מאמר שיטה

בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

DOI:

10.3791/54289

⸱

6 באוגוסט 2016

 ,  ,  , 
1Center for Innovation in Global Health Technologies (CIGHT), Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Pritzker School of Medicine, The University of Chicago

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה להפקת DNA פשוטה ומהירה מבוססי נייר של HIV proviral דנ"א שלם דם זוהה על ידי PCR כמותי. פרוטוקול זה יכול להתארך לשימוש באיתור סמנים גנטיים אחרים או בשיטות הגברה חלופיות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FINA, סינון בידוד של חומצות גרעין, היא שיטת חילוץ רומן אשר מנצלת סינון אנכי דרך קרום פרדת כרית ספיגה לחלץ DNA תאי מדם כולו בתוך פחות מ -2 דקות. דגימת דם מטופל עם חומר ניקוי, בקצרה מעורבים ויישומים ידי pipet קרום ההפרדה. את lysate פתילות לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ"א הגנומי על פני השטח של קרום ההפרדה. ה- DNA החילוץ נשמר על הממברנה במהלך שלב לשטוף פשוט שבו מעכבי PCR הם רשעים לתוך הנייר הסופג הסופג. הקרום המכיל את DNA בפח הוא הוסיף אז אל תגובת PCR ללא טיהור נוספת. שיטה פשוטה זו אינה דורשת ציוד מעבדה והוא יכול להיות מיושם בקלות עם ציוד מעבדה יקר. כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור זיהוי רגיש מאוד לכמת DNA proviral HIV-1 מ 100 μl כולו דם כמודל מוקדםאבחון פאנט של HIV שיכול להתאים בקלות ליעדים גנטיים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מספר דיווחים דנו בפיתוח שיטות חילוץ נייר או מבוסס קרום לשימוש Point-of-care (POC) התקנים 1-5 במטרה עושה את הרגישות וסגולית המעודנות של אבחון מולקולרי זמינה לכל. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחלות המועברות במגע מיני יוזמת אבחון טבע את מונח בטיח (משתלמים, רגישים, ספציפית, ידידותי למשתמש, ראפיד וחזק, ציוד ללא ונמסר מי צריכים את זה) כדי לתאר את המאפיינים האידיאליים של POC מבחן 6. הנחיות אלה, המאפיין ללא ציוד מאתגר במיוחד להשגה לאבחון מולקולרי. עם זאת, כל חידוש בתחום יקדם את המטרה להגיע אלה ברוב הצורך, ויש תקווה לשיפורים לטווח קרוב בביצועי בדיקה על ידי התאמת טכנולוגית 7 קיימים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לחילוץ דנ"א מהדם כולושאינו דורש מכשור כימיה או מעבדה מורכבת. FINA (בידוד סינון של חומצות גרעין) שיטת הכנת המדגם פותחה במקור כדי לחלץ DNA לויקוציטים מהדם כולו כדי לזהות את provirus HIV-1 כחלק מדגם עד למענה Point-of-care (POC) PCR כמותי (qPCR) מוקדם התינוק אבחון (עיד) פלטפורמה לשימוש הגדרות משאב מוגבל 8-11. מיצוי FINA נבדל שיטות טיהור קונבנציונליות המשתמשות ממברנות סיליקה או חלקיקים פאראמגנטיים מצופית סיליקה לאגד DNA הפיך בנוכחות סוכני chaotropic 12. במקום זאת, FINA משתמש סינון אנכי דרך קרום הפרדה לחלץ DNA התאי מהדם כולו ישירות. קרום המכיל את DNA בפח יכול להיות ממוקם ישירות בתוך שפופרת PCR ואו מיד בשימוש תגובת PCR או מיובש באוויר הגברה מאוחר יותר 9. אין סביבות chaotropic, פנול, או כהלים משמשים החילוץ המדגם, eliminaטינג שלבי הכביסה הנרחבים צורך להסיר מעכבי qPCR חזקים נגזרו תהליך החילוץ 13,14.

קרום FINA יכול ללכוד או תאים 9 או הדנ"א הגנומי ששוחררו על ידי תמוגה תא 11 לפני הדגימה מתווספת הממברנה. עבור ללכוד תאים, דם מלא מתווסף ישירות הממברנה. התאים לאחר מכן הם lysed בקרום ידי הוספת 10 מ"מ NaOH. היתרון בשיטה זו הוא שהיא כוללת רק 3 שלבים: 1) בנוסף מדגם; 2) תמוגה תא / לשטוף 3) מיקום הדיסק מסנן בצינור qPCR. החיסרון בשיטה זו הוא כי קרום יכול להכיל רק מספר מוגדר של תאים ביחס ישר לקוטר של הדיסק הממברנה. כדי להגיע לגבול של זיהוי הנדרש עיד, 100 μl של דם מלא נדרש קלט מדגם הכרוך מסנן כי הוא גדול מדי כדי להיות ממוקם בתוך צינור qPCR. Lysing בתאי הדם עם חומר ניקוי לפני הוספת מדגם לאיסוףקרום מוסיף צעד עיבוד, אך מאפשר שימוש במסנן קטן מאותן גודל המדגם. הצלחנו להוכיח שחזור גבוה, זיהוי עותק יחיד, וכימות קטנה כמו 10 עותקים של דנ"א proviral HIV-1 מ 100 μl של דם באמצעות בדיקה זו תצורה 11.

