מאמר שיטה

A-תכולה גבוהה במבחנה פלטפורמת Discovery הלבלב איילט β-cell שכפול

DOI:

10.3791/54298

⸱

16 ביולי 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגרים קריטיים לתחום מחקר הסוכר מעוניינים להבין את המנגנונים המולקולריים מווסת שכפול β-cell איון לפתח שיטות מגרה התחדשות תאי β. בזאת שיטה גבוהה ההקרנה תוכן לזהות ולהעריך את הפעילות β-cell לקידום שכפול של מולקולות קטנות מוצג.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אובדן תאי β המייצרים אינסולין הוא מאפיין מרכזי של סוכרת. בעוד שמגוון טיפולים חלופיים פוטנציאליים נחקרים, הרחבת β תאי הלבלב המייצרים אינסולין אנדוגניים נותרה אסטרטגיה אטרקטיבית. לתאי β יש פעילות התחדשות ספונטנית מוגבלת; כתוצאה מכך, מאמץ מחקרי מכריע הוא לפתח הבנה מדויקת של המסלולים המולקולריים המגבילים את צמיחת תאי β ולזהות תרופות המסוגלות להתגבר על מעצורים אלה. כאן מוצגת שיטת סינון תאים ראשוניים אוטומטית מבוססת תמונה גבוהה לזיהוי מולקולות קטנות המקדמות שכפול תאים β. מתגברים על כמה מגבלות של מתודולוגיות קודמות. ראשית, שימוש בתאי איים ראשוניים במקום בקו תאים אימורטליזציה ממקסם את שימור מגבלות הגדילה in vivo. שנית, שימוש בתרביות תאי איים בהרכב מעורב ולא בקו β תאים מאפשר זיהוי של ממריצי גדילה מוגבלים בשושלת וכלליים כאחד. שלישית, הטכניקה הופכת את השימוש באיים ראשוניים, משאב מגביל, למעשי באמצעות שימוש בפורמט של 384 בארות. רביעית, שונות ניסויית מזיקה הקשורה לאיכות תרבית איים לא יציבה מתגברת באמצעות אופטימיזציה של פרמטרים של בידוד, פיזור, ציפוי ותרבות. חמישית, הקשיים במדידה מדויקת ועקבית של קצב השכפול הבסיסי הנמוך של תאים אנדוקריניים באי מתגברים על ידי פרמטרים אופטימליים של צביעה חיסונית, רכישת נתונים אוטומטית וניתוח נתונים; אוטומציה משפרת בו זמנית את התפוקה ומגבילה את הטיית הנסיין. מגבלות בולטות של בדיקה זו הן השימוש בתרביות איים מפוזרות המשבשות את ארכיטקטורת האיים, השימוש במכרסמים ולא באיים אנושיים והמגבלות האינהרנטיות של תפוקה ועלות הקשורות לשימוש בתאים ראשוניים. חשוב לציין, האסטרטגיה מותאמת בקלות למחקרי שכפול איים אנושיים. בדיקה זו מתאימה היטב לחקירת ההשפעה המיטוגנית של חומרים על תאי β והמנגנונים המולקולריים המווסתים את צמיחת תאי β.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סוכרת כוללת אוסף של הפרעות שיתוף הסוף-נקודה המשותפת של הומאוסטזיס הגלוקוז שבש. למרות מנגנוני פתוגניים של תת סוכרת הם ברורים, הם חולקים תוצאה של מסת β-cell ירד, כלומר, אובדן כושר אינסולין ייצור 1,2. נכון להיום, אסטרטגיות טיפול בסוכרת לסמוך על ממשל כרוני של אינסולין אקסוגני, גירוי תרופתי של ייצור אינסולין או שיפור רגישות לאינסולין, ולעתים נדיר, השתלת איי לבלב או 3,4 לבלב כולו. למרבה הצער, הצלחת יישום אסטרטגיה זו היא קצרת מועד ו / או לא מצליח לשחזר את הפונקציה מספיק של אינסולין אנדוגני. למרות התועלת של מפתחי שיטה לעורר התחדשות β-cell, אין גישה כזו. כתוצאה מכך, מטרת מחקר הסוכר עיקרית היא לפתח שיטות כדי ליצור תאי β חדשים או להרחיב המוני β-cell אנדוגני 5 . למרות התחדשות β-cell ממקורות מתחדשים כמו תאי גזע עובריים היא מתקדמת, חששות בטיחות ויעילות להפוך את המרדף של אסטרטגיות חלופיות, כולל הרחבת β-תאים בוגרים, בעדיפות 6,7. חשוב לציין כי מקור השולט של תאי-β חדש in vivo הוא-תאי β קיימים ולא ובתאים מיוחדים 8,9. למרות β-תאים נראה שיש יכולת שכפולה מוגבלת, עלייה קטנה במסת β-cell (~ 30%) עשויים להיות מספיק כדי לשחזר הומאוסטזיס הגלוקוז אצל חולי סוכרת רבה. יתר על כן, בגירוי תרופתי באתרו של המוני β-cell אסטרטגיית טיפול זול וניתן להרחבה פוטנציאלי. בזאת שיטה גבוה הקרנת תוכן לזיהוי ואפיון מולקולות קטנות המעודדות צמיחת β-cell מוצגת.

