מאמר שיטה

הקרנת תפוקה גבוהה של אנזימים פחמימות-משפיל שימוש רומן מסיסים chromogenic המצע Assay ערכות

DOI:

10.3791/54286

⸱

20 בספטמבר 2016

 ,  , 
1Department for Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen, 2School of Agriculture, Food and Rural Development, Newcastle University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר מבחן תפוקה גבוהה לבדיקת אנזימים. ערכת בדיקה מוכנה לשימוש מרובה זו מורכבת ממצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) שנבחרו מראש ומצעי Chromogenic B iomass (ICB) מורכביםI בלתי מסיסים. אנזימי המטרה הם אנדו-אנזימים ופרוטאזות מפרקים רב-סוכרים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) ממלאים תפקידים מרובים in vivo ונמצאים בשימוש נרחב לעיבוד תעשייתי בתעשיות הדלק הביולוגי, הטקסטיל, חומרי הניקוי, הנייר והמזון. הבנה מעמיקה יותר של CAZymes חשובה הן מנקודת מבט ביולוגיה בסיסית והן מנקודת מבט תעשייתית. מספר עצום של CAZymes קיימים בטבע (במיוחד במיקרואורגניזמים) ומאות אלפים קוטלגו ותוארו ב-carbohydrate, מסדנתונים ctive enzyme (CAZy). עם זאת, קצב הגילוי של אנזימים משוערים עלה על יכולתנו לאפיין ביוכימית את פעילותם. אחת הסיבות לכך היא שההתקדמות בריצוף הגנום והטרנסקריפטום, יחד עם כלים ביואינפורמטיים נלווים, מאפשרים זיהוי מהיר של CAZymes מועמדים, אך הטכנולוגיה לקביעת המאפיינים הביוכימיים של האנזים התקדמה לאט יותר. כדי להתמודד עם פער טכנולוגי זה, מתוארת כאן ערכת בדיקה חדשה בעלת תפוקה גבוהה המבוססת על מצעים כרומוגניים בלתי מסיסים. יוצרו שני סוגי סובסטרטים נפרדים: מצעי Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) (עשויים מפוליסכרידים וחלבונים מטוהרים) ומצעי B hromogenic(ICB) C מסיסים (עשויים מחומרי ביומסה מורכבים). גם מצעי CPH וגם ICB מסופקים במערכת בדיקה בעלת תפוקה גבוהה של 96 בארות. ניתן לייצר את מצעי ה-CPH בארבעה צבעים שונים, מה שמאפשר לערבב אותם יחד ובכך להגדיל את תפוקת הבדיקה. הפרוטוקול מתאר בדיקת צלחת של 96 בארות וממחיש כיצד ניתן להשתמש בבדיקה זו לסינון פעילותם של אנזימים, קוקטיילים אנזימיים ומרקים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

טכניקות לכריית גנומים ומטאגנומים התפתחו במהירות בשנים האחרונות, וכך גם אסטרטגיות בעלות תפוקה בינונית וגבוהה לשיבוט וביטוי אנזימים רקומביננטיים. יתר על כן, משאבים ביואינפורמטיים ומאגרים נלווים, כגון (CAZy)1,2 התרחבו מאוד. עם זאת, ישנם אתגרים ניכרים הטמונים בניצול מגוון האנזימים המיקרוביאלי למטרות תעשייתיות והקביעה האמפירית של פעילויות האנזימים הפכה כעת לצוואר בקבוק רציני. לדוגמה, ההערכה היא כי באמצעות השיטות הנוכחיות, אנו יכולים לחזות בבטחה את פעילותם של לא יותר מ-4% מהחלבונים במסד הנתונים של CAZy. למרות שקיימות שיטות רבות לניטור פעילות האנזים, לכולן יש מגבלות מסוימות. טכניקות מבוססות המבוססות על כרומטוגרפיה בשילוב עם ספקטרומטריית מסה זמינות להערכת השברים האוליגומריים של פעילויות גליקוזיל הידרולאז (GH)3,4. עם זאת, גישות אלו עתירות עבודה ובדרך כלל תפוקה נמוכה. שיטות המבוססות על מדידת הפחתת סוכרים כגון מבחני חומצה דיניטרוסליצילית5 ונלסון-סומוגי6 נמצאות בשימוש נרחב להערכת פעילויות GH. עם זאת, לבדיקות אלו יש תפוקה מוגבלת ויכולות להיות מועדות לתגובות לוואי. מצעי פוליסכריד כרומוגניים בודדים, כגון אזורין צולב (AZCL) נמצאים בשימוש נרחב לקביעת פעילויות האנזים, אך רכישת כל המצעים בנפרד והפצה ידנית של אבקות המצע בתוך לוחית הבדיקה יכולה להיות מסורבלת ויקרה7.

