העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate Ciona intestinalis

סיכום

אנו מציגים transgenesis חולף מציאת גן ב intestinalis Ciona, קבוצת אחות chordate לבעלי חוליות, תוך שימוש בטכניקות microinjection ו electroporation. שיטות כאלה להקל גנומיקה תפקודית חסר חוליות הפשוטות הזה כולל מאפיינים בסיסיים של בעלי חוליות, כולל notochord ו epithelia ראש חושים ועל orthologs הרב של הגנים הקשורים למחלות אנושיות.

תקציר

אורגניזמים מודלים פשוטים הם חיוניים למחקרי in vivo של תהליכי התפתחות והתמיינות תאיים. נכון לעכשיו, המרחק האבולוציוני לאדם של מערכות מודל חסרי חוליות קונבנציונליות ומורכבות הגנום בבעלי חוליות הם אתגרים קריטיים למידול מצבים נורמליים ופתולוגיים אנושיים. האקורדיט Ciona intestinalis הוא אקורדיט חסר חוליות שצמח מאב קדמון משותף עם בעלי החוליות ועשוי לייצג תכונות בממשק בין חסרי חוליות לבעלי חוליות. תוכנית גוף משותפת עם הרכב תאי וגנומי פשוט בהרבה אמורה לחשוף קישורים לרשת ויסות גנים (GRN) וקריאות גנומיקה פונקציונליות המסבירות תופעות במצב בעלי החוליות. הגנום הקומפקטי של Ciona, שושלת עוברית קבועה עם מעט חלוקות ותאים גדולים, בשילוב עם כלים קהילתיים מגוונים מטפחים ניתוחים פונקציונליים יעילים של גנים באורגניזם זה. כאן, אנו מציגים כמה שיטות חיוניות עבור אורגניזם המודל המבטיח הזה, ששייך לקבוצת האחות הקרובה ביותר לחולייתנים. אנו מציגים פרוטוקולים לטרנסגנזה חולפת על ידי אלקטרופורציה, יחד עם נוקדאון גנים בתיווך מיקרו-הזרקה, המספקים יחד את האמצעים לחקר תפקוד הגנים ואלמנטים רגולטוריים גנומיים. אנו מרחיבים את הפרוטוקולים שלנו כדי לספק מידע על אופן השימוש במאגרי מידע קהילתיים בתכנון סיליקו של ניסויים רגולטוריים או פונקציונליים של גנים. מחקר לדוגמה מדגים כיצד ניתן להשיג מידע חדש על יחסי הגומלין, וכימותם, של גורמים עצביים נבחרים שנשמרו בין סיונה לאדם. יתר על כן, אנו מראים דוגמאות ללוקליזציה תת-תאית דיפרנציאלית בתאים עובריים, בעקבות אלקטרופורציה של DNA בזיגוטות Ciona. לבסוף, אנו דנים בפוטנציאל של פרוטוקולים אלה להיות מותאמים להפרעה גנטית ספציפית לרקמה בשיטות עריכת גנים מתפתחות. גישות in vivo ב-Ciona מתגברות על חסרונות עיקריים של אורגניזמים מודלים קלאסיים במסע לחשיפת מנגנונים משומרים בתוכנית ההתפתחות של האקורדים, הרלוונטיים למחקר תאי גזע, גילוי תרופות ויישום קליני לאחר מכן.

מבוא

לאחרונה, רצף הגנום רפרטוארי גן עבדו הפכו נגישים מספר אורגניזמים מודל. קביעת קישורים תפקודיים גן, לעומת זאת, וכיצד הקשרים הללו נטועים ב- DNA כדי לבצע פעילות תעתיק לאורך זמן עוברי ומרחב, להישאר אתגר גדול, במיוחד בקרב בעלי חוליות. המורכבות של אינטראקציות רגולציה ואת המורכבות של הגנום ^1,2, בעיקר בעלי חוליות, להאט ניתוחים פונקציונליים יעילים, בפרט ברמת ה- DNA in vivo. אכן, אין GRN מנותח כעת מן ההפריה לגמר, המדינה הבדיל סופני של האורגניזם המתפתח.

