בידוד סינון של חומצות גרעין: שיטת הפקת DNA פשוטה ומהירה

מספר דיווחים דנו בפיתוח שיטות חילוץ נייר או מבוסס קרום לשימוש Point-of-care (POC) התקנים ^1-5 במטרה עושה את הרגישות וסגולית המעודנות של אבחון מולקולרי זמינה לכל. ארגון הבריאות העולמי (WHO) מחלות המועברות במגע מיני יוזמת אבחון טבע את מונח בטיח (משתלמים, רגישים, ספציפית, ידידותי למשתמש, ראפיד וחזק, ציוד ללא ונמסר מי צריכים את זה) כדי לתאר את המאפיינים האידיאליים של POC מבחן ^6. הנחיות אלה, המאפיין ללא ציוד מאתגר במיוחד להשגה לאבחון מולקולרי. עם זאת, כל חידוש בתחום יקדם את המטרה להגיע אלה ברוב הצורך, ויש תקווה לשיפורים לטווח קרוב בביצועי בדיקה על ידי התאמת טכנולוגית ⁷ קיימים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול פשוט לחילוץ דנ"א מהדם כולושאינו דורש מכשור כימיה או מעבדה מורכבת. FINA (בידוד סינון של חומצות גרעין) שיטת הכנת המדגם פותחה במקור כדי לחלץ DNA לויקוציטים מהדם כולו כדי לזהות את provirus HIV-1 כחלק מדגם עד למענה Point-of-care (POC) PCR כמותי (qPCR) מוקדם התינוק אבחון (עיד) פלטפורמה לשימוש הגדרות משאב מוגבל ^8-11. מיצוי FINA נבדל שיטות טיהור קונבנציונליות המשתמשות ממברנות סיליקה או חלקיקים פאראמגנטיים מצופית סיליקה לאגד DNA הפיך בנוכחות סוכני chaotropic ^12. במקום זאת, FINA משתמש סינון אנכי דרך קרום הפרדה לחלץ DNA התאי מהדם כולו ישירות. קרום המכיל את DNA בפח יכול להיות ממוקם ישירות בתוך שפופרת PCR ואו מיד בשימוש תגובת PCR או מיובש באוויר הגברה מאוחר יותר ^9. אין סביבות chaotropic, פנול, או כהלים משמשים החילוץ המדגם, eliminaטינג שלבי הכביסה הנרחבים צורך להסיר מעכבי qPCR חזקים נגזרו תהליך החילוץ ^13,14.

קרום FINA יכול ללכוד או תאים ⁹ או הדנ"א הגנומי ששוחררו על ידי תמוגה תא ¹¹ לפני הדגימה מתווספת הממברנה. עבור ללכוד תאים, דם מלא מתווסף ישירות הממברנה. התאים לאחר מכן הם lysed בקרום ידי הוספת 10 מ"מ NaOH. היתרון בשיטה זו הוא שהיא כוללת רק 3 שלבים: 1) בנוסף מדגם; 2) תמוגה תא / לשטוף 3) מיקום הדיסק מסנן בצינור qPCR. החיסרון בשיטה זו הוא כי קרום יכול להכיל רק מספר מוגדר של תאים ביחס ישר לקוטר של הדיסק הממברנה. כדי להגיע לגבול של זיהוי הנדרש עיד, 100 μl של דם מלא נדרש קלט מדגם הכרוך מסנן כי הוא גדול מדי כדי להיות ממוקם בתוך צינור qPCR. Lysing בתאי הדם עם חומר ניקוי לפני הוספת מדגם לאיסוףקרום מוסיף צעד עיבוד, אך מאפשר שימוש במסנן קטן מאותן גודל המדגם. הצלחנו להוכיח שחזור גבוה, זיהוי עותק יחיד, וכימות קטנה כמו 10 עותקים של דנ"א proviral HIV-1 מ 100 μl של דם באמצעות בדיקה זו תצורה ^11.