פיתחנו דור חדש של מצעי פולימר הידרוג'ל כרומוגני (CPH) המבוססים על צבעי כלורוטריאזין, שכאשר משתמשים בהם בשילוב עם לוחית סינון של 96 בארות, יוצרים מערכת בדיקה בעלת תפוקה גבוהה. פותחו מצעים נוספים של ביומסה כרומוגנית בלתי מסיסה (ICB) המספקים מידע על זמינות המצע בתערובות פולימרים מורכבות, כגון אלה הקיימות בביומסה ליגנוצלולוזית. ניתן לייצר כל מצע באחד מארבעה צבעים, וניתן לשלב מצעים בצבעים שונים בבאר אחת. בפרוטוקול זה הוכח כי ניתן ליישם מתודולוגיה זו על מגוון רחב של פוליסכרידים וחלבונים ואת הפוטנציאל לסינון GHs, פוליסכריד ליטי מונואוקסיגנאזות (LPMOs) ופרוטאזות. ניתנים פרוטוקולים ספציפיים לשימוש ב-96 לוחות בארות ותוצאות מייצגות ממחישות את היעילות הגבוהה של ערכות המצע CPH ו-ICB ככלים לסינון אנזימים.

יתרון משמעותי אחד של ערכות הבדיקה המתוארות, ללא קשר למצע, הוא שהערכות מוכנות לשימוש תוך 15 דקות, לאחר שלב ההפעלה. זה מבטל את הצורך בהרכבה גוזלת זמן של הבדיקה מחומרי מצע גלם כפי שקורה בכמה שיטות אחרות7. למצעי CPH ו-ICB יש אחסון מצוין (לפחות שנה בטמפרטורת החדר), יציבות pH וטמפרטורה 8 ואינם דורשים ציוד או הכשרה מיוחדים. מבחני CPH או ICB מבוססים על לוחית סינון של 96 בארות שבתוכה מתבצעת התגובה עם האנזים. אם האנזים פעיל עם מצע נתון, נוצרים אוליגומרים צבועים מסיסים, המייצרים סופרנטנט צבעוני שניתן לסנן לאחר מכן לצלחת רגילה של 96 בארות באמצעות סעפת ואקום או צנטריפוגה 8.

הסובסטרטים צבועים בצבעי כלורוטריאזין הנספגים בטווח הספקטרום הנראה (VIS) וניתן לפתור צבעים בודדים (אדום, כחול, צהוב וירוק) באמצעות רגרסיה ליניארית אם מערבבים מצעי CPH שונים בצבעים שונים בבאר אחת, והאנזים פועל על יותר מסובסטרט אחד. ניתן למדוד את הלוח המתקבל עם הסופרנטנטים באמצעות קורא לוחות מיקרוטיטר סטנדרטי המסוגל למדוד ספיגה בתחום ה-VIS. ערבוב מצעים שונים עם צבעים שונים בבאר אחת מגדיל את תפוקת מערכת הבדיקה, לסך של 384 ניסויים בצלחת של 96 בארות (4 מצעים שונים בצבעים שונים לבאר).

מצעי

CPH מספקים כלי רב ערך להערכת הפעילות הספציפית של אנזים בעוד שסובסטרטים ICB משמשים להערכת יכולתו של אנזים לעכל רכיב בהקשר של תערובות סובסטרט מורכבות שאנזימים נתקלים בהן בדרך כלל בתוך ביומסה. למרות שמצעי ICB אינם מספקים מידע על ספציפיות אנזימים בודדים, הם בכל זאת כלים שימושיים להערכת הביצועים המסחריים של אנזימים, קוקטיילים או מרקים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Assay chromogenic עם CPH מצעים בתוך פורמט פלייט 96-היטב