ג ascidian intestinalis מייצג אורגניזם מודל שבו כגון מלאה GRN מנתח עשוי להיות אפשרי. יש לו הגנום ללא כפילות טיפוסית מחסרי עם יתירות גן קטנה. חולייתנים, בניגוד עברו שני סיבובים של כפילויות הגנום כי havאלקטרוני אשר נוצר משפחות גנים וגיוון פונקציונלי גדולות אלא גם יתיר בין paralogs. הרצפים הקומפקטיים ציס רגולטורית (יחידות הבקרה של GRNs) של ג intestinalis, וכן שושלת עוברית בלתי משתנית עם תאים כמה מזכירי ג elegans. יתר על כן, עמדת פילוגנטי הייחודית כקבוצת אחות חסרת חוליות לבעלי חוליות בתוך המיתרנים מאפשרת תצפית התפתחותית, ברזולוציה הסלולר, של תכנית גוף chordate להרכיב ^3-6.

סוגיית המפתח המבטיחה את ההצלחה העתידית עידן הגנומיקה באורגניזמים מודל היא הדור של מספר רב של עבר הפרעות כמותית in vivo. התפתחות הטכניקה microinjection בביצים Ciona ^7, והאפשרות להשיג במהירות הרבה חיות טרנסגניות זמני על ידי electroporation ב vivo במאות Ciona zygotes ^8,9 כבר פריצת דרך גנומיקה תפקודית Ciona. הנה, אנחנו ראשונים להציג את טכניקת microinjection המייגעת יותר למיקוד גנים בודדים כי נשארה שיטת הבחירה של morpholino (MO) מציאת גן בתיווך, בעיקר של תמלילים אימהיים. oligos MO בדרך כלל למקד היוזם ATG או אתרי השחבור של RNA ולהפריע תרגום חלבון. לאחר מכן, אנו מראים כיצד electroporation בביצים מופרות של Ciona מאפשר למספר גדול של עוברים כדי להיות מנותח באופן כמותי, ובכך פתח השדרות של ניתוח יעיל של משפרי in vivo ו גישות פונקציה רקמות ספציפיות gain- או הפסד של, עם אפשרות למניפולציות סימולטני וניתוחים. בנוסף, אנו מראים כיצד כלי קהילת Ciona מנוצלים עבור בחיזוי סיליקון של אזורי רגולטוריים שיבוט היעיל של מסגרות קריאה פתוחה מלאה (ORFs) וקטורי ביטוי. לבסוף, אנו מדגימים localizations subcellular ההפרש של fluorescently מתויגאו שכותרתו חלבונים על ביטוי יתר ידי electroporation.

פרוטוקול

תכשירים 1. Microinjection ו Electroporation ב Ciona ביצים zygotes

1. כן 10 L מי ים מלאכותי עם HEPES (ASWH) עבור של עוברים. ממיסים 420 מ"מ NaCl, 9 KCl מ"מ, 10 מ"מ CaCl ₂ · 2H ₂ O, 24.5 מ"מ MgCl ₂ · 6H ₂ O, 25.5 מ"מ MgSO ₄ · 7H ₂ O, ו 2.15 מ"מ NaHCO ₃ במים מזוקקים פעמיים (DDH ₂ O) על ידי ערבוב בין לילה. הוסף 5 מ"מ HEPES pH 8.0, ולאמת / להתאים את ה- pH ל 8.0. אחסן את ASWH על 4 מעלות צלזיוס. לחמם אותו עד 18 מעלות צלזיוס ולסנן אותו עם נייר סינון לפני השימוש.
2. כן 20x פתרון dechorionation מומת: 20% נתרן thioglycolate, 1% pronase ב ASWH. אחסן 500 aliquots μl ב -20 ° C, ו לדלל לנפח סופי של 10 מ"ל ASWH לפני השימוש.
3. כן 15 עד 20 מנות תרבות עבור ביצים / עובר. יוצקים agarose 1% נמס ASWH לתוך 3.5, 5, 9 או 15 ס"מ בצלחות פטרי, ציפוי אותם בשכבה 1-2 מ"מ דק.תנו agarose לחזק לכסות את הצלחות עם ASWH. המניה אותם ב 4 מעלות צלזיוס למשך מקסימום 1-2 שבועות. החזר את ASWH לפני השימוש.
4. הכן מאכלי הזרקה מיוחדים.
   1. יוצקים שכבה 5-7 מ"מ עובי של 1% נמס agarose לתוך צלחת 5 ס"מ פטרי, ומניחים בתבנית על agarose (כגון סגירת נעילת מיקוד דבוק תלוש כיסוי פלסטיק) כדי לייצר חריץ על מיצוק של agarose שיכול להחזיק את הביצים. כן 4 עד 5 מנות הזרקה ומכסי ASWH. חנות ב 4 ° C ולהחליף ASWH טרי לפני השימוש. השתמש רק צלחות טריות להזרקה (מקסימום בת יום אחד).
5. הכן-galactosidase β (LacZ) חיץ מכתים: 1 מ"מ MgCl ₂ · 6H ₂ O, 3 מ"מ K ₄ [Fe (CN) _6] · 3H ₂ O, 3 מ"מ K ₃ [Fe (CN) _6] ב שנאגרו פוספט מלוחים (PBS) עם Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na ₂ HPO _4, 2 מ"מ KH _{2 4} PO, 0.05% Tween). אני חנותn בחושך ב 4 ° C. הכן LacZ המצע 5-Bromo-4-כלורו-3-indolyl SS-D-Galactopyranoside (X-gal, 10 U / ml) ב aliquots של 40 מ"ג / מ"ל ​​ב dimethylformamide (DMF) ומניות החנות ב -20 ° C עד להשתמש.
6. משרים טפטפות פסטר לילה במי ברז כדי למנוע את העוברים יידבקו.
7. כן מחטי הזרקה.
   1. הגדרת חולץ micropipette בתנאים כגון חום 425, למשוך 75, מהירות 75 וזמן 200 (ממבחן רמפת נימה של 415).
   2. משוך 4 עד 5 נימי זכוכית המכילה נימה לייצר 8 עד 10 מחטים ארוכות, בסדר סגורות בדרך כלל בקצה. אחסן את המחטים בקופסא מחט אבק חינם, המצורפת להכפיל דבק על תמיכה גבוהה, כדי למנוע את שבירת הטיפים אשר נוח למילוי מחט.
      הערה: בדוק את המחטים מתקבלות על ידי הזרקה כמה ביצים עם חיוני לצבוע ירוק (כמפורט בסעיף 6) ולהתאים את המחט מושך תנאים לקבלת צורת קצה המאפשרת מכויל ו repetitive הזרקת כמתואר 6.6.
8. כן פתרון זריקה. הכן 4 μl של פתרון ההזרקה, למשל, מורכב 1 μl של 2 מ"מ MO, 2 μl של 10 מיקרוגרם / חיוני לצבוע ירוק μl ו 1 μl DDH ₂ O. הוסף ריכוז סופי של 0.05-0.5 מיקרוגרם / μl כתרי mRNA או 20 ng / μl של ה- DNA פלסמיד על פי השאלה הניסיונית. לערבב היטב. שמור על קרח אם הפתרון מכיל mRNA.