בדו"ח זה, אנו מתארים את פרוטוקול FINA כפי שפותח במקור לשימוש במעבדה. הקרום / מסנן הכריך המכונה מודול הכנת מדגם FINA אפשר להכין סדרות המוניות שנאגר לשימוש מאוחר יותר. כאשר דגימות הן להיעקר תהליך זה לוקח 2 דקות והוא יכול להתבצע משתנה קבוצות גודל. QPCR ניתן להפעיל באופן מיידי או מסננים המכילים את ה- DNA מוטבע ניתן לאחסן עד שהוא נוח לבצע qPCR. שיטה זו נוחה מאוד עבור ניתוח שיגרתי של דגימות בשתי הגדרות משאב נמוכות וגבוהות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרה אתיקה: דגימות דם כולו נעשה שימוש במחקר זה אינם נחשבים מחקר מעורבים בבני אדם. הדגימות התקבלו למטרות אבחון קליניות, אשר היו מרוצות, ואת החלק הנותר של דגימות אלה סופק עבור assay מחקר FINA. הדגימות קודדו כך שהחוקרים לא הצליחו לברר את זהות אנשים בקלות.

1. הכנת מודול הכנת דוגמאות FINA

  1. כן סופג כרית על ידי חיתוך 35 x 35 מ"מ 2 של צמר גפן 2.6 מ"מ עובי 100%. חותכי כרית אחת לכל דגימה.
  2. כן סרט פרפין פלסטיק עם קלטת גיבוי נייר ידי פיסת חנית של סרט פרפין (25 מ"מ (ח) ב -50 מ"מ (w)) ולאחר מכן ניקוב חור בקוטר 7.14 מ"מ במרכז את הקלטת באמצעות אגרוף חור מונע פטיש. כן קלטת אחת לכל דגימה.
  3. הכין קרום מפריד זכוכית דם כבול (קרום לכיד) דיסק ידי ניקוב עיגול בקוטר 8.35 מ"מבאמצעות אגרוף חור מונע פטיש. פונץ 'דיסק אחד לכל דגימה. הדיסק יש יכולת כושר סינון של 2.3 מיקרומטר.
  4. הרכיבו את מודול הכנת המדגם FINA ידי הצבת את הדיסק ללכוד במרכז הנייר הסופג באמצעות מלקחיים. מניח את קלטת סרט פרפין על דיסק צילום, כך החור של קלטת פרפין עוזב את המרכז של הדיסק ללכוד חשוף.
  5. להבטיח מגע מרבי בין דיסק הנייר הסופג על ידי מתיחת קלטת פרפין מעט כדי לכסות את הנייר הסופג ולחיצה על קלטת פרפין בתקיפות לתקוע אותו אל הנייר הסופג סביב כל הקצוות של הדיסק.
  6. לעשות כמה מודולים כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי.

2. הכנת Tube qPCR

  1. הכן דיסק הקלטת 5.1 מ"מ אשר לעגן את קרום ללכוד תאים אל הצד של הצינור qPCR כדי למנוע קרום לחסום את גילוי הקרינה על ידי ניקוב מעגל של polye פעמיים מצופהSter סרט אבחון עם אגרוף מונע פטיש מסדין של הקלטת. הכין דיסק קלטת אחת לכל דגימה.
  2. הסר צד אחד של אוניית המדבקה של הקלטת. מניחים את קלטת לתוך צינור PCR 200 μl, דבק בו על צד אחד ו לכיוון החלק התחתון של הצינור. הסר את האונייה מדבקה השנייה. הצינור מוכן כעת לקבל דיסק מוכן.
  3. לייצר כמה צינורות כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי.

3. להמציא דם דגימה

הערה: אם דגימה במבחן אמיתית שמכינה, המשך לשלב 4.