  1. הפעלת הצלחת ערכת assay
    1. הפעל את מסנן 96-היטב (המכיל כחול CPH-xylan) צלחת ערכת assay (רשימת חומרים) על ידי הוספת פתרון הפעלת 200 μl (שהושג עם הערכה) לתוך כל טוב, ואחריו דגירת 10 דקות בטמפרטורת חדר ללא תסיסה.
    2. החל ואקום באמצעות סעפת ואקום (עם בלוק spacer בתוך וכל סטנדרט, צלחת 96-היטב שקופה כמו צלחת אוסף) להסיר פתרון הפעלה קיים. כמו כן ניתן להשתמש צנטריפוגות ב 2,700 XG במשך 10 דקות עבור שלב זה במקום סעפת ואקום.
    3. שטפו את מצעי CPH ידי הוספת מים 100 μl סטרילי ולהחיל ואקום (או כוח צנטריפוגלי) להסיר את מייצב. חזור על פעולה זו עוד פעמיים, והלוחות כעת מוכן לשימוש.
  2. תגובת אנזים
    הערה: תמיד כוללים חיץלבד כביקורת שלילית ואם אנזימים אפשריים מאופיינים בעבר שולט חיובי. השתמש במספר סטטיסטי מתאים של משכפל. מצעי CPH יציבים בין pH 3.0 כדי 10.0 ו הנפח הכולל של פתרון אנזים סוף החיץ היטב כל אחד לא יעלה על 180 μl. תמצית צמח או מרק התרבות יכולה לשמש גם במקום פתרון אנזים מטוהר.
    1. להוסיף 150 μl 100 מ"מ חיץ נתרן אצטט, pH 4.5 ו -5 פתרון -cellulase אנדו μl (לריכוז סופי של 1 U / ml) היטב בכל צלחת ערכת assay.
    2. מכניס את צלחת המוצר (צלחת ברורה היטב תואמת לקורא microtiter הצלחת) מתחת לצלחת ערכת assay לאסוף כל דליפה פוטנציאל מצלחת התגובה במהלך רועד.
    3. דגירה את הצלחת ערכת assay של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בתוך שייקר אופקי ב 150 סל"ד.
      הערה: ערבוב התגובה בצלחת ערכת assay במהלך הדגירה היא קריטית להשגה עקבית reproתוצאת ducible. מצעי CPH יציבים עד 90 מעלות צלזיוס. זמן הדגירה צריך להיות מוגבר עד 24 שעות כאשר בודקים broths התרבות המכיל ריכוז אנזים ידוע עם מצעי CPH. שים לב פעמי דגירה מתאימות תלוי בפעילות של האנזים (ים), אך באופן כללי אם אין פעילות לזיהוי תוך 24 שעות, סביר להניח כי האנזים לא לבזות את המצע נבדק. אנזים פעיל משפיל סוכרי chromogenic המסיסים של מצע CPH לתוך אוליגוסכרידים chromogenic מסיסים, אשר גלויים כמו supernatant בצבע.
    4. מניח את הצלחת המוצר הנקיה בתוך סעפת הוואקום עם בלוק spacer בפנים.
    5. מניחים את הצלחת ערכת assay על גבי ולהחיל ואקום (לחץ שלילי המרבי של -60 kPa). כמו כן ניתן להשתמש צנטריפוגות ב 2,700 XG במשך 10 דקות.
      הערה: התסנין המכיל את אוליגוסכרידים בצבע כמוצר תגובה הוא עכשיו בצלחת המוצר לניתוח נוסף 8 .
  3. איתור וכימות
    1. בדוק כי נפח הנוזל בכל טוב של צלחת המוצר הוא בערך אותו הדבר על ידי בדיקה ויזואלית.
    2. קראו את הספיגה של צלחת האוסף ב 595 ננומטר עבור CPH-xylan הכחול באמצעות קורא צלחת.
    3. כאשר עושים ניתוח נתונים, לחסר למאגר בלבד ערכי ביקורת השליליים מן הערכים המבארים שבו אנזים נוסף. חשב את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של אמצעי (SEM) מבארות לשכפל 8.

2. Assay chromogenic עם מצעים ICB בתוך פורמט 96-היטב

  1. תגובת אנזים
    1. להוסיף למאגר נתרן אצטט 150 μl 100 מ"מ, pH 4.5 ו -5 μl 31 U / ml אנדו -xylanase פתרון היטב בכל צלחת ערכת assay המכיל קש ICB-חיטה אדומה (ריכוז האנזים האחרון הבאר: מ"ל 1 U /) .
      הערה: צלחות ערכת assay (96-גם מסנן plאטס המכיל מצעי ICB) מיוצר כפי שתואר בספרות (ראה רשימה של חומרים). מצעי ICB יציבים מאגרים עם טווח ה- pH בין pH 3.0 כדי 10.0. תמיד כוללים חיץ לבד כביקורת שלילית, אנזימים מסחריים כביקורת חיובית ולהשתמש מספר מתאים סטטיסטי של העתקים.
      1. אין להפעיל את מצעי ICB כמו צלחת מצע CPH, אבל להסיר את המייצב ידי שטיפת שלוש פעמים עם 100 μl מים ואחריו סינון ואקום או צנטריפוגה.
    2. מכניסים את הצלחת המוצר מתחת לצלחת המצע לאסוף כל דליפה פוטנציאל מהצלחת המצע במהלך רועד.
    3. דגירת התגובה על 25 מעלות צלזיוס הרועדת ב 150 סל"ד במשך שעה 2.
      הערה: אנזים פעיל משפיל סוכרי chromogenic המסיסים מצע ICB לתוך אוליגוסכרידים מסיסים, אשר גלויים כמו supernatant בצבע. מצעי ICB יציבים עד 90 מעלות צלזיוס. הדגירה tIME צריכה להיות מוגברת עד 24 שעות אם אנזימים שאינם מטוהרים כגון broths התרבות משמשים.
    4. מניחים את הצלחת המוצר בתוך סעפת ואקום עם בלוק spacer בפנים.
    5. מניחים את הצלחת ערכת assay על גבי ולהחיל ואקום (לחץ שלילי המרבי של -60 kPa) או להשתמש צנטריפוגות כדי תסנין המוצר מהצלחת ערכת assay לתוך הבאר של צלחת המוצר.
      הערה: התסנין המכיל את אוליגוסכרידים בצבע כמוצר תגובה הוא עכשיו בצלחת האוסף לניתוח נוסף 8.
  2. איתור וכימות
    1. בדוק כי נפח הנוזל בכל טוב של צלחת האוסף הוא בערך אותו הדבר על ידי בדיקה ויזואלית.
    2. קראו את הספיגה של צלחת האוסף ב 517 ננומטר עבור קש אדום ICB-חיטה באמצעות קורא צלחת.
    3. כאשר עושה ניתוח נתונים - לחסר למאגר - ערכי שליטה שליליים רק מן הערכים המבארים שבו אנזיםהוסף. חשב את הערך הממוצע ואת סטיית התקן של אמצעי (SEM) מבארות לשכפל 8.
      הערה: במקרה של הקרנת אנזימים ידועים, אנו מציעים לבצע סדרת דילול על מנת לקבל נתונים מפורטים יותר על הטווח הדינמי של פעילות האנזים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההיי-התפוקה וקיבולת ריבוב של assay זה מבוסס על פולימר מסיס chromogenic (או חלבון) הידרוג'ל (CPH) מצעים מסודרים צלחות מסננות 96-היטב. אנזימים וכן שולטת שלילי מתווספים צלחת ערכת assay (איור 1 א) ו אנזימים לבזות את המצע המקביל הפקת supernatant בצבע (איור 1B). לאחר התגובה נגמרה, supernatant מועבר לתוך צלחת מוצר ברור היטב את הספיגה ניתן למדוד ישירות באמצעות ספקטרופוטומטר מתאים צלחות 96-היטב (איור 1 ג).