מגוון שיטות במבחנה ניסיונית עשוי לשמש לזיהוי מוצרי גן ו / או מולקולות that לקדם שכפול β-תא ראשוני. מאמצים מוקדמים למדידת שטף שכפול תאי β בשימוש תרבות pancreata מכרסמים עוברים או תרבויות איון מבודד ללא פגע למדוד [3 ח] התאגדות thymidine, התאגדות BrdU או גופי mitotic בתוך האוכלוסייה מוכתמת אלדהיד-thionine או אינסולין בתגובה לתנאי טיפול ספציפי 10, 11. גישות במבחנה אלה הגירסות וקרובות יש ממנו מספר מגבלות. ליקויים בולטים כוללים (1) שימוש בתאי עובר אשר, בניגוד β-תאים בוגרים, להציג קצב שכפול β-תאי בסיס גבוה והם צמיחה מוסדרת באופן מובהק 12; (2) אופי סובייקטיבי שפיטה הנסיין תלויות אירועים שכפולים β-cell; (3) את העבודה וזמן הטבע אינטנסיבי של ספירת הנסיין תלוי אירועים שכפולים β-cell מפגר תפוקה ניסיון; (4) שימוש התאגדות / כתם / מראה גרעיני לזהות שכפול אפילוts וכתם ציטופלסמית שאינה חופף לזהות β-תאים מובילים misattribution של אירועים שכפולים שאינו β-cell בסמוך בטאו תאים.

לאחרונה β-תאים ראשוניים בוגרים שמשו להעריך את ההשפעה של transgene יתר הביטוי כמו גם טיפול מוצר או תרכובת גן על שכפול β-cell 13-16. עם זאת, מחקרים אלה גם יש לסמוך על ספירת סובייקטיבית של אירועים שכפול, cytoplasmic staining- או שאינו ספציפי שיטות לזיהוי β-cell ו / או צעדים עתירי עבודה כי להגביל את התפוקה, למשל, ציפוי שקופית היטב פרט של תאים או איון שלם הטבעת פרפין ועיבוד 17. יש לציין, מתודולוגיה הקרנה שכפולה β-תאים אנושיים מבוסס תמונה, דומה לזו המוצגת כאן, כבר פורסמה 18; עם זאת, שימוש מוצלח של assay זה לא הודגם ושימוש איי אדם להקרנה עיקרית לא יכול להיות רחב FEAsible.

אסטרטגיה חלופית לזיהוי חומרים לקידום שכפול היא להעריך אינדוקציה הצמיחה של קווי β-cell. מאמצים ראשוניים המשמשים β-cell-קווי טרנספורמציה כגון min6 תאים או INS 832/13-תאי 14,19-21. עם זאת,-שורות תאים אלה להפגין צמיחה רסן לשאת מעט דמיון β-תאים מובחנים היטב 22. כתוצאה מכך, יכולת צמיחת אינדוקציה היא מינימאלית, של רלוונטיות ברורות ולפעמים קשה לשחזר. אסטרטגיה משופרת להקרנה מבוססת שורת תאים מנצלת "טרנספורמציה הפיך" תאים הנמצאים עצירת גדילה בהעדר טטרציקלין (דוקסיציקלין) ביטוי אנטיגן התלוי SV40 T 23,24. עם זאת, לא ברור אם תאים אלה לחזור למצב "נורמלי" β-דמוי תא עם הסרת דוקסיציקלין. למרבה הצער, שימוש בתאים אלה הניב תרכובות מקדמת גדילה כללית כי לא נראה שיש שתועלת מיידית24. באופן כללי, השימוש-שורות תאים ללמוד ויסות צמיחה של תאים מסוג מוצגים פעילות שכפולה ספונטנית מינימאלית עשוי להיות תחולה מוגבלת.