2. אוסף של גמטות

1. לנתח Ciona מבוגרים ב 18 ° C מקוררים חדר עובר. השתמש במספריים קטנים להתחיל מהסוף המתנגדת סיפונים בצד של לנשוף (קצר) סיפון לפיו oviduct ואת לרוץ צינור הזרע.
2. לחשוף את oviduct ובעדינות עושים חתך השחלה באמצעות קצה של מספריים. תכניס את הביצים הנשפכות ישירות לתוך צלחת 6-היטב המכילה ASWH ידי הלחיצה על oviduct בעדינות עם המספריים הסגורים ג הסירו את למשלGS. מעבירים את הביצים הנותרות עם פיפטה פסטר ושטף מראש עם ASWH.
3. להפקיד את הביצים מחיות שונות בבארות שונות. שימו לב לאיכות הביצית מתחת למשטח הביתור.
   הערה: מפותח ביצים עגולות ורוד לצהוב מעט צבע. הם מוקפים מעייל בלתי תאי vitelline, הסיסי המהווה מרחב perivitelline מוגדר היטב סביב הביצה. הסיסי קשור תאי בדיקה תא הזקיק פנימה בצורת הכוכב שלה בבית שלה בחוץ. ביצים באיכות נמוכה לעתים קרובות חוסר מקום perivitelline או תאי הזקיק. הם להופיע בסיבוב פחות, יותר פרטני או שונה בצבע. ביציות לא מפותחים הם קטנים ויש להם צבע לבן כסוף.
4. חותך את צינור הזרע עם המספריים לאסוף זרע מרוכז לתוך צינור 1.5 מיליליטר בעזרת פיפטה פסטר נפרדת. פינת מהזרע בעלי חיים שונים (לפחות שתיים) לתוך הצינור אותו. זרע חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.

3.הַפרָיָה

1. אסוף זרע וביצים על 18 מעלות צלזיוס כמתואר בשלב 2.
2. הפעל את הזרע.
   1. הכן 1 מ"ל ASWH צינור 1.5 מ"ל ומערבבים עם 50 μl של 1 M טריס pH 9.5. לאחר מכן להוסיף 20 μl של זרע מרוכז ומערבבים בעדינות על ידי צינור היפוך.
   2. בדוק את הפעלת הזרע בטיפת הזרע הניחה על כיסוי של צלחת פטרי קטנה או שקופית זכוכית ולבחון מתחת למשטח הביתור. הזרמה צריכה להיות שחייה בטירוף.
3. הוסף 100-200 μl של פתרון הזרע המופעל היטב כל ביצים (המכילות בין 100 ל -1,000 ביצים), ומערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, כך שהביצים צפו בטווח הבינוני. חכה 10 דקות מבלי להזיז את העוברים.