דוגמא לתגובת מנה של CPH-arabinoxylan כדי xylanase בריכוזים שונים של האנזים (0.00 - 0.75 U / ml) מוצגת באיור 1D שבו ריכוז האנזים היורד ניתן לראות בצורה ויזואלית. קוואנט spectrophotometric מפורט יותרification ניתן להשתמש כדי לתכנן את ספיגת לעומת ריכוז האנזים (איור 1E). עוצמת האות תואמת את פעילות האנזים. השחזור של assay מוצג על ידי מוטות השגיאה (סטיית התקן של ממוצע, SEM, של שלושה העתקים). עוד ניסויים מפורטים על השחזור של assay זה מתפרסמים במקום אחר 8.

figure-results-1
איור 1. טיפול xylanase של CPH-arabinoxylan. א) תוכנית של הצלחת ערכת assay עם המצע CPH (למשל, CPH-arabinoxylan) נטען לתוך בארות צלחת מסנן 96-גם ממש לפני תוספת של אנזימים 1 ו -2 ו למאגר שליטה מהודרת (אנזים 1 היה פעילות -xylanase אנדו); B) ביזוי של CPH-arabinoxylan ידי אנזים 1 פיק supernatant בצבע; C) עם filtrat ואקום בסיועיון של supernatants ב לצלחת המוצר, את ספיגת נמדדת spectrophotometrically; D) צלחת מוצר המכיל את תוצרי התגובה לאחר טיפול של arabinoxylan CPH ב 4 צבעים שונים עם ריכוזים שונים של אנדו -β-1,4-xylanase ב 100 מ"מ חיץ נתרן אצטט, pH 4.5 למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר;. E) כימות של תוצרי התגובה מ D באמצעות spectrophotometry אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ישנן אפשרויות שונות לשימוש assay זה הקרנת אנזים. אפשרות אחת היא להשתמש בצלחת 96-היטב המכילה סוכרים שונים להקרנה, למשל, מספר קטן של (מטוהרים) אנדו -enzymes עם פעילות לא ידועה. במקרה זה התוצאה יראה אשר סוכרים הם degradמסוגלים ידי אנזים היעד. כדי להציג עיקרון זה, -cellulase אנדו נבדק נגד מצעים CPH שונים של 25 מעלות צלזיוס. שלושה ריכוזי אנזים שונים (0.5 U / ml, 1.0 U / ml ו -5 U / ml) הודגרו במשך 30 דקות. התוצאה היא נראית בבירור את צלחת המוצר (איור 2 א). גיליון מוצר אנדו זה -cellulase שמספק לו ההספק מציין פעילות צדדית עבור xyloglucan (תמרהינדי), β-גלוקן שעורה, Glucomannan, xylan Birchwood וצד-פעילות נמוכה עבור galactomannan. בקנה אחד עם זו, פעילות נוספת כדי cellulase נמצאה נגד CPH-β-גלוקן (שעורה), CPH-xyloglucan (תמרהינדי), CPH-xylan (אשור) ופעילות נמוכה נגד-galactomannan CPH (איור 2 ב). Glucomannan לא נבדק. אותו מצעי CPH היו מתעכלים עם אנזימים מסחריים זמינים (בשלושה ריכוזי אנזים שונים: 0.1 U / ml, 0.5 U / ml 1.0 U / ml) לשמש שולטים חיובי באותם תנאים מאשר הקודםלְנַסוֹת. כל המצעים היו מפורקים על ידי אנזים בקרה החיובי ואת עוצמת האות גדלה מתאימה ריכוז אנזים גבוה (איור 2 ג).