פלטפורמת ההקרנה שהכפולה β-cell המוצגת כאן מנצלת עכברוש העיקרי בוגרים β-תאים לשמר ברגולציה של צמיחת vivo במידת ההאפשר, תרבויות תאי איון של רכב תא מסוג מעורב כדי לאפשר זיהוי של פעילויות לקידום צמיחה מוגבלת שושלת, רבה "טוב עיצוב על מנת למקסם את תפוקת ניתוח אוטומטי לחסל הטיה ולהקל תפוקה. שימוש מוצלח של פלטפורמה זו אפשר זיהוי של מספר תרכובות המקדמות שכפול β-cell 25,26. בנוסף, assay שמש במשך מחקרי יחסי מבנה-פעילות וניסויי epistasis כימיים לספק תובנות מכניסטית לתוך תקנה המולקולרי של שכפול β-cell. הפלטפורמה הציג הותאמה בהצלחה FOr lentiviral RNAi מבוסס חקירת שכפול β-cell מסלולי 25. מגבלות של assay כוללות מוגבלות מדרגיות (שימוש של תאים ראשוניים), שימוש מכרסם ולא-תאי איון אדם (אם כי assay יכול להיות מותאם עבור מחקרי איון אדם), הוצאות הקשורות הדמיה מבוססת נוגדן ושימוש איון עיקרי, השימוש איים מפוזרים (אדריכלות איון שבש) כדי להקל על רכישה ותלות תמונה אוטומטיות על הזמינות של מיקרוסקופ אוטומטית עם רכישת תמונה ויכולת ניתוח. למרות מתודולוגיה הקרנה הקלילה in vivo לזיהוי מוצרי גנים או תרכובות מעודדי התחדשות β-cell באתרו תהיה אידיאלית, פלטפורמת דוגמת אינה זמינה עדיין 27. כתוצאה מכך, הפלטפורמה תארה מתאימה חוקר מעוניין לחקור את רוב ההיבטים של שכפול β-cell.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה בוצע בהתאם ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. הפרוטוקול המתואר ישתנה לבידוד איון משישה 250 - 300 גרם (8 - 9 שבועות ישנים) חולדות זכרים ספראג Dawley, וזה מספיק כדי להפיק 228 בארות צלחת 384 גם להערכה שכפול תאי איון.

1. הכנת חומר

  1. הכן התקשורת ציפוי לפני ייזום בידוד איון על ידי איסוף התקשורת המותנה של תאי קרצינומה בשלפוחית ​​עכברוש 804G נשמר בנקודת המפגש במשך 3 ימים (20 מ"ל של RPMI1640) בצלחת בתרבית רקמה 15 ס"מ 28. מסנן ולאחסן סטרילי (-20 ° C) בתקשורת מותנה לשימוש מאוחר יותר.
  2. לעקר כלים כירורגיים (אחד 12 ס"מ מלקחיים רקמות שיניים, אחד 11.5 ס"מ מספריים בסדר, מספריים כירורגיות אחד 14.5 ס"מ, שני מלקחיים מעוקל 16 ס"מ, hemostat מעוקל אחד 12 ס"מ, ידית אזמל אחד 12 ס"מ) מסננת ברקמה אחת 30 רשת לפני initiating בידוד איון.
  3. כן פתרון עיכול לבלב על ידי המסת 60%: 40% תערובת של אני בכיתה מטוהרת: בכיתה השנייה collagenases (פעילות collagenase סכה של 300,000 - 400,000 יחידות) ב 60 מיליליטר של תמיסת המלח המאוזנת '1x הנקס (HBSS) השלים עם סידן ומגנזיום. טען 10 מ"ל של חיץ העיכול הלבלב לתוך 10 מ"ל מזרקים (שישה) עם מחט G 1 "22 ומניחים על קרח.
    הערה: 10 מ"ל של פתרון העיכול מוזרק לכל חולדה. קנה מידה בהתאם.
  4. הכן 4.5 מ"ל של קוקטייל ההרדמה במנדף מאוורר ידי ערבוב 1.3 מ"ל של קטמין (100 מ"ג / מ"ל), 0.2 מ"ל של xylazine (100 מ"ג / מ"ל) ו 3 מ"ל של PBS. הכן את קוקטייל הרדמה בתוך שעה 1 של ייזום בידוד איון.
  5. הכן חיץ לשטוף ידי הוספת 25 מ"ל של סרום עגל בן יומו עד 500 מ"ל של HBSS. מניחים לשטוף חיץ על הקרח לשימוש מאוחר יותר.
  6. כן 1 בקבוק בינוני איון שהוא 500 מיליליטר של מדיום הנשר השונה של נמוכה גלוקוז Dulbecco (DMEM), 50 מ"ל בסרום שור העובר (FBS), 5,000 מ"ל / יחידות של פניצילין 5,000 מיקרוגרם / מ"ל ​​של סטרפטומיצין.
  7. כן בינוני פונקצית איון מפתרון פונקציונלי / כדאיות (500 מיליליטר) עם 2% FBS, גלוטמין 2 מ"מ, 5 גלוקוז מ"מ, 5,000 יחידות / מיליליטר של פניצילין 5,000 מיקרוגרם / מיליליטר של סטרפטומיצין. אחסן את המדיה פונקצית איון (4 ° C) לשימוש מאוחר יותר.
  8. הכן 40 מ"ל חיץ חסימת ידי הוספת 2.5 מ"ל סרום החמור 0.12 מ"ל טריטון X-100 37.38 מ"ל של בופר פוספט 1x (PBS). חנות חיץ חסימה (4 ° C) לשימוש מאוחר יותר.
  9. השג את הנוגדנים הנדרשת לפני שיזם את הפרוטוקול.
    הערה: PDX-1 (TRITC) ו קי-67 (FITC) שיתוף מכתים משמש להקרנה שכפול β-תא ראשוני. לניתוח שכפול ספציפיים השושלת, לבצע מכתים immunofluorescence עבור סמנים זהות תא נוסף (אינסולין, גלוקגון, vimentin או סומטוסטטין; TRITC) יחד עם גרעיני (DAPI), PDX (Cy5) ו קי-67 (FITC) מכתים. נציג אלטרנטיביסמני lication, למשל, PCNA, עשויים לשמש גם.
  10. כן תכנית טיפול 228-היטב עם כל תנאי טיפול מבוצעים ארבעה פעמים. כלול positive- (5 Iodotubercidin [1 מיקרומטר] או דיפירידאמול [15 מיקרומטר]) ורכב שליטה (DMSO 1: דילול 666) בארות.