  1. תאי 8e5-LAV הפשרה 15 מחסה עותק יחיד של provirus HIV-1 המתקבל מעבדת אבטחת האיכות וירולוגיה (VQA; Rush Presbyterian / הסנאט במרכז הרפואי של לוק, שיקגו, אילינוי.).
    הערה: הם מאוחסנים כדורי תא קפוא בריכוז של 4,000 תאים / μl. ספירת תאים אומתה כפי שתואר לעיל 9.
  2. כן serדילול ial מקפיא בינוני (בסרום שור עוברי 90%, sulfoxide דימתיל 10%) לריכוזים בטווח שבין 1 ל 400 תאים / μl.
  3. Pipet 10 תאי μl מכל אחד הדילולים סדרו לתוך צינור microcentrifuge. הוספת 100 μl של כל דגימת דם מטופלי EDTA השלילית HIV-1 טריה על צינור אחד כדי ליצור עקומת סטנדרט של מספרי עותק 8e5-LAV 10-4,000. מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים.

4. בצע הפקת FINA

  1. Lyse דם התאים על ידי הוספת טריטון-X100) לריכוז סופי של 1% (11 μl 10% טריטון-X100 110 μl כולו דם ותאי משלב 3.3).
  2. מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים. הדם צריך להאדים שקוף.
  3. Pipet כל דגימת דם על הדיסק ללכוד.
    הערה: חותמת מים חזקה בין קלטת פרפין הממברנה ללכוד מבטיחה כי הדם זורם דרך הממברנה, וקשר טוב בין ללכוד מ 'embrane והרכבת נייר סופג מבטיחים פתילת מדגם מהירה.
  4. אפשר מדגם לספוג דרך המסנן.
    הערה: פתילות דם lysate לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ"א הגנומי על פני השטח של הדיסק ללכוד. את lysate שספג לתוך הדיסק כאשר הוא מופיע מט.
  5. להוסיף 600-1,000 μl 10 מ"מ NaOH ירידה מבחינת על הדיסק ללכוד.
    הערה: חיץ לשטוף ניתן להוסיף גם כתוספת עיקר 600 μl. המאגר יהווה אגל בקלטת פרפין הידרופובי פתיל דרך החור אל הדיסק ב כ 20 שניות. המסנן ישתנה מאדום אישור מציין לבן של המוגלובין.
  6. הפרד את הדיסק מן הנייר הסופג עם מלקחיים ולהחיל את הדיסק לקלטת בצינור PCR המוכן. אם יש צבע אדום נשאר על המסנן להוסיף 50-100 μl של חיץ לשטוף כדי להסיר את המסנן לפני הצבת בצינור.
    הערה: לעתים רחוקות, לחץ עודף מיושם במהלך הכנתמודולי FINA תוצאות החלוקות של השכבות הממברנה במהלך ההיפרדות מן הנייר הסופג. בטל הדיסקים האלה ולהכין מדגם טרי.
  7. לאחר הסינון ממוקם בצינור PCR, לנתח דגימות מיד. לחלופין, לילה יבש בתוך יבוש סידן גופרתי המכיל תיבת, ולאחר מכן מכסה ומכניסים שקיק רדיד עם יבוש סיליקה ולאחסן עד מוכן לניתוח.

5. התגובה qPCR

  1. כן 100 μl תערובת אמן qPCR לכל תגובה באמצעות HIV פריימרים ו בדיקות ספציפיים כפי שתואר לעיל 9,11. כלול פקד הגברה פנימי כדי לפקח על הנוכחות של מעכבי הגברה כדי לוודא מדגם שלילי הוא שלילי נכון. הקפד כי מסנן מכוסה כולו תערובת אמן וכי מסנן נשאר קבוע לצד של צינור לאורך כל התגובה.
  2. בצע הגברה באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת כפי שתואר לעיל 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה לחילוץ דנ"א proviral מהדם כולו ומשובץ תאים 8e5-LAV מוצג באיור 1. איור 2 מציג את מודול מדגם FINA והכינו צינור qPCR. שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של provirus HIV-1 מתאי 8e5-LAV במספרי עותק שונים, כפי שמוצגת עקומת התקן של דגימות מאולצות (איור 3). PCR היה יעיל של 103%, כפי שנמדד יעיל = -1 + 10 (-1 / שיפוע). המשוואה של הקו היה y = -3.25x + 27.95, עם מתאם של R² = 0.996. עקומת תקן ה-...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עיד צמוד גישת טיפול מהירה הודגם להפחית תמותת תינוקות עקב זיהום HIV 16. בגלל ההתמדה של נוגדנים אימהיים בתוך הדם של תינוק, בדיקות נוגדנים מהירות HIV יש שימושיות מוגבלת בקביעת מעמדם של תינוקות שנחשפו HIV. ארגון הבריאות העולמי ממליצה כי כל התינוקות שנולדו ל- HIV-1 אמהות חיוביות צריכים להיבדק בבית 4-6 שבועות של גיל, באמצעות מבחן Virological 17. דיווחנו לפיתוח assay לאיתור לכמת DNA proviral HIV-1 בדגימות דם מלאות כי הוא מסוגל איתור עותק יחיד ברגישות 100% הפגינה וספ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתוח פרוטוקול זה נתמך על ידי מענק האתגרים הגדולים של קרן ביל ומלינדה גייטס בבריאות גלובלית 37774. ריאגנטים וייעוץ PCR בזמן אמת סופקו על ידי Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. תאי 8E5-LAV סופקו על ידי המעבדה לאבטחת איכות וירולוגיה, Rush Presbyterian; המרכז הרפואי סנט לוק. דם שלילי ל-HIV-1 סופק על ידי Core Lab, NorthShore University HealthSystems, אוונסטון, אילינוי. תודה למארק פישר על העזרה בצילום.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Fusion 5GE Healthcare Life Sciences8151-9915
707 כרית ספיגהVWR International28298-014
PARAFILM MVWRINTERNATIONAL 52858-000
3M סרט אבחון פוליאסטר מצופה כפול 3M התמחויות רפואיות9965
200 ומיקרו; l צינורות רצועות qPCRAgilent401428
מכסי רצועה אופטיתAgilent401425
Mx3005p qPCR מערכתAgilent401456
נתרן הידרוקסידסיגמא-אולדריץ'221465A.C.S. מגיב
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T9284BioXtra
דימתיל סולפוקסידסיגמא-אולדריץ'D8418לביולוגיה מולקולרית
סרום בקר עוברי, מוסמך, ממוצא אמריקאיThermo Fisher Scientific16000-044
ניקוב חור קטן מונע פטיש קוטר חור 3/16 אינץ' (5.1 מ"מ)McMaster Carr3424A16
ניקוב חור קטן מונע פטיש קוטר חור 1/4 אינץ' (7.14 מ"מ)McMaster Carr3424A19
ניקוב חור קטן מונע פטיש קוטר חור 5/16 אינץ' (8.35 מ"מ)מקמאסטר קאר3424A23