figure-results-2
איור 2. שמונה מצעים CPH שונים הודגרו תחת תסיסה של 25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. א) צלחת תוצר של מצעים CPH שונים מתעכל עם אנדו -cellulase, בריכוזים שונים. ב) כימות של פעילות ופעילות לוואי שונות של אנדו -cellulase. הברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של ממוצע של שלושה העתקים C) פעילות של אנזימים מסחריים שונים למצע CPH המתאים (אנדו-cellulase ו -2-HE-תאית;. E-LAMSE ו CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-גלוקן (שעורה); E-XYAN4 ו CPH-xylan, E-XEGP ו CPH-xyloglucan, E-BLAAM ו CPH-amylose, E-BMACJ ו CPH-galactomannan; כל האנזימים מן Megazyme). הברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של הממוצע של שני העתקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ביומסה chromogenic המסיס (ICB) מצעים הם תוספת שימושית לרפרטואר מצע chromogenic כי הם שומרים חלקית ההסדר הטבעי של סוכרים בקירות תא צמח אשר הם המרכיבים העיקריים של ביומסה. מצעים CPH ו ICB משמשים בדוגמה שלנו לנתח את האנזימים המופרשים של chrysosporium Phanerochaete שכאשר מטפחים במדיום נוזלי. התקנת צלחת צלחת ערכת assay מוצגת באיור 3 א, עם 19 CPH מצעים ו -5 מצעי ICB (4 בארות לכל מצע, האיור 3B). פ chrysosporium היה cultivatאד במשך שלושה ימים ולאחר מכן את supernatant נתח התרבות. לכן, 125 μl 200 מ"מ חיץ הועבר כל supernatant תרבות היטב 25 μl הוסיף. שלושה תנאים pH שונים נבדקו באמצעות חיץ נתרן אצטט pH 4.0, חיץ פוספט נתרן pH 6.0 או pH 8.0 (איור 3 ג). צלחת הודגר רועד (150 סל"ד) בשעה 25 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.

מוצרי התגובה הועברו צלחת המוצר (האיור 3D) ונותחו. פ chrysosporium מיוצר אנזימים עבור השפלת גלוקנים שונים, עמילן xylans (איור 3E). אותות התחתון ניתן היה לזהות את arabinan hemicelluloses (סלק סוכר) galactan pectic וכן עבור RGI (סויה). האנזימים המיוצרים היו פעילים יותר בתנאים חומציים (pH 4.0) מאשר ניטראליים או תנאים בסיסיים מעט (pH 8.0). תחתון פעילות לקראת מצעי ICB (איור 3F)מוכיח כי כאשר סוכרים הם בהקשר הטבעי יותר, את היעילות של האנזים הוא לא אותו דבר כמו עם פוליסכריד טהור וזו הסיבה מצעים ICB להפגין תצוגה מציאותית יותר על יעילות האנזים, אם יושם כדי גלם או טרום חומר צמחי מטופלים.

figure-results-3
הקרנת איור 3. של supernatant התרבות מתרבה נוזלי בן 3 ימים של chrysosporium Phanerochaete באמצעות צלחת מצע רבה המכילה 19 CPH ו -5 מצעי ICB. א) תכנית של התקנת הצלחת עם 4 בארות לכל מצע פרט (רקע אפור = מצעי CPH, רקע כתום = מצעי ICB). ב) תמונה של צלחת assay המכילה את המצע. C) תכנית המציגות את תנאי החיץ השתמשו בניסוי זה (200 מ"מ pH יצטט נתרן 4.0, pH פוספט נתרן 6.0 ונתרן פוספט pH 8.0). ד) תמונה של צלחת המוצר לאחר שעה 2 ב 25 מעלות צלזיוס. E) Absorbances אותר ב 517 ננומטר ו זמם עבור כל מצע פרט CPH ו- F תוצאות מצע ICB) עבור האנזימים בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מצעי chromogenic יכולים לשמש גם כדי ללמוד תופעות סינרגיסטי באמצעות תערובת של מצעי CPH בצבעים שונים היטב אחד וניתוח supernatant התגובה לאחר טיפול באמצעות אנזימים יחידים או אנזים קוקטיילים.