2. זלוף של הלבלב

  1. להרדים חולדות על ידי הזרקת ה- IP של פתרון קוקטייל הרדמה מדולל (0.30 מ"ל / 100 g משקל הגוף). לאחר העכברוש הוא בהרדמה מלאה ואינו מגיב לגירויים מזיקים, לבצע פריקת צוואר רחם.
  2. מניחים את החולדה מורדמים במצב שכיבה (אוריינטציה גולגולתי הזנב) על ערימה של מגבת נייר ולרסס את אזור הבטן עם אתנול 70%.
  3. פתח את חלל הבטן עם (בסיס באזור הערווה) U-חתך לסגת עור בכיוון המקורי על חזה כדי לחשוף את חלל הבטן.
  4. בזהירות לתפוס את התריסריון באמצעות שני זוגות מלקחיים מעוקלים, אתר את הערך של התריסריון b המשותףצינור Ile (הסוגר של Oddi) מהדק פתיחת התריסריון על הגבשושיות עם hemostat מעוקל.
  5. הרם את hemostat המעוקל נהג לצבוט את גבשושיות צינור מרה המשותפת לתפוס את צינור ההמרה קרוב כבד באמצעות מלקחיים מעוקלים. השתמש דיסקציה קהה עם המלקחיים המעוקלים לבודד ולחשוף את צינור המרה.
  6. מיקום מחדש את העכברוש עם הפרוקסימלי הראש וכפות הרגליים דיסטלי.
  7. Cannulate את צינור המרה המשותף (CBD) בבית או דיסטלי רק עד לצומת של צינוריות הכבד פיברוזיס משותף עם פתרון העיכול הלבלב -loaded מזרק 10 מ"ל לאט להזריק 10 מ"ל של פתרון העיכול הלבלב. בעוד הזרקה, לתמוך CBD עם ידית אזמל. שנה את מיקום המחט אם הצינור והלבלב להיכשל לנפח.
  8. הסר את הלבלב המנופח באמצעות מלקחיים המעוקלים מספריים בסדר להפריד אותו מן המעי הגס, מעיים יורדת, הקיבה וטחול. מניחים את הלבלב מנופח על הקרח בתוך שפופרת 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של פתרון עיכול לבלב.
    הערה: תשואת איון מקסימלית, לאסוף את כל pancreata תוך 30 דק 'והמקום רק 1 או 2 pancreata בצינור אחד 50 מ"ל עיכול.