4. Dechorionation של ביצים ועוברים

1. לדלל aliquot 500 μl של פתרון 20x dechorionation עד 10 מ"ל ב ASWH. הפעל פתרון dechorionation ידי הוספת מבחינת ירידה 200 μl של 2.5 M NaOH לפתרון dechorionation 10 מ"ל 1x. משקע חלבי יהווה. לערבב בעדינות על ידי צינור היפוך.
2. אסוף את הביצים או zygotes (לאחר 10 דקות לחכות בשלב 3.3) לתוך צינורות זכוכית בעזרת פיפטה פסטר. פינת הביצים 2 עד 3 חיות צינור אחד (סביב 1,000-5,000 ביצים / צינור). משקעים עם צנטריפוגות יד על ידי ספינינג במהירות גבוהה יותר (1,200 XG) במשך כ -20 שניות כדי ליצור גלולה העובר בתחתית של התחתית. לאט להפסיק בצנטריפוגה ולהסיר את ASWH עם פיפטה פסטר.
3. הוסף 4 מ"ל של תמיסת dechorionation מופעל על ביצים pelleted / zygotes בצינור אחד. להשעות את הביצים / zygotes ידי pipetting אותם בעדינות מעלה ומטה בעזרת פיפטה פסטרה ברז שטופל מים עקפה עם אגס גומי קטן. הפתרון צריך להפוך צהבהב לאחר 1-3 דקות.
4. בצע את dechorionation ידי הסרת aliquot קטן של ההשעיה ביצה / הזיגוטה dechorionating בעזרת פיפטה פסטר. להפקיד ירידה בשקופית ולבחון תחת s לנתחלהתמודד. שמור pipetting ביצים / zygotes למעלה ולמטה ולבדוק כל 20-30 שניות.
   הערה: תאי זקיק ראשית לנתק, אז הסיסית הופכת צהובה ואטומה, ובסופו של דבר זה מנתק מן zygotes. ורוד dechorionated ביצים / zygotes ישקעו לתחתית הצינור זכוכית. Dechorionation לא צריך לקחת יותר מהמחיר המקסימאלי. 5 דקות.
5. מלאו את הצינור עם ASWH פעם 50% של ביצים / zygotes הם dechorionated.
   הערה: מאוד בעדינות צנטריפוגה (8 XG) במשך כ 10-15 שניות מתאימות למהירות מאוד נמוכה מספיק כדי שקע הביצים / עובר dechorionated. לאט להפסיק בצנטריפוגה שלא לטרוד את הגלולה של ביצים / zygotes בתחתית של התחתית.
6. הסר כמעט כל הנוזלים מצינור הזכוכית לרבות החומר צף עם ביצי dechorionated באופן חלקי / zygotes ולהחליף ASWH. לאט pipet למעלה ולמטה כדי לשטוף צנטריפוגות בעדינות שוב כמו בשלב 4.2. לחלופין, לחכות zygotes להתיישב על ידי כוח הכבידה. לשטוף פעם נוספת עד ללא פסולת סיסית הוא אניEFT.
7. ביצי העברה / zygotes כדי לשטוף טריות תרבות מנות בעזרת פיפטה פסטר. שמור את zygotes (לא ביצים) בצפיפות נמוכה (סביב 200 עוברים לכל 10 ס"מ צלחת) כדי למנוע הידבקות שלהם יחד. תרבות העוברת לשלב הרצוי בטמפרטורות שבין 13 ו -20 מעלות צלזיוס. לחלופין, electroporate zygotes (שלב 5) או להזריק את הביצים המופרות (שלב 6).