בדוגמה הבאה שמוצג באיור 4, תאית CPH אדום מצעים CPH-xylan צהוב עורבבו יחד לעבר כ סוסיםאל יחס בבארות צלחת מסנן 96-היטב. איור 4 א מציג את תוצרי תגובה בצבע אחרי 1 טיפול שעות בטמפרטורת חדר ללא אנזים (שליטה), cel התאית (2 U / ml), xyl xylanase (1 U / ml) ו תערובת של שניהם אנזימים (3 משכפל עבור כל גישה) במאגר אצטט נתרן 100 מ"מ pH 4.5. לניתוח, המוצר התגובה היה לכמת spectrophotometrically ידי סריקת הספקטרום ספיגת מ 350 ננומטר עד 700 ננומטר (איור 4B). לעתים קרובות בדיקה ויזואלית לבדו יכולה לתת אינדיקציה אם האנזים פועל על מצעים אחת או יותר, אולם רשמה ספקטרום ספיג הנובע צבעים שונים גם יכול להיפתר באמצעות רגרסיה ליניארית פשוטה 8 לתת אינדיקציה מדויקת יותר של ההיקף השפל של כל מצע מהתערובת.

באמצעות מצעים CPH כתערובת מוסיף באופן משמעותי את התפוקה של assay, מה שמאפשר SCReening נגד עד 4 מצעים שונים בניסוי אחד (טוב אחד). בדוגמה המוצגת ארבעה מצעים שונים המשמשים: כחול CPH-β-גלוקן (שעורה), צהוב CPH-xylan (אשור), ירוק CPH-amylose ואדום CPH-pectic galactan (תורמוס). הפריסה של צלחת המצע מוצגת באיור 4C ותמונה של צלחת assay באיור 4D. התגובה בוצעה pH חיץ נתרן אצטט 100 מ"מ 4.5 למשך 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס, 150 סל"ד. אנזימי סינגל ראשון עם ריכוז אנזים הגדלה נבדקו עם מצע CPH המתאים (4E איור) ואת supernatant בצבע התקבל כצפוי בצלחת המוצר (איור 4F, בשורה 1A - 12D). שורת E הכילה את CPH-xylan וכחול CPH-β-גלוקן צהוב שני מצעי CPH שונים, אשר היו מפורקים עם יחסים שונים של אנזימים המתאימים אנדו -xylanase ואת אנדו -glucanase. לאחר התגובה, התוצאה היא visible בצלחת המוצר: הצבע של מוצר התגובה הייתה כהה ירוק-כחול, כאשר יותר -glucanase אנדו נכח (איור 4F, 4E-6E) והפך מצית צהוב-ירוק, כאשר ריכוז אנדו -xylanase מוגבר ( איור 4F, 10-12E). אותו בא לידי ביטוי בשורה F, שבו שני מצעים אדומים galactan CPH-pectic וצהוב CPH-xylan היו מפורקים עם אנדו -galactanase ואת אנדו -xylanase. כל ארבעה מצע CPH בצבעים השונה נכח (האיור 4F, 1G-12F) ואנזימים יחידים מושפל מצע CPH המתאים ועל-ידי הוספת נוספי אנזימי שילוב של תוצרי תגובה בצבע התקבל.