3. דיסוציאציה של הלבלב

  1. לאחר כל pancreata נאסף, ומקום צינורות העיכול לתוך אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. מערבולת בעדינות את הצינורות כל 3 דקות.
  2. לאחר 15 דקות, לנער במרץ (אנכית) הצינורות 10 פעמים ולהוסיף 10 מ"ל של חיץ לשטוף קר. במרץ לנער את הצינורות של 5 פעמים נוספות ומניח על קרח.
  3. ממלאים את צינורות העיכול 50 מ"ל עם חיץ לשטוף קר ומערבבים על ידי היפוך הצינורות 5 פעמים.
  4. צנטריפוגה צינורות ב 97 XG ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות ושופכים את supernatant. היזהר שלא לעקור את רקמת pelleted.
  5. הוסף 25 מ"ל חיץ לשטוף מחדש להשעות את הרקמה על ידי vortexing בעדינות. חזור על שלבי 3.4 ו -3.5 פעמים נוספות.
  6. מניחים מסננת רקמת 30 רשת מעל רחerile 250 כוס מ"ל ויוצקים ההשעיה רקמה על מסננת. יש לשטוף את צינור העיכול עם 20 מיליליטר נוסף של חיץ לשטוף ויוצקים על הרשת. רקמות הלבלב ושומן המעוכלות יוסרו בשלב זה.
  7. יוצקים את החומר מסונן לשני צינורות טרי 50 מ"ל ו גלולה את הרקמה על ידי ספינינג ב 97 XG דקות 1 ב 4 ° C. צינורות supernatant ו להפוך למזוג לניקוז עודף חיץ.

טיהור 4. איים

  1. הוסף 20 מ"ל של תמיסת diatrizoate קר polysucrose / נתרן (1.119 g / ml צפיפות) אל רקמת לבלב pelleted. Homogenously מחדש להשעות את התוכן של כל צינור על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה חמש פעמים.
  2. בעדינות כיסוי הפתרון diatrizoate polysucrose / נתרן עם 10 מ"ל HBSS. שמור על ממשק נוזל חריף על ידי הוספה לאט את HBSS לאורך קיר הצינור.
  3. צנטריפוגה pancreata מתעכל ב 560 XG במשך 15 דקות (4 ° C) עם אצה איטית ולא בלם.
  4. שיתוףllect שכבת איון מממשק משתמש איים פיפטה ומקום 10 מ"ל ב 50 טרי צינורות מ"ל. אל הבריכה איים בשלב זה.
  5. הוסף 40 מ"ל של חיץ לשטוף צינור אחד 50 מ"ל ו ספין דקות 1 ב 140 XG ב 4 ° C..
  6. יוצקים את supernatant מחדש להשעות איים נקווה 50 מ"ל של חיץ לשטוף ידי היפוך הצינורות מספר פעמים. בצנטריפוגה צינורות 1 דקות ב 97 XG ב 4 ° C כדי לאסוף איים בתוך גלולה.
  7. יוצקים את חיץ לשטוף וחזור על לשטוף. תביאו איים לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה ו לשאוב supernatant.
  8. Re- להשעות כל צינור של איים ב 6 מ"ל של מדיום איון.
  9. מעבירים את האיונים מהצינור כל 50 מ"ל לתוך באר של צלחת בתרבית רקמה שש היטב. מערבולת את המנה 6 באר לאסוף איים לאמצע הבאר ולבחון איכות איון וטוהר תחת מיקרוסקופ.
  10. ידני לאסוף איים בעזרת פיפטה 1 מיליליטר ולהעביר את איי הרים לתוך הסמוכיםהיטב המכיל 6 מ"ל של התקשורת איון. מתערבל איון חזור וקוטפים עד טוהר 90%> מושגת.
  11. מעבירים את האיונים מטוהרים לצלחת בתרבית רקמה 10 ס"מ המכיל 20 מ"ל של מדיום איון.
  12. איים מקום בתוך חממה בתרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) לילה (איור 1 א).
  13. בעריכת תמצית תאי ציפוי איון, לצפות את הבארות של צלחת 384 גם עם 40 μl של תקשורת המותנה 804G לכל טוב. דגירה לילה חממה בתרבית רקמה.