5. Electroporation

1. להפרות את הביצים ואת dechorionate zygotes ב 18 מעלות צלזיוס כפי בסעיפים 3 ו 4. ספק בין 50 ל 400 ביצים לדגימה electroporation.
2. הכן את ה- DNA פלסמיד 50 μl ב 1.5 מ"ל צינור (מקסימום. פלסמיד דנ"א 100 מיקרוגרם ב 50 μl DDH ₂ O) ולהוסיף 200 μl 0.95 M מניטול. מערבבים היטב על ידי vortexing.
3. שדר וכבידה משקעים zygotes dechorionated צינורות siliconized 1.5 מ"ל. הסר את ASWH עד סימן 100 μl על הצינור.
4. המשך, וצמוד אליהם עבור כל צינור הזיגוטה כדלקמן: להוסיףפתרון ה- DNA / מניטול בעזרת פיפטה פסטר. לערבב בעדינות עם zygotes ומיד לקחת את ה- DNA / מניטול / ההשעיה הזיגוטה והעברה קובט electroporation 4 מ"מ.
5. מניחים את קובט מיד לתוך מחזיק electroporation ולתת הדופק יחיד של 16 מילי-שניות ב -50 V.
6. הסר את zygotes מן קובט באמצעות אותו פיפטה פסטר ופרשת אותם על צלחת תרבות המכילה ASWH הטרי ומסונן. פיפטה zygotes לפני שהם מתחילים ביקוע שלאחר ההפריה שעה 1 מסביב (hpf) על 18 מעלות צלזיוס.
7. שוטפים את פיפטה בין דגימות מבחנה של ASWH.
8. התרבות zygotes ב- C ° 15-20 בצפיפות נמוכה מספיק של כ -200 עוברים לכל 10 ס"מ צלחת להימנע דבק שלהם יחד.

6. Microinjection

1. כן Dechorionated ביצים עבור ההזרקה.
   1. Dechorionate את הביצים בנפרד, 2-4 חיות, כמפורט בסעיף 4. שמרו על הדואר המופרה ו dechorionatedGGS במנות תרבות המצופות agarose הקטן נפרדות. לשטוף את הביצים מספר פעמים את הכלים כדי להסיר את הלכלוך.
   2. מבחן לדשן קבוצות קטנות של ביצי dechorionated (סביב 50) מכל אחד במחוז. השתמש צלחת 5 ס"מ נפרד לכל אצווה ולהחיל 2 μl זרע מופעל (שלב 3.2). מערבבים היטב על ידי מתערבל את הכלים ופרש את הביצים בצלחת ידי הזזת מנות הצידה. שמור את הזרע וביצים יחד במשך כ -10 דקות בלי לזוז.
   3. לחסל מקסימום של זרע כדלקמן: להעביר את הביצים המופרות אל צלחת תרבות טריה או לשטוף פעמים עם ASWH הטרי. השאר את עוברי הביקוע מוטרדים עד שלב 32 תאים (ב 18 מעלות צלזיוס למשך כ -3 שעות לאחר הפריה). בחר ביצי מהאצווה פיתוח הטובה ביותר (האחוז למיטב הפרית הדפוס מהחשוף הרגיל ביותר) עבור microinjection.
2. הגדר את מחטי הזרקה.
   1. למילוי 4 מחטי הזרקה במצב אנכי כדי לאפשר הכובד flow לאורך הנימה. פתרון הפקדה 0.5 הזרקה μl (שלב 1.8) המכיל חיוני לצבוע ירוק בקצה האחורי של המחטים ממוקמות קצה מחט למטה. חכה הנוזלי למלא את קצה המחט בתחתית.
   2. מיקום מחדש של המחטים אופקיות למילוי אותם עם שמן מינרלים באמצעות מתכת דקה וארוכה או קצה פיפטה פלסטיק. לאט כיסוי הפתרון הזרקה עם שמן מינרלים לגרש את כל בועות האוויר בעת המילוי את המחט.
3. הגדרת את micromanipulator 18 ° C מקורר חדר.
   1. חבר את צינורות הפלסטיק של בעל מחט מזרק זכוכית 10 מ"ל מלא שמן מינרלי. למילוי הצינורות ואת בעל מחט עם שמן ולגרש את כל בועות אוויר.
   2. הכנס את מחט בעל מחט ומקם את המחזיק על micromanipulator.
   3. התאם את התנועה בעל מחט לאורך קו ישר בזווית של 45 מעלות ביחס לפני השטח.
4. אוריינט dechorionaביצי טד לאורך כניסת agarose של מנה הזריק כדי שהביצים ניתן להזריק אחד אחרי השני תחת מיקרוסקופ לנתיחה.
5. לשבור את קצה המחט, במידת הצורך, על ידי לחיצה על המחט בעדינות כנגד agarose או נגד פיסת להחליק כיסוי זכוכית להציב על agarose. מעט לחץ על כפתור המזרק כדי לוודא את קצה המחט פתוח (תוכן מחט ירוק יגרש).
6. להזריק את אחד ביצים המופרות על ידי אחד על ידי ההחדרה ראשונה את המחט לתוך הביצה ומעט aspirating לשבור את קרום הביצה ואחריו הזרקה. להזריק פתרון הזרקה ירוק לאמצע הביצה עד למקסימום של 1/3 קוטר התא. (זה מתאים כ 30 pl עבור קוטר הביצה של 140 מיקרומטר).
7. מעביר את הביצים מופרות המוזרקות אל צלחת תרבות טריה דגירה אותם 15-18 מעלות צלזיוס עד הפריה.
8. להפרות את הביצים הזריקו זרע מופעל טרי כמו הפריות הבדיקה (שלב 6.1.2). Eliminatea המרבי של הזרע על ידי העברת zygotes לצלחת תרבות טריה. מורחים את העוברים ואינם לטרוד אותם בשלבים מחשוף (עד שלב 32 תאים).
9. תרבות העוברת לשלב הרצוי בטמפרטורה המורכבת בין 13 ל 20 מעלות צלזיוס.
10. אסוף את העוברים על ידי מתערבל אותם באמצע הצלחת והעברת לתוך צינורות siliconized 1.5 מיליליטר. תקן כתם, או הר (שלבים 7 ו -8).
11. השווה את פנוטיפים השיג את העוברים מוזרק שליטה.
    הערה: הזרק MO שני, שאינה חופף שמכוון אותו התמליל להשיג פנוטיפים זהים. להציל את הפנוטיפ MO ספציפי (ים) עם mRNA שונה קידוד חלבון העניין שלך אבל זה לא מוכר על ידי MOS. הזרק MO מלא שנותן אין פנוטיפ.