figure-results-4
איור 4. שילוב של שני מצעי CPH שונים, תאי-CPH אדום CPH-xylan הצהוב, שטופל אנזימים שונים. אSupernatants Reaction) לאחר טיפול של שני מצעים עם -cellulase אנדו (CEL) או אנדו -xylanase (xyl) או שניהם אנזימים. B) ספקטרום ספיגת של supernatants התגובה. שילוב של ארבעה מצעים CPH שונים שטופלו אנזימים שונים C) תוכנית של הצלחת המצע המכיל מצעים CPH:. כחול CPH-β-גלוקן (שעורה), צהוב CPH-xylan (אשור), CPH-amylose ירוק CPH- אדום galactan pectic (תורמוס) D) תמונה של צלחת assay המכילה מצעי CPH השונים E) תכנית של צלחת המוצר מראה את היחס בין האנזימים הוסיפו (ריכוזים נומינליים (NC):.. Glu = 1 U / ml אנדו -glucanase, xyl = 1 U / ml אנדו -xylanase, איימי = 5 U / ml אנדו -amylase וגל = 0,5 U / ml אנדו -galactanase). F) תמונה של צלחת המוצר לאחר דגירה 30 דקות ב 25 מעלות צלזיוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מצע מָקוֹר
CPH-2-hydroxyethylcellulose N / A
(CPH-2-HE-תאי)
CPH-amylopectin תפוח אדמה
CPH-amylose תפוח אדמה
CPH-arabinan סלק סוכר
CPH-arabinoxylan חיטה
CPH-קזאין חלב שור
CPH-chitosan החי
CPH-curdlan Alcaligenes faecalis
CPH-dextran Spp Leuconostoc.
CPH-galactomannan חָרוּב
CPH-laminarin Laminaria digitata
CPH-lichenan אזוב איסלנדי
CPH-methylcellulose N / A
CPH-pachyman פוריה קוקוס
galactan CPH-pectic תפוח אדמה
CPH-pullulan Aureobasidium pullulans
CPH-rhamnogalacturonan לי (אני RG) תפוח אדמה
CPH-rhamnogalacturonan אני (-Gal) * תפוח אדמה
CPH-rhamnogalacturonan שעועית סויה
CPH-xylan אשור
CPH-xyloglucan תָמָר הוֹדִי
CPH-β-גלוקן שעורים שְׂעוֹרָה
CPH-β-גלוקן מ שיבולת שועל שיבולת שועל
CPH-β-גלוקן משמרים שְׁמָרִים
ICB-ארבידופסיס רוזט עלים מ ארבידופסיס thaliana Col-0 (צמח מבוגר)
זרעי ICB-ארבידופסיס thaliana ארבידופסיס
ICB-ופסולת Officinarum קנה סוכר (צמח מבוגר יבש, גבעול ועלים)
ICB-גבישי תאית (נייר סינון) נייר Whatman 3mm Chr כרומטוגרפיה מסחרי
זרעי ICB-חלבה Spp גרגרנית. זרעים
ICB קנבוס קנאביס spp. (צמח מבוגר יבש, גבעול ועלים)
זרעי ICB-תורמוס תורמוס צר עלים זרעים
ICB-אבקה פ pratense איטן אבקת pratense
ICB-אשוח Spp Picea. (מיילעץ גזע מלא)
ICB-טבק משאיר מ ניקוטיאנה benthamiana (צמח צעיר)
קש ICB-חיטה Spp Triticum. (צמח מבוגר יבש, גבעול ועלים)
ICB-ערבה Salix spp. (צמח מבוגר יבש, עץ מחורץ מטען)
ICB-דורה Spp דורה. (משאיר מצמח מבוגרים)
* (β-1,4-D-galactan רשתות בצד סיר עם אנדו -β-1,4-D-galactanase)

טבלה 1. רשימת זמין chromogenic פולימר הידרוג'ל (CPH) ובחלקם לא מסיסים chromogenic ביומסה (ICB) מצעים.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנחנו משתמשים דור חדש של מצעי CPH ו ICB צבעוניות המבוססים על צבעי chlorotriazine (רשימה מלאה של מצעים בטבלה 1) מסודר ערכת assay מסחרית אישי מעוצב. עיכול אנזימים של מצעי מניב קטנים, מסיסים, מוצרי צבוע אשר ניתן לזיהוי בפתרון assay וניתן לכמת באמצעות צלחת קורא 9. Assay זה נועד לצורך ההערכה של אנזימי -acting אנדו ואת הרגישות של assay דומה לזו באמצעות azurine הצולב (AZCL) מצעים 10, בעוד שיטות אחרות זמינות עבור אנזימי -acting exo 11,12. המגבלה של ערכת assay זה טמון זיהוי של פעילות אנדו -enzyme, כמו CPH כמו גם מצעים ICB אינם מתכלה ידי exo -enzymes ככל הנראה בשל הפרעה סטרית הנובעים מולקולות צבע ו crosslinker 8.

Assay הוא ביצע ב 96-welפורמט l ותגובות פרט להתקיים הבארות. התגובה צריכה להיות מעורבת הצליח לקבל נתונים לשחזור. את supernatants וכתוצאה יסונן צלחת מוצר שבו הספיג של כל טוב ניתן לכמת באמצעות ספקטרומטריית ספיגה. העקרונות הבסיסיים ואת הפריסה של assay מוצגים באיור 1. את assay מורכב צלחת assay (צלחת מסנן 96-היטב) עם מצעים, ואחרי הדגירה עם אנזימים, supernatant מסוננת דרך לתוך צלחת גם ברור ואת absorbances נקרא מתן מדידה וכמותיות ספציפי ואת פעילות אנזים. הוכח, כי assay הקרנה זו באמצעות מצעי CPH ניתן גם להשתמש בתבנית צלחת אגרה, שבו תוצרי התגובה המסיסים ליצור הילה בצבע לאחר דגירת הלילה. 8

ערכות assay יכול לשמש מסך אנזימים מטוהרים-פעילויות הלוואי האפשריות שלהם כפי שמודגםאיור 2. Side-פעילויות יכולות לנבוע אנזים יחיד וספציפי המופקר שלה אלא גם מן העובדה כי המדגם נתח הוא תערובת של אנזימים שונים ותוצאת סינרגטית שלהם צריכה להיחקר. בנוסף, כפי שכבר הוכח במחקרים קודמים, קוקטיילי אנזים הזה, 13 חיידקים במעיים והתרבות broths מן הפטריות 8 וכן אנזים צמח אנדוגני וחיידקים (נתונים שלא פורסמו) יכול לשמש כמקור אנזים.