5. פיזור ציפוי של תאי איילט

  1. למחרת, בעדינות לנתק איים מצלחת 10 ס"מ עם מגרד תא ולהעביר את איים לתוך צינור 50 מ"ל.
  2. גלולה איים על ידי צנטריפוגה דקות 1 ב 22 XG בטמפרטורת החדר. לשאוב supernatant.
  3. שטוף את האי עם 20 מיליליטר של PBS החם למזוג כנ"ל.
  4. Re- להשעות איים ב טריפסין 0.25% (150 μl לכל לבלב עכברושו) לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. פיפטה איים למעלה ולמטה 10 פעמים באמצעות פיפטה 1 מ"ל לאחר 5 ו -10 דקות של דגירה.
  5. לאחר 10 דקות, להעריך מדגם 20 μl של האיים trypsinized תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח עיכול מלא לספור את תאי האיון באמצעות hemocytometer. אם איים מעוכלים להישאר, להמשיך דגירה במשך 3 נוספת - עד 5 דקות ו פיפטה ולמטה 10 פעמים נוספות. חזור על פי צורך.
    הערה: התשואה טיפוסית היא ~ 125,000 - 150,000 תאים-איון לכל חולדה.
  6. הסר את צלחת תקשורת המצופית מותנית 804G 384 גם מן החממה ולהסיר תקשורת באמצעות aspirator 12 גם סעפת.
  7. להשעות תאים איון בצפיפות של 45,000 תאים לכל מ"ל במדיום פונקציה איילט צלחת 70 μl (3,150 תאים) לכל היטב עם טפטפת רב (איור 1B).
    הערה: מאחר β-תאים ממוקמים הבארות החיצוניות נוטים להגר כלפי ההיקף של שורות שימוש צלחת C ל N ועמודות 4ל -21 לצלחת 228 בארות עם תאים-איון מבודד 6 חולדות.
  8. מניח את הצלחת בחממה בתרבית הרקמה למשך 48 שעות כדי לאפשר הידבקות תא.

איילט תאים 6. תרבות טיפול, קיבוע מכתים

  1. כן 200 μl של רכב ותרכובות (תנאי טיפול מבוצעים ארבעה פעמים) בריכוז 2x במדיום פונקצית איילט. מסדרים תרכובות בצלחת 96-גם סטרילי כדי להקל pipetting רב גם.
  2. מוציאים בזהירות בינוני איון עם aspirator 12 גם סעפת ולהחליף עם המדיום פונקציה איון (35 μl / טוב) בעזרת פיפטה 12 גם. סור ולהחליף תקשורת משורה אחת בכל פעם, כדי להגביל את הסיכון של ייבוש (תרשים 1C).
  3. להתחיל בטיפול על ידי העברת 35 μl / טוב של הפתרונים המתחמים 2x. חזור הצליחו אל האינקובטור עבור משך טיפול 48 שעות.
  4. לאחר 48 שעות של טיפול, למזוג תקשורת הטיפול על ידי היפוך לצלחת.
  5. לשטוף בעדינות את תאי איון עם 50 μl לכל טוב של PBS 1x (1 דקות). מוסיף את PBS בעזרת פיפטה רב ערוצים.
  6. למזוג PBS ולתקן את התאים על ידי הוספת 50 μl לכל טוב של paraformaldehyde קר 4% (PFA) מדולל 1x PBS. דגירה תאים עבור 15 דקות ב 4 °.
  7. שוטפים את התאים שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) על ידי היפוך לצלחת להסיר את PFA בעדינות הוספת 60 μl של PBS לכל טוב כנ"ל.
  8. הכן 15 מ"ל פתרון אחזור אנטיגן על ידי ערבוב 14.25 מ"ל לפוראמיד ו -0.75 מ"ל 0.15 M נתרן ציטרט (pH 6). הפוך את הפתרון יחזור אנטיגן מייד לפני השימוש.
  9. הסר PBS מבארת על ידי היפוך לצלחת ולהוסיף פתרון יחזור אנטיגן 60 μl היטב כל אחד. מחמם את הצלחת באמבט מים 70 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות. מניח בלוק חימום על גבי הצלחת במהלך דגירה זה כדי למנוע עיוות של הצלחת רבה היטב.
    הערה: המים צריכים להיות בחצי הדרך במעלה החצאית צלחת; הצלחת צריכה לא להיות שקועה.
  10. הסר את צלחת מן האמבט במים ולאפשר לו להתקרר במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. ודא כי הצלחת לא ארוגה בדיקה ויזואלית.
  11. שוטפים את התאים עם 60 μl לכל טוב של פי שלושה 1x PBS (5 דקות כל אחד). הוסף PBS עם פיפטה רב ערוצי למזוג PBS על ידי היפוך לצלחת.
  12. השתמש פיפטה רב ערוצי להוסיף 40 μl לכל טוב של חיץ חסימת דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את חוצץ חסימת ידי היפוך לצלחת ו decanting.
  13. הוסף 40 μl של עכבר אנטי אנושי Ki-67 (1: 200) ועז אנטי אנושי PDX-1 (1: 100) נוגדנים מדוללים חסימת חיץ היטב כל דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  14. למחרת, למזוג את פתרון האנטי-הגוף לשטוף את התאים עם 1x PBS שלוש פעמים (5 דקות כל אחד) כפי שתואר לעיל. למזוג PBS.
  15. הוסף 40 μl לכל טוב של מדולל (1: 200) החמור biotinylated אנטי עכבר IgG והחמור rhodamine מצומדות IgG נגד עז בחסימת המאגר. דגירה עבור שעה 1בטמפרטורת החדר.
  16. שוטפים את התאים עם 1x PBS שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. הוסף 40 μl של בדילול (1: 400 בחסימת המאגר) streptavidin מצומדות-והעמסת היטב כל אחד. דגירה 30 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. שוטפים את התאים עם 1x PBS שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד. הוסף 40 μl לכל טוב של DAPI (300 ננומטר בחסימת המאגר) דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  18. שטפו תאים עם 1x PBS פעמיים ולהשאיר תאים 40 μl 1x PBS. הצלחת מוכנה כעת להיות מנותח.

