השיטה היא שינוי של עומס לגרד - לצבוע assay העברת שפותחה על ידי El Fouly 10. במקום השריטה פולשני יותר, השיטה טעינת אזמל דוח זה כרוך גליל עדין של אזמל עם להב עגול דרך בשכבה של תאים למזער נזק פולשנית (איור 1). היתרונות של שיטה זו הם הערכה טוקסיקולוגית של אוכלוסייה של תאים ולא תאים בודדים של assay microinjection. יתר על כן, את הפשטות של assay זה מאפשר זיהוי מהיר של הצלחות מרובות תוך זמן קצר ואילו שיטות שימוש בטכניקות microinjection וטכניקות המשתמשות אסטרים מתיל של בדיקות ניאון באופן משמעותי יותר זמן רב ודורשים משמעותי ברמת מיומנות גבוהה יותר.

למרות שאין שיטה אחת כדי לענות על כל הצרכים של לומדי GJIC; את assay SL-DT הוא assay פשוט, זול למדי תכליתי שיכוללפגוש רב של צרכי הערכות ראשוניות של רעילות של תרכובות שונות. יתרונות עיקריים כוללים: פשטות, אין צורך מיוחד עבור ציוד או מיומנויות שנדרשים שיטות אחרות כגון microinjection, שחזור פלורסנט לאחר photobleaching (FRAP) assay והפעלה מקומית של מבחני בדיקת ניאון מולקולריים, הערכה מהירה סימולטני של GJIC ב גדול מספר התאים, תורמת הגדרת קצב העברת נתונים גבוהות עם הדמיה וניתוח מיקרוסקופ פלואורסצנטי האוטומטי, כמו גם ההסתגלות שלה ללימודי in vivo.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול עבור מחקר זה אושר על ידי טיפול בבעלי חיים ועדת ניצול של המכונים הלאומיים לבריאות למדעים של יפן, אשר שם את vivo בניסויים שנעשו, כדי להבטיח כי החולדות היו ליחס אנושי באשר להקלה של סבל.