בדו"ח זה, אנו מתארים את פרוטוקול FINA כפי שפותח במקור לשימוש במעבדה. הקרום / מסנן הכריך המכונה מודול הכנת מדגם FINA אפשר להכין סדרות המוניות שנאגר לשימוש מאוחר יותר. כאשר דגימות הן להיעקר תהליך זה לוקח 2 דקות והוא יכול להתבצע משתנה קבוצות גודל. QPCR ניתן להפעיל באופן מיידי או מסננים המכילים את ה- DNA מוטבע ניתן לאחסן עד שהוא נוח לבצע qPCR. שיטה זו נוחה מאוד עבור ניתוח שיגרתי של דגימות בשתי הגדרות משאב נמוכות וגבוהות.

הצהרה אתיקה: דגימות דם כולו נעשה שימוש במחקר זה אינם נחשבים מחקר מעורבים בבני אדם. הדגימות התקבלו למטרות אבחון קליניות, אשר היו מרוצות, ואת החלק הנותר של דגימות אלה סופק עבור assay מחקר FINA. הדגימות קודדו כך שהחוקרים לא הצליחו לברר את זהות אנשים בקלות.

1. הכנת מודול הכנת דוגמאות FINA

1. כן סופג כרית על ידי חיתוך 35 x 35 מ"מ ² של צמר גפן 2.6 מ"מ עובי 100%. חותכי כרית אחת לכל דגימה.
2. כן סרט פרפין פלסטיק עם קלטת גיבוי נייר ידי פיסת חנית של סרט פרפין (25 מ"מ (ח) ב -50 מ"מ (w)) ולאחר מכן ניקוב חור בקוטר 7.14 מ"מ במרכז את הקלטת באמצעות אגרוף חור מונע פטיש. כן קלטת אחת לכל דגימה.
3. הכין קרום מפריד זכוכית דם כבול (קרום לכיד) דיסק ידי ניקוב עיגול בקוטר 8.35 מ"מבאמצעות אגרוף חור מונע פטיש. פונץ 'דיסק אחד לכל דגימה. הדיסק יש יכולת כושר סינון של 2.3 מיקרומטר.
4. הרכיבו את מודול הכנת המדגם FINA ידי הצבת את הדיסק ללכוד במרכז הנייר הסופג באמצעות מלקחיים. מניח את קלטת סרט פרפין על דיסק צילום, כך החור של קלטת פרפין עוזב את המרכז של הדיסק ללכוד חשוף.
5. להבטיח מגע מרבי בין דיסק הנייר הסופג על ידי מתיחת קלטת פרפין מעט כדי לכסות את הנייר הסופג ולחיצה על קלטת פרפין בתקיפות לתקוע אותו אל הנייר הסופג סביב כל הקצוות של הדיסק.
6. לעשות כמה מודולים כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי.

2. הכנת Tube qPCR

1. הכן דיסק הקלטת 5.1 מ"מ אשר לעגן את קרום ללכוד תאים אל הצד של הצינור qPCR כדי למנוע קרום לחסום את גילוי הקרינה על ידי ניקוב מעגל של polye פעמיים מצופהSter סרט אבחון עם אגרוף מונע פטיש מסדין של הקלטת. הכין דיסק קלטת אחת לכל דגימה.
2. הסר צד אחד של אוניית המדבקה של הקלטת. מניחים את קלטת לתוך צינור PCR 200 μl, דבק בו על צד אחד ו לכיוון החלק התחתון של הצינור. הסר את האונייה מדבקה השנייה. הצינור מוכן כעת לקבל דיסק מוכן.
3. לייצר כמה צינורות כנדרש לצורך הניסוי או לאגור לשימוש עתידי.

3. להמציא דם דגימה

הערה: אם דגימה במבחן אמיתית שמכינה, המשך לשלב 4.