7. ניתוח שכפול β-Cell

הערה: פרוטוקול assay יש לקבוע עבור מיקרוסקופ הקרנת התכולה הגבוה המשמש למדידה שכפול β-cell. בהרכב הפשוט ביותר, פרוטוקול זה הוא assay שני צבעים שבו סמן זהות ממשמש להגדרה-תאי β (PDX-1 + -cells) ועם סמן שכפול (Ki-67) משמש כדי להגדיר אירועי חלוקת תא.

  1. לזהות עצמים (β-תאים) מבוסס על averagדואר עוצם קרינה של מכתים PDX-1 (549 מסנן ננומטר) בתוך מעגל משוער (אורך: רוחב <1.6) בתוך שטח פיקסל הצפוי של גרעין β-cell (איור 2 א).
  2. לאחר מכן, לקבוע הגדרות לזהות אירועים שכפול (Ki-67-חיוביות) בהתבסס על עוצמת הקרינה הממוצעת (485 מסנן ננומטר) בתוך השטח PDX-1 + (איור 2B).
    הערה: פעמי חשיפה חייבות להיות קבועות על מנת לאפשר השוואה עוצמת פיקסל על פני תמונות. פרמטרי פרוטוקול Assay מותאמים כך שיחות מכונית עקביות לכלול אגרגטים מכתימים, פסולת תא ספציפיים שיכול להשפיע על איכות נתונים לרעה.
  3. לנתח מינימום של 500 β-תאים לכל היטב על מנת למקסם את השתנות דיוק ולהגביל.
    הערה: מדד שכפול β-תאי בסיס בתרבויות איון חולדה צפוי להיות 0.5 - 3%. בדרך כלל, 40 תמונות לכל טוב הוא יותר מהדרוש כדי לזהות 500-תאי β.
  4. לפני הניתוחהצלחת כולה, לנתח negative- נבחרים (DMSO שטופלו) ו-בקרה חיובית (5 iodotubercidin [1 מיקרומטר] או דיפירידאמול [15 מיקרומטר]) -treated בארות להעריך את תוקפו של פרוטוקול assay. כאשר assay מוקם כראוי, תרכובות בקרה חיוביות להשרות לפחות עלייה כפולה באחוז המשכפל את תאי β.
  5. קראו את הצלחת כולה פעם פרוטוקול assay מקבל תוקף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כדי להעריך β-cell או שכפול תאי α, פרוטוקול assay בארבעת צבעים נדרשים. ראשית, אובייקטים מזוהים על ידי מכתים DAPI (ערוץ 1, 386 ננומטר). לאחר מכן, β-תאי (אירוע 1) נספרים: יצירות כי שיתוף להביע PDX-1 + (ערוץ 2, 650 ננומטר) ואינסולין פרי-גרעיני (ערוץ 3, 549 ננומטר). בהמשך לכך, תאי β משכפלים (אירוע 2) נספרים: בטא-תאי (אירוע 1) כי שיתוף מפורשת Ki-67 (ערוץ 4, 485 ננומטר) (איור 3). אחוז משכפלים β-תאי מחושב: (אירוע 2 / אירוע 1) x ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות ניסיוניות ללימוד המסלולים המולקולריים השולטים צמיחת β-cell והתחדשות הן כלים חשובים לחוקרי סוכרת. בזאת, פלטפורמת הקרנה מבוססת עכברוש-איון לזהות ולאפיין לגירוי-מולקולה הקטנה של שכפול β-cell מוצג.