1. SL-DT המבדק

  1. זרע 3 x 10 5 WB-F344 עכברוש כבד ותאי אפיתל על 35 מ"מ קוטר צלחות תרבות המכילות נשרים שונים בינוני פלוס 5% עוברי שור סרום, ותרבות התאים באינקובטור ב 37 ºC, 100% לחות יחסית (RH), 5% CO 2.
  2. התאים והתרבות עד שהם מגיעים 100 מפגש% (בדרך כלל, 2 ימים) ולנהל את הטיפול הניסיוני הרצוי של תאים כמתואר להלן.
    1. ניסויי מנת תגובה
      1. הוסף 10 μl ו 20 μl של פתרון המניות 2 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% ו -4 μl, 6 μl, ו -8 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל כרך נוסף של פתרון המניות.
      2. הוסף 4 μl, 6 μl, 8 μl, 10 μl, ו -20 μl של פתרון 100% של אצטוניטריל לשלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל כרך נוסף של פתרון אצטוניטריל לשמש שליטה ברכב.
      3. דגירה צלחות במשך 15 דקות ב להגדיר באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 100% לחות יחסית ו 5% CO 2.
      4. עבור לשלב 1.3.
    2. ניסויי תגובת התנהגות זמן
      1. להוסיף 7 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל נקודת זמן (כלומר, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10 דק ').
      2. להוסיף 7 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול עבור כל נקודת זמן לשמש שליטה ברכב.
      3. דגירה צלחות עבור כל p השעה היעודהoint באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 100% לחות יחסית ו 5% CO 2.
      4. עבור לשלב 1.3.
    3. ניסויים Recovery Time
      1. להוסיף 7 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול במשך 15 דקות.
      2. להוסיף 7 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול במשך 15 דקות כדי לשמש שליטה ברכב.
      3. למזוג המדיום המכיל גם את phenanthrene או אצטוניטריל ולשטוף 3x כל אחד עם 3 מ"ל של בופר פוספט (PBS).
      4. הוסף 2 מיליליטר של מדיום גידול טרי על כל צלחת לדגור על זמני התאוששות הרצויים (כלומר, 25, 35, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 240, 360 דק ') באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 100 % RH ו 5% CO 2.
      5. עבור לשלב 1.3.
    4. ניסויי מנגנון ניהול
      1. מוסיפים את מעכבי הולכת אותות, כלומר
      2. הוסף 5 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול במשך 15 דקות כדי לשמש שליטה ברכב.
      3. להוסיף 7 μl של פתרון המניה 20 מ"מ של phenanthrene ב אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת D609 עבור 15 דקות נוספות.
      4. להוסיף 7 μl של אצטוניטריל 100% עד שלוש צלחות של תאים המכיל 2 מ"ל של מדיום הגידול בתוספת אצטוניטריל 100% עבור 15 דקות נוספות כדי לשמש שליטה ברכב.
      5. עבור לשלב 1.3.
  3. מחק את מדיום התרבות או על ידי בעדינות ניגרת המדיום או על ידי יניקת ואקום.
    הערה: השלך בינוני תרבות המכיל פסולת מסוכנת כראוי.
  4. יש לשטוף את התאים שלוש פעמים כל אחד עם 3 מ"ל של PBS ואו למזוג או לשאוב between מי שטיפה.
  5. פיפטה 1 מ"ל של 1 מ"ג / מ"ל ​​מומס לצבוע צהוב לוציפר PBS (LY) לתוך כל צלחת התא.
  6. טען מראש את הצבע לתוך התאים על ידי גלגול להב פלדה כירורגית 20 # עם קצה מעוגל בעדינות דרך אוכלוסיה של תאים בשלושה תחומים שונים של הצלחת.
    1. בגין על ידי הצבת האזמל בניצב (90 ° זווית) ו -5 מ"מ מהקצה של צלחת התרבות, ולאחר מכן לגלגל את האזמל מזווית בניצב זה לכ בזווית של 15 מעלות (ראה איור 1).
      הערה: זו מושגת על ידי צובט את האזמל בין אצבע המורה לאגודל. השתמש הכבידה כדי לאפשר את האזמל ללכת בעדינות מן 90 ° עד 15 ° המיקום (כלהב מעוגל פשוט מתהפך התאים). תנועה זה תשאיר קו כניסה בולט ויזואלית.
  7. דגירה התאים עם הפתרון LY עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  8. למזוג או לשאוב LY ולשטוף שלוש פעמים עם 3 מ"ל של PBS להסיר כל extracellular לצבוע לחסל קרינת רקע תאית.
  9. הוסף 0.5 מ"ל של תמיסת פורמלין שנאגרו פוספט 10% כדי לתקן את התאים.
    הערה: לאחר תיקון בפורמלין, אוויר יבש התאים ולאחסן בחושך במשך עד שנתיים עם photobleaching מינימלית של צבע LY. כאשר נדרש, רעננותם עם פתרון פורמלין 10% כדי להמחיש את חזית צבע פלואורסצנטי.
  10. הצגת תאים קבוע באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence מצויד קוביית dichroic עבור פסגות עירור / פליטה של ​​428/536 ננומטר בהגדלה של 200X. יישר כל הלוחות כך שהקו הזחה מקביל לשדה האופקי של חזון.
    הערה: קוביית dichroic FITC עובד היטב.
    1. ללכוד את התמונה עם מצלמת CCD ותוכנות תומכות.
      1. פתח את התוכנה התומכת עבור מצלמת CCD ו להשתמש בהגדרות חשיפה אוטומטית. השתמש בלחצן "ללכוד" לרכוש את התמונה באופן דיגיטלי. שמור את התמונה כפי .tif קבצים באמצעות כפתור "שמור".