7. LacZ מכתים

1. אסוף את העוברים בשלב רצוי siliconized 1.5 מיליליטר צינורות ותקנו אותם glutaraldehyde 0.2% ב 1 מיליליטר ASWH 15עד 30 מקסימום דקות.
2. לשטוף 2x 10 דקות עם 1 מ"ל 1x PBT.
3. לשטוף פעם במאגר 500 LacZ מכתים μl. החלף עם המצע X-Gal השלימו 1 מ"ל חיץ מכתים (השתמש 10 μl / מ"ל ​​של 40 מ"ג / מ"ל ​​X-Gal המניות). מעבירים את העוברים לתוך צלחת 12 גם להסתכלות טובה יותר של מכתים.
4. דגירה בחושך. וארי הדגירה מ -0.5 שעות הלילה בשעה 4 ° C, ב RT או 37 ° C תלוי בכוחו של הנהג להביע LacZ.
5. לשטוף את העוברים עד 4 פעמים ב 1 מ"ל 1X PBT להסיר חיץ מכתים.
6. פוסט לתקן במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם 2 paraformaldehyde% (PFA) ב 1 מ"ל 1x PBT או 0.2 glutaraldehyde% ב 1 מ"ל 1x PBT לפרשנות וויזואליזציה של העוברים מוכתם.

השמה 8. fluorescently Labelled Wmbryos

1. תקן את העוברים של השלב ההתפתחותי הרצוי עבור 20 דקות ב 2 PFA% ב 1 מ"ל ASWH.
2. לשטוף את העוברים 2x ב 1 מ"ל 1x PBT. הימנע מכל ירידי אוריור על ידי שמירה על העוברים בתנאי חושך.
3. העבר עד 50 עובר לשקופית אחת. להוציא לכל היותר PBT הראשון עם טפטפת ובזהירות עם מגבת נייר.
4. להוסיף 20-25 הרכבה בינונית μl.
5. הוספת coverslip ידי מיקומה בזווית (מצד אחד הראשונים) ולאט לאט להוריד אותו באמצעות חפץ מחודד (מחט, מלקחיים, קצה פיפטה) הימנעות בועות עד המדגם הוא מכוסה. תקן את coverslip בקצוות שלה באמצעות נקודות של לק שקוף.
6. חותם את coverslip כולו עם לק לאחר הייבוש. חנות בחושך ב -20 ° C.