בעוד רוב ההיבטים של פרוטוקול זה מבוצעים בקלות על ידי חוקרים מנוסים, כמה צעדים דורשים טכניקה מסוימת. ראשית, במהלך הבידוד איון, cannulation של-צינור המרה מבלי לשבש את שלמותה דורש תרגול. אסטרטגיה מועילה היא מינימאלי כדי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIDDK DK098143 ו-DK101530 מה-NIH (JPA), מכון המחקר לבריאות הילד בספקטרום של סטנפורד (CHRI) ו-SPARK (UL1 TR001085, JPA).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
250 גרם זכר Sprague Dawly RatCharles RiverStain # 400
12 ס"מ שיניים tisuue מלקחייםFine Science Tools11021-12
11.5 ס"מ מספריים עדיניםכלי מדע עדינים14058-11
מספריים כירורגיים 14.5 ס"מכלי מדע עדינים14001-14 16
ס"מ מלקחיים מעוקליםכלי מדע עדינים11003-16
12 ס"מ hepostat מעוגלFine Science Tools13011-12
ידית אזמל 12 ס"מFine Science Tools10003-12
מסננת רקמות-30 רשתBellco Glass1985-85000
Cizyme RI, 375,000 יחידות CDAVitaCyte005-1030
תמיסת מלח מאוזן של הנקס (Ca++ ו-Mg++)Gibco24020-117
קטמין הידרוכלוריד (200 מ"ג/20 מ"ל)JHP PharmaceuticalsNDC# 42023-113-10להכנת קוקטייל הרדמה 
קסילזין (5 גרם/50 מ"ל)LLOYDNADA# 139-236להכנת קוקטייל הרדמה 
Histopaque 1077SigmaH-1077להכנת Histopaque 1100
Histopaque 1119SigmaH-1119להכנת Histopaque 1100
סרום עגל ניובורן 500 מ"לHycloneSH30118.03
תמיסת מלח מאוזנת של הנקסHycloneSH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Glucose בינוני/נמוך HycloneSH30021.01
פתרון פונקציונליות/כדאיות מדיה-טק99-768-CV
RPMI1640 מדיה HycloneSH30096.01לייצור בינוני ממוזג
804G קרצינומה של שלפוחית השתן של חולדות קו תאיםזמין על פי בקשה
בקר עוברי בינוני ממוזג, מוסמךGibco26160
GlutaMax-IGibco35050-061
פניצילין (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 מ"ג/מ"ל) MP Biomedicals1670049
פורממיד 500 מ"לFisher BioReagentsBP227-500
תמיסת חשיפת אנטיגן 250 מ"ל (pH 6.0)Vector LaboratoriesH-3300לייצור 0.15 M תמיסת נתרן סיטראט
דקסטרוז,כימיקלים נטוליEMD DX0145-1לייצור תמיסת גלוקוז 1 M
סרום חמור נומל (אבקה)Jackson ImmunoResearch017-000-121
Triton X-100SigmaT8787-100ML
נוגדן Ki67 אנטי אנושילעכבר BD Biosciences556003
נוגדן PDX-1 אנטי אנושי עיזיםR& D SystemsAF2419
נוגדן נגד אינסולין שרקן פוליקלונליDako2016-08
נוגדן אנטי גלוקגון ארנב פוליקלונליDako2014-06
נוגדן ארנב פוליקלונלי אנטי-סומטוסטטיןDako2011-08
נוגדן אנטי-וימנטין עוף פוליקלונליabcamab24525
מצומד ביוטין-SPחמור נגד עכברים IgGJackson ImmunoResearch715-065-150
StreptAvidin, אלכס פלור 488 מצומד InvitrogenS32354
חמור מצומד רודמין נגד עיזים IgG Jackson ImmunoResearch705-025-147
חמור מצומד רודמין נגד חזיר ניסיונות IgG Jackson ImmunoResearch706-025-148
חמור מצומד רודמין נגד ארנב IgGJackson ImmunoResearch711-025-152
Cy 5-מצומד חמור נגד חזיר ניסיונות IgG Jackson ImmunoResearch706-175-148
Cy 5-מצומד חמור נגד עיזים IgGJackson ImmunoResearch705-175-147
Cy 5-מצומד חמור נגד ארנב IgGJackson ImmunoResearch711-175-152
Cy 5-מצומד חמור נגד עוף IgGג'קסון ImmunoResearch703-175-155
DAPIMilliporeS7113
מאגר ריאגנטים חד פעמי 25 מ"לSorenson BioScience39900
384 באר, שחור/שקוף, צלחת מטופלת בתרבית רקמותBD Falcon353962
96 באר, שחור/שקוף, צלחת מטופלת בתרבית רקמותCostar3603
פיפטור רב ערוציCostar4880
שואב ואקום 12 ערוציםDrummond3-000-096
מגרד תאיםפלקון353085
אמבט מים איזוטמפ דגם 2223 של פישר סיינטיפיק
: ArrayScan VTIThermo Scientific
להכנת סרום מים ,מכשיר סינון בעל תוכן גבוה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600(2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

High Content ScreeningKi 67384

מאמרים קשורים