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
  2. Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem. 87 (15), 7595-7601 (2015).
  3. Govindarajan, A. V., Ramachandran, S., Vigil, G. D., Yager, P., Bohringer, K. F. A low cost point-of-care viscous sample preparation device for molecular diagnosis in the developing world; an example of microfluidic origami. Lab Chip. 12 (1), 174-181 (2012).
  4. Linnes, J. C., et al. Paper-based molecular diagnostic for. RSC Adv. 4 (80), 42245-42251 (2014).
  5. Rodriguez, N. M., et al. Paper-Based RNA Extraction, in Situ Isothermal Amplification, and Lateral Flow Detection for Low-Cost, Rapid Diagnosis of Influenza A (H1N1) from Clinical Specimens. Anal Chem. 87 (15), 7872-7879 (2015).
  6. Peeling, R. W., Holmes, K. K., Mabey, D., Ronald, A. Rapid tests for sexually transmitted infections (STIs): the way forward. Sex Transm Infect. 82, Suppl 5 1-6 (2006).
  7. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Diagnostics for the developing world. Nat Rev Microbiol. 2 (3), 231-240 (2004).
  8. Jangam, S. R., Agarwal, A. K., Sur, K., Kelso, D. M. A point-of-care PCR test for HIV-1 detection in resource-limited settings. Biosens Bioelectron. 42, 69-75 (2013).
  9. Jangam, S. R., Yamada, D. H., McFall, S. M., Kelso, D. M. Rapid point-of-care extraction of human immunodeficiency virus type 1 proviral DNA from whole blood for detection by real-time PCR. J Clin Microbiol. 47 (8), 2363-2368 (2009).
  10. Kelso, D. M., Jangam, S., Yamada, D., McFall, S. Google Patents. , (2012).
  11. McFall, S. M., et al. A Simple and Rapid DNA Extraction Method from Whole Blood for Highly Sensitive Detection and Quantitation of HIV-1 Proviral DNA by Real-Time PCR. Journal of Virological Methods. 214, 37-42 (2015).
  12. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  13. Radstrom, P., Knutsson, R., Wolffs, P., Lovenklev, M., Lofstrom, C. Pre-PCR processing: strategies to generate PCR-compatible samples. Mol Biotechnol. 26 (2), 133-146 (2004).
  14. Schrader, C., Schielke, A., Ellerbroek, L., Johne, R. PCR inhibitors - occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  15. Folks, T. M., Powell, D. M., Martin, M. A. Google Patents. , (1991).
  16. Violari, A., et al. Early Antiretroviral Therapy and Mortality among HIV-Infected Infants. N Engl J Med. 359 (21), 2233-2244 (2008).
  17. World Health Organization. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. (2010).
  18. Gruner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots--preparing and processing for use in immunoassays and in molecular techniques. J Vis Exp. (97), (2015).
  19. Maiers, T. J., et al. An investigation of fingerstick blood collection for point-of-care HIV-1 viral load monitoring in South Africa. S Afr Med J. 105 (3), 228-231 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

PCRPCRHIV 1

מאמרים קשורים