1. תאי 8e5-LAV הפשרה ¹⁵ מחסה עותק יחיד של provirus HIV-1 המתקבל מעבדת אבטחת האיכות וירולוגיה (VQA; Rush Presbyterian / הסנאט במרכז הרפואי של לוק, שיקגו, אילינוי.).
   הערה: הם מאוחסנים כדורי תא קפוא בריכוז של 4,000 תאים / μl. ספירת תאים אומתה כפי שתואר לעיל ^9.
2. כן serדילול ial מקפיא בינוני (בסרום שור עוברי 90%, sulfoxide דימתיל 10%) לריכוזים בטווח שבין 1 ל 400 תאים / μl.
3. Pipet 10 תאי μl מכל אחד הדילולים סדרו לתוך צינור microcentrifuge. הוספת 100 μl של כל דגימת דם מטופלי EDTA השלילית HIV-1 טריה על צינור אחד כדי ליצור עקומת סטנדרט של מספרי עותק 8e5-LAV 10-4,000. מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים.

4. בצע הפקת FINA

1. Lyse דם התאים על ידי הוספת טריטון-X100) לריכוז סופי של 1% (11 μl 10% טריטון-X100 110 μl כולו דם ותאי משלב 3.3).
2. מערבבים על ידי מצליף התחתון בעדינות של הצינור 5 פעמים. הדם צריך להאדים שקוף.
3. Pipet כל דגימת דם על הדיסק ללכוד.
   הערה: חותמת מים חזקה בין קלטת פרפין הממברנה ללכוד מבטיחה כי הדם זורם דרך הממברנה, וקשר טוב בין ללכוד מ 'embrane והרכבת נייר סופג מבטיחים פתילת מדגם מהירה.
4. אפשר מדגם לספוג דרך המסנן.
   הערה: פתילות דם lysate לתוך הנייר הסופג בשל פעולה נימי, ללכוד את הדנ"א הגנומי על פני השטח של הדיסק ללכוד. את lysate שספג לתוך הדיסק כאשר הוא מופיע מט.
5. להוסיף 600-1,000 μl 10 מ"מ NaOH ירידה מבחינת על הדיסק ללכוד.
   הערה: חיץ לשטוף ניתן להוסיף גם כתוספת עיקר 600 μl. המאגר יהווה אגל בקלטת פרפין הידרופובי פתיל דרך החור אל הדיסק ב כ 20 שניות. המסנן ישתנה מאדום אישור מציין לבן של המוגלובין.
6. הפרד את הדיסק מן הנייר הסופג עם מלקחיים ולהחיל את הדיסק לקלטת בצינור PCR המוכן. אם יש צבע אדום נשאר על המסנן להוסיף 50-100 μl של חיץ לשטוף כדי להסיר את המסנן לפני הצבת בצינור.
   הערה: לעתים רחוקות, לחץ עודף מיושם במהלך הכנתמודולי FINA תוצאות החלוקות של השכבות הממברנה במהלך ההיפרדות מן הנייר הסופג. בטל הדיסקים האלה ולהכין מדגם טרי.
7. לאחר הסינון ממוקם בצינור PCR, לנתח דגימות מיד. לחלופין, לילה יבש בתוך יבוש סידן גופרתי המכיל תיבת, ולאחר מכן מכסה ומכניסים שקיק רדיד עם יבוש סיליקה ולאחסן עד מוכן לניתוח.

5. התגובה qPCR

1. כן 100 μl תערובת אמן qPCR לכל תגובה באמצעות HIV פריימרים ו בדיקות ספציפיים כפי שתואר לעיל ^9,11. כלול פקד הגברה פנימי כדי לפקח על הנוכחות של מעכבי הגברה כדי לוודא מדגם שלילי הוא שלילי נכון. הקפד כי מסנן מכוסה כולו תערובת אמן וכי מסנן נשאר קבוע לצד של צינור לאורך כל התגובה.
2. בצע הגברה באמצעות מכשיר PCR בזמן אמת כפי שתואר לעיל ^9.