הסתגלות 2. Assay SL-DT כדי רקמת הכבד

  1. הסר כ פרוס סנטימטר 2 x 2 מהאונה השמאלית של כבד מפני מספריים לנתיחת 5 בן שבוע, זכר פישר 344 עכברוש באמצעות ומניח אותו על פלסטיק לשקול מכוסה צלחת עם גזה רטובה 12.
  2. פיפטה 0.5 מ"ל של פתרון PBS המכיל 1 מ"ג / מ"ל ​​כל אחד צהוב rhodamine-dextran לוציפר (RD) על פני השטח של הפרוסה בכבד פלסטיק לשקול צלחת.
    הערה: RD הוא צבע כי לא יכול לעבור ערוצי צומת פער ויסמן התאים הועמסו.
  3. לעשות שלושה עד חמישה חתכים כ 1 סנטימטר על פני השטח של הפרוסה הכבדה שיש לו את הפתרון לצבוע בצלחת לשקול עם להב חד ולאחר מכן להוסיף צבע נוסף מספיק כדי למלא את החתכים.
  4. דגירה הרקמה למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר על פלסטיק לשקול צלחת.
  5. לשטוף שלוש פעמים עם 5 מ"ל של PBS.
  6. תקן את אובת הרקמותrnight ב 30 מ"ל של פורמלין שנאגרו פוספט 10% בתוך שפופרת צנטריפוגות חרוטי 50 מ"ל בחושך בטמפרטורת החדר.
  7. למחרת, לשטוף את פרוסות עם מים, לקצץ רקמות סביב החתך עם מספריים לנתח לתוך 1 x 1 x 0.5 ס"מ 3 רצועות ואז להשתמש בטכניקות מקובלות להטביע את הפרוסות 13 פרפין.
  8. סעיף הפרוס בניצב לקו החתך לעובי של 5 מיקרומטר ולאחסן את הדגימות בחושך עד מוכן להיות צלמו באמצעות טכניקות חתך רגילות עם 13 microtome.
  9. שימוש במיקרוסקופ epifluorescence מצויד במצלמה דיגיטלית CCD כדי לחזות ללכוד את התמונות של חזיתות צבע פלואורסצנטי לפי סעיף 1.10 7.

3. כימות GJIC

  1. מדוד את התפשטות צבע פלואורסצנטי באמצעות חבילת תוכנה morphometric (למשל, ImageJ).
    1. לחץ על הכרטיסייה "קובץ" ולאחר מכן לחץ "פתח" כדי לפתוח אתתמונה שמורה.
    2. הקישו על "כלי יד חינם" בלשונית כלי בר להתחקות אחר קווי המתאר של החלק הקדמי לצבוע.
    3. לחץ על הכרטיסייה "לנתח" ולאחר מכן לחץ על "מדוד".
      הערה: זה יפיק ערך שטח בגיליון אלקטרוני, אשר ניתן להעתיק לתוך תוכניות בגיליון אלקטרוני אחרות, לפי צורך.
  2. באמצעות תוכנת גיליונות אלקטרוניים, לחשב את החלק היחסי של הביקורת (FOC) על ידי חלוקת השטח של התפשטות צבע בצלחת ניסיוני ע"י השטח לצבוע נסע בצלחת שליטה באמצעות המשוואה הבאה:
    figure-protocol-1
    הודעת דואר = שטח של ההתפשטות לצבוע בתאים שנחשפו משתנים ניסוי, כגון תאים שטופלו כימיקל במינון מסוים או זמן
    אזור c = של התפשטות לצבוע בבקרה, אשר הם תאים שטופלו רכב המשמש לפירוק כימי של עניין
    הערה: כדי לקבוע את ההשפעה של הרכב,הודעת דואר יהיה באזור של ההתפשטות לצבוע בתאים שטופלו על ידי הרכב ו- C יהיה באזור של ההתפשטות לצבוע בתאים שלא טופלו על ידי הרכב. ההשפעה של הרכב רצוי להיות פחות מ -10%.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרעה של GJIC כבר נעשה שימוש נרחב כמו סמן ביולוגי לזיהוי תרכובות רעילות ברמה nongenotoxic, אפיגנטיים שליטה הגן שגורם להשפעות בריאותיות שליליות 14. לדוגמה, פחמימנים ארומטיים פוליציקליים (PAHs) הם מזהמים נפוצים של הסביבה אבל להשתנות רעילות אפיגנטיים שלהם כפונקציה של מבנים מולקולריים שלהם 15. PAHs המשקל מולקולרי הנמוך נמצא בדרך כלל בריכוזים גבוהים יחסית PAHs המשקל המולקולרי הגבוה בסביבות מגוונות רבות כגון משקעי נהר מזוהמים לזה של...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