מצעי ICB לטפל תערובות מורכבות של רכיבי דופן התא נתקלו לעתים קרובות בתהליכים תעשייתיים של התמוטטות ביומסה. מצעים אלה נועדו להעריך זמינים פוליסכריד ולספק מידע על איך לייעל קוקטיילים שפלים ביעילות לפלט שפלה יעילה יותר. כמו באיור 3 מצעים CPH ו ICB ניתן להשתמש בצד הקרנת אנזים זה לצד זה - חושף שפע של מידע על סגוליות אנזיםפעילות ד הוא בהקשר של המצע המועדף (CPH) וכן קומפלקס טבעי יותר המכיל רכיבים אחרים בנוסף המצע המועדף יותר מקרוב מחק אסיפת macromolecular המצויים בטבע (ICB). השימוש בצבעים מרובים מאפשר זיהוי סימולטני של פעילות אנזים שונה נגד מצעים כמה דבר אשר מגביר את התפוקה הגבוהה multiplexity של assay. ניתן לפתור ספקטרה של צבעים שונים על ידי רגרסיה ליניארית פשוטה, וברוב המקרים פעילות רב מצע יכול להיות שנצפו על ידי בדיקה ויזואלית בלבד. דוגמא מדומה של ניסוי כזה ותוצאותיו מתוארות באיור 4.

ארגז כלי assay זה ואת צדדיות של היישום שלה מתאימים היטב להקרנה הראשונה ברמה של אנזימים סמיכים וצח תרבות עם פעילויות ידועות. ההיבטים החשובים ביותר של assay זה הם טבע תפוקה גבוהה, התאמה אישית, קל שימוש וגמישות. עם זה בחשבון, wדואר מאמין כי מערכת חדשנית זו של כלים תשפר מאוד ולהאיץ תהליכי מיון אנזים תעשייתי כמו גם יישומים אקדמיים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ישנן שתי בקשות לפטנטים שהוגשו לערב את assay המצע CPH צלחת 96-היטב ואת assay המצע ICB 96-היטב (WO2015036000 ודנמרק PA 2015 70,311).

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות לפרופ 'J. Paul נוקס (אוניברסיטת לידס, בריטניה), שסיפק גישה למעבדות שלו עבור הצילומים, וסוזן א מרקוס לקבלת סיוע טכני מעולה. JS מודה הפרויקט WallTraC (תוכנית המסגרת השביעית של הנציבות האירופית (הסכם מענק לא:. 263,916) ואת ביומסה פרויקט המאה ה -21 (קרן Innovation דנמרק; מקרה לא .: 103,408) SKK מודה הפרויקט SET4Future (המועצה למחקר אסטרטגי דנית), האסטרטגי ביו-ערך הוקמה על ידי המועצה הדנית למחקרים אסטרטגיים, המועצה הדנית לטכנולוגיה וחדשנות (גרנט מקרה לא .: 0603-00522B), ו להתקרב מונחה ביולוגיה להבנת השפלה אנזימתי של מערכות פוליסכריד מורכבים (גרנט מקרה לא .:. 107,279) למימון מאמר זה משקף את הדעות של המחברים רק האיחוד האירופי אינו אחראי לכל שימוש שעלולה להתבצע המידע מכיל בזאת..

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות ערכת בדיקהGlycospotמותאם אישית ערכת
ערכת הפעלה פתרון הפעלהGlycospotלהפעלת מצעי CPH
350 מ"ל צלחת מקלט בלוק מרווח לסעפת ואקוםPall Corporation5015בלוק מרווח
96 בארות MultiScreen HV צלחת, 0.45 ומיקרו; m, צלחת בדיקה שקופה, לא סטריליתMilliporeMSHVN4510
96 בארות מיקרופלטות, פוליפרופילןגריינר Bio-Oneצלחתאיסוף 651201 לאחר שטיפת המצעים
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo Scientific269620לוחית מוצר
משאבת דיאפרגמה MZ 2 NTVacuubrand732000משאבת ואקום המשמשת עם סעפת
Infors HT EcotronInfors HT4950132 (Buch & הולם)שייקר אופקי
SpectraMax M5מכשירים מולקולריים10067-750 (VWR)קורא ספיגת צלחת 96 בארות
סעפת ואקוםPall Corporation5017סעפת ואקום
endo-צלולאז (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)צלולאז מגה-זיםE-CELTR[cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus) MegazymeE-BMACJmannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)MegazymeE-LAMSEβ-glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger) MegazymeE-EGALNgalactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger) MegazymeE-XYAN4xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.) מגה-זיםE-XEGPxyloglucanase [xg]
α-עמילאז (Bacillus licheniformis) עמילאז MegazymeE-BLAAM[amy]
הוואקום

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42 (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26 (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720 (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195 (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33 (4), 798(2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103 (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282(2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2 (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151 (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81 (1), 187-195 (2015).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

96Endo cellulase

מאמרים קשורים