תוצאות

Microinjection ללימודי רשת גנטי

עוברים של ascidian intestinalis Ciona מתאימים גם ללימודי רגולטוריות תפקודיים או גן גן ברמת שושלת תא עם רזולוציה הסלולר. mRNAs, MOS או התוויות ניתן microinjected לתוך ביצה מופרית או לתוך בלסטומרים הפרט הבא הפריה. הגן בתיווך MO מציאה באמצעות טכניקה microinjection המתואר בשלב 6. MOS שמתמקדים ה- mRNA של גנים נבחרים ולמנוע התרגום לתוך החלבון שלהם. MO בתיווך הפסד של פונקציה (LOF) של גנים התפתחותיים משנה את ביטוי מגוון רחב של גנים במורד הזרם, הכוללת חושף הצצה אל עובריים GRN ^10. ניתוחים כאלה Ciona את מתכונת רגולציה כולה העובר הראשון ¹¹ מטזואניים. איור 1 מציג דוגמא לאופן microinjectiעל נוצל כדי ללמוד את הרגולציה במעלה הזרם של ביטוי של גורם שעתוק -Myelin Ci נשמרת (Ci -MYT) בשלב gastrula עוברים Ciona. פיקוח על ידי כלאה באתרו (שאני עורך), ביטוי אנדוגני (איור 1 א, schematized באיור 1 א ') הוא ציין מבשר הצלחת עצבית 6 השורות, של בעיקר במוח (שורות III / IV, באדום) ואת חוט השדרה ( אני בשורה, בירוק). בנוסף, תקנת זרם Ci -MYT נותחה על ידי הזרקת MO מיקוד מספר גורמים אשר באות לידי ביטוי בתוך או בסמוך מבשרים עצביים לפני תחילת ביטוי Ci -MYT (-g באיור 1b). מציאה MO גורמים עובריים מוקדם, כגון Aa תיבת forkhead (Foxa-א) גורם שעתוק גורם הגדילה פיברובלסטים 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (איור 1b או 1c, בהתאמה) מבטלת הכוללת Ci -MYT ביטוי. גורמי שעתוק אחריםבאופן חלקי בלבד משפיעים על ביטוי Ci -MYT וכתוצאה מכך downregulation בתיווך MO משנה של מבשרי המוח (ראשי חץ כחול באיור 1D, F ו- G). לעומת זאת, Ci ביטוי -MYT מופעל ectopically על downregulation של קטרים (איור 1e, ראשי חץ אדומים), דבר המצביע על כך קטרי בדרך כלל מדחיק Ci -MYT ביטוי מבשרי חוט עצב לרוחב אלה.

Electroporation ללימודים פונקציונליים משפרים יעילים של גנים

Electroporation של DNA פלסמיד לתוך zygotes Ciona הוא שיטה יעילה transgenesis החולף וההתבוננות הבאה של שינויי פנוטיפי in vivo. בניגוד microinjection של mRNA, electroporation מאפשר ביטוי יתר רקמות ספציפי, שבו אזורי קידוד גן (ORFs, מסגרות קריאה פתוחות) באים לידי ביטוי תחת שליטההנהגה רקמות ספציפיות. אלה בדרך כלל מהווים אזורי ציס רגולטורית של גנים ידועים (כגון משפר brachyury להבעה מבשרת notochord ^8). לעומת זאת, electroporation הוא אינסטרומנטלי לניתוח היעיל של אזורי רגולטוריים רומן שבו גני כתב (LacZ או חלבון פלואורסצנטי ירוק, GFP) לחשוף את פעילותם in vivo. זרימת העבודה לזיהוי והניתוח בתיווך electroporation הבאה של אזור רגולטוריות כגון רומן (עבור Ci -MYT) מוצגת באיור 2.

רפרטואר עצום של נתוני קהילת Ciona, נגישים בדפדפנים הגנום ספציפיים ascidian ^12,13, כמו רשת Ascidian עבור בביטוי באתרו עוברי נתונים (אניס) ^23, נבדק לזיהוי סיליקו של אזורי רגולטוריים (איור 2 א). תגובת שרשרת פולימראז לאחר (PCR) שיבוט מבוסס של אזורים אלה לתוך וקטורים ביטוי מאפשר לבדיקה בתיווך electroporation in vivo. (תרשים 2B). דפדפן הגנום המסך-shot באיור 2A מראה את האזור במעלה הזרם של מודל תמליל KH עבור Ci -MYT (שלושה אקסונים ראשונים, בכתום, ושני אינטרונים גלויים). מסלולי דפדפן הגנום שונים ויסמנו את נתוני הגנום פונקציונליים ניבאו באזור זה, כגון immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נתונים ¹⁴ (כאן המוצגים עבור ZicL, אצבע -zinc Ci של L המוח הקטן), שימור רצף בין שני מיני Ciona קשורים ^15,24 או הנוקלאוזום התפוסה ^16,17 (מלמעלה למטה ב איור 2 א). באופן כללי, אזורי קידוד חלבון exonic הם שמורים ביותר (מסלול יישור באיור 2 א). פסגות שימור גבוה נוספות מופיעות אזורים ללא קידוד במעלה או בתוך אינטרון הראשון. שניים אלה הם חזו להיות חופשי הנוקלאוזוםccording כדי אלגוריתם מבוסס רצף ^16,17 (מסגרות אדומות איור 2 א) דבר המצביע על נגישות גורמי שעתוק. ואכן, צ'יפ-על-שבב אותות ¹⁴ עבור גורם שעתוק Ci -ZicL מחייב (פסים ירוקים באיור 2 א) מועשרים בשני באזורים שמורים אלה. יתר על כן, באמצעות ממשק ²⁵ שמחפש גורם שעתוק פוטנציאל אתרי הקישור, זיהינו אתרי ZIC ממוקם בתוך רצפי גנום בסימן Ci -ZicL שבב אשכולות (החצים הכתומים רצפים עם קו תחתון ZIC ליבות, איור 2 א). הכריכה של גורם שעתוק Ci -ZicL ב משומר וכצפוי הנוקלאוזום אזורים רגולטוריים ללא Ci -MYT עולה בקנה אחד עם downregulation הביטוי Ci -MYT שנצפו בניסויים מציאה בתיווך MO-הזרקת מיקוד ZicL (1D איור).