את assay SL-DT הוא טכניקה פשוטה תכליתית במדידת GJIC, אבל יש כמה חששות קריטיים כי יש היוו בעיצוב פרוטוקולי ניסוי מתאימים. עבור מדידות חזקות של GJIC באמצעות assay SL-DT שחייבת להיות התפשטות צבע טובה של LY דרך צומת פער של התאים. לכל הפחות, זמן נאות יש לבחור כדי להבטיח כי הצבע מתפשט דרך שמונה או יותר שורות של תאי מתאי טעון האזמל בשני הכיוונים. כמו כן, עבור וקלות המדידה של המרחק כי לצבוע הגר מתאי טעון האזמל, בחר גורם הגדלה זה מבטיח את התפשטות הצבע של צלחות המלאות ממלאת 70 עד 90% של שדה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נתמך על ידי מענקי NIEHS #R01 ES013268-01A2, והתוכן הוא באחריות המחבר בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של ה-NIEHS, ונתמך על ידי פרויקט CETOCOEN UPgrade מס'. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי אפיתל כבד של חולדות WB-F344מאת ד"ר ג'יי וו גרישם ו- M. S. Tsao מאוניברסיטת צפון קרוליינה (צ'אפל היל, קרוליינה הצפונית)אף אחד לאסופק על ידי ד"ר ג'יי וו גרישם ו- M. S. Tsao אוניברסיטת צפון קרוליינה-צ'אפל היל-NC
35 מ"מ לוחות תרביתקורנינג430165
25 ס"מ 2 צלוחיות תרביתקורנינג430639
75 ס"מ2 צלוחיות תרביתקורנינג430641
D-medium, מדיום שונה של Eagles תרמו-פישר/גיבקו נוסחה מס' 78-5470EF
סרום בקר עובריThermoFisher/GIBCO 10437
0.25% טריפסין-EDTA תרמו-פישר/גיבקו 15050
תמיסת מלח חוצצת פוספטתוצרת ביתראה להלן למרכיב cat#137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na2PO4, 2 mM KH2PO4
>KClJT Baker - Mallinckrodt 3040-01
NaClJT בייקר - Mallinckrodt 3624-05
Na2HPO4JT Baker - Mallinckrodt 3819--01
KH2PO4JT Baker - Mallinckrodt 3246-01
לוציפר צהוב CH, מלח ליתיוםסיגמא-אולדריץ' כימיL0259
רודמין-דקסטרןסיגמא-אולדריץ' כימיקלR9379
1-מתילאנתרסןסיגמא-אולדריץ' כימיקל
פננתרןסיגמא-אולדריץ' כימיקלP11409
רזברטרולסיגמא-אולדריץ' כימיקלR5010
D609טוקריס ביו-סיינס 1437
אצטוניטרילEMDAX0145-1
תמיסה 37% פורמלדהידJT Baker - Mallinckrodt 2106-01
#20 להב כירורגיFine Science Tools Inc. 10317-14
50 מ"ל צינורות סטריליים חרוטייםתרמו מדעי 
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי של ניקון Nikon -Mager ScientificEclipse TE300
Nikon FITC קובייה דיכרואיתNikon -Mager Scientific96107
CCD מצלמהNikon -Mager ScientificNikon Cool Snap EZ מערכת
Nikon -Mager ScientificNikon NIS-Elements F2.2 מערכת הדמיה.
תמונהJהמכון הלאומי לבריאותhttp://imagej.nih.gov/ij/
339652 הדמיה CCD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
  2. Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130(2013).
  3. Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
  4. Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454(2015).
  5. Trosko, J. E., Chang, C. C. Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. Travis, C. C. , Plenum Press. New York. 165-179 (1989).
  6. Trosko, J. E. Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. , John Henry Press. Washington D.C. 264-274 (1995).
  7. Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
  8. Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
  9. Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
  10. El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
  11. Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
  12. Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
  13. Paraffin Processing of Tissue. Protoplasma. , http://protocolsonline.com/histology/sample-preparation/paraffin-processing-of-tissue (2012).
  14. Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
  15. Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
  16. Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
  17. Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
  18. Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
  19. Trosko, J. E., Tai, M. H. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. , Karger. Basel. 45-65 (2006).
  20. Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
  21. JE, T. rosko Stem Cells and Cancer. Dittmar, T., Zaenkar, K. , Nova Publishers. New York. 147-188 (2008).
  22. Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150(2014).
  23. Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
  24. Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
  25. Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
  26. Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
  27. Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Lucifer Yellowin vitro

מאמרים קשורים