זרימת העבודה לחילוץ דנ"א proviral מהדם כולו ומשובץ תאים 8e5-LAV מוצג באיור 1. איור 2 מציג את מודול מדגם FINA והכינו צינור qPCR. שיטה זו מאפשרת הגברה יעילה של provirus HIV-1 מתאי 8e5-LAV במספרי עותק שונים, כפי שמוצגת עקומת התקן של דגימות מאולצות (איור 3). PCR היה יעיל של 103%, כפי שנמדד יעיל = -1 + 10 (-1 / שיפוע). המשוואה של הקו היה y = -3.25x + 27.95, עם מתאם של R² = 0.996. עקומת תקן ה- DNA proviral HIV משכפלת גם הגברה מאוד לשחזור, כפי שמעיד בטבלה 1. בנוסף, שליטה פנימית של 500 עותקים Hydroxypyruvate רדוקטאז קיים להראות שאין עיכוב PCR הנובע לחילוץ דם עם FINA, ללא תלות במספר עותקים של provirus HIV-1 ניתן (איור 4). הגברת IC הושגה ביעילות בכל 18 הדגימות שנבדקו, עם Cq ממוצע של 21.92 ± 0.25 ואת קורות חיים של 1%.

איור 1: Workflow לגילוי DNA proviral מהדם כולו ומשובץ תאי-LAV 8e5 כדי qPCR. (א) משמאל לימין, מודול FINA המוכן, אחרי הדם מתווסף הקרום ללכוד ואחרי חיץ לשטוף נוסף. (ב) צינורות qPCR עם דיסקים ללכוד נדבקים סרט דו-מצופה תערובת אמן qPCR הוסיפו. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: מודול בתוך בית FINA והכין צינור qPCR. (א) דיסק קרום לכיד 8.35 מ"מ קוטר היה דחוק בין נייר סופג 707 מרובע סדין דק של קלטת פרפין המכילה חור 7.14 מ"מ קוטר במרכז כך החור של קלטת פרפין התמקד הדיסק ללכוד עבור היישום הישיר של דם lysed ידי pipet. (ב) 5.1 מ"מ פעמיים מצופה קלטת פוליאסטר אבחון תקועה בצד של 200 צינור qPCR μl. האונייה השנייה של קלטת מוסר לחשוף משטח דביק להחלת דיסק לכיד כאשר מוכן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. עקומת תקן של דגימות DNA מאולצות proviral HIV-1 (א) מגרש הגברה המתקבל 100 μl של 4 משכפל ne HIV-1gative כולו דם ומשובץ 4,000, 400, 40 ו -10 תאים 8e5-LAV עם 500 עותקים / התגובה של המגרשים קווי מוצק הבקרה הפנימית = הגברה; קו מקווקו = סף. ציר Y הוא יחידות קרינה ואת ציר ה- X הוא מספר מחזור qPCR. (ב) עקומות סטנדרטיות של ערכי Cq שנמדדות עלילת הגברה לעומת מספר עותק יומן של תאי-LAV 8e5 ל -100 μl כולו דם. המשוואה של הקו: y = -3.25x + 27.95; R² = 0.996; יעילות PCR = 103.23% מחושבים באמצעות יעילות = -1 + 10 (-1 / שיפוע) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: בקרה פנימית מציינת שאין עיכוב qPCR 500 עותקים Hydroxypyruvate רדוקטאז ההגברה מלא פלסמיד הוסיף לכל תגובה.. מוצק קווים = מגרשי הגברה; קו מקווקו = סף. ממוצע Cq של IC = 21.92 ± 0.25. CQS נע בין 21.21 כדי 22.32. מקדם השונות (% CV) = 1%; N = 18. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ge = "1"> טבלה 1: Cq ממוצע, סטיית תקן (SD) ו מקדם השונות (% CV) של 4,000, 400, 40 ו -10 עותקים של עקומת סטנדרט 8e5-LAV עם מיצוי FINA ו- HIV-1 פריימרים ספציפיים ו בדיקות. N = 4. WB = כולו דם.

למחברים אין מה לחשוף.