לאחר להרתיעכריית אזורים ציס פוטנציאל רגולטורית סיליקו לביטוי Ci -MYT, אלה PCR מוגבר של הדנ"א הגנומי Ciona והחדיר ידי רקומבינציה שיבוט לתוך הכתב LacZ פלסמידים ^19. בונה אז הם electroporated לביציות Ciona המופרית (תרשים 2B) ונותחו על פעילותם על ידי מכתים LacZ (איור 3).

איור 3 מראה כי על ידי כזה בגישת סיליקון ניתן היה לזהות שני רצפים רגולטורית ציס נפרדים כי לשחזר תחומי ביטוי Ci -MYT mRNA (השווה איור 1 א). באופן כללי, זמנים עוברים מהונדס electroporated עם ביטוי פסיפס צג פלסמיד דנ"א בתאים אלה שרק שלבו את ה- DNA. ביטוי הפסיפס LacZ מונע ובכך ידי pmyt-R3 וניתן למצוא בכל המבשרים כי גם להביע Ci (איור 3 א, ב, ראשי חץ סגולים ואדומים, בהתאמה). לעומת זאת, pmyt-R5 הוא פעיל רק אחורי (אני בשורה) מבשר צלחת עצבי החל בשלב neurula מאוחר יותר (איור 3c, ראשי חץ אדומים). שני אזורים ובכך לקודד שני היבטים במרחב ובזמן נפרד של ויסות הגנים Ci-שעון מלזיה. מעניין, אזורים והפיקוח הוא גם להכתים מבשרי נוסף לא לראות איש, בעיקר הקדמית ואת הצלחת עצבית לרוחב בשריר (איור 3 א, ב, ורוד, לבן, וראשי חץ צהובים, בהתאמה). כזה ביטוי רחב יותר עשוי להצביע על דיכוי אלמנטים שאינם כלולים שברי רגולטוריות המבודדים (כגון עבור קטרים שמדכא גורל עצבי לרוחב, לראות 1e איור) או לרמות ביטוי נמוכות מזוהות עם צבירהאות האנזימטית LacZ.

בנוסף ללימודים משפרים, electroporation ב Ciona גם מקל על הניתוחים התפקודיים של גני מקודדי Ciona ידי ביטוי היתר שלהם. אוסף גדול של ORFs באורך מלא Ciona זמין לקהילה, ויתר על כן היה מותאם orthologs אדם, כוללים גנים הקשורים למחלות ^18. גנים מסוימים או קבוצות של גנים מספרייה מלאה ORF cDNA התואם רקומבינציה-שיבוט זה (איור 2 ב) מועברים בקלות לתוך וקטורי יעד הכוללות מנהלי התקן מתאימים להתבטא בעוברים. שיבוטי ביטוי וכתוצאה מכך יכולים יתר על כן להיות שותף electroporated עם רגולטורית כתב ציס בונה לבדוק התפקיד המשוער שלהם הפעלה משפר. תרשים 2B ממחיש את הבידוד של שיבוטים מלאים ORF עבור שעתוק גורמי Ci -ZicL ו Ci- GATAa ו recombinatio שלהםn לתוך וקטורים יעד מותאם שעשויות להכיל ¹⁹ תגי translational (ונוס פלואורסצנטי ירוק למשל או hemagglutinin ויראלי (HA) -tag) ונהג רקמות ספציפיות כגון ידיד באזור הרגולציה גאטה (הנהג pfog) לביטוי מוקדם הפאן-ectodermal ¹⁵ השתמשו במחקר הנוכחי. השפעת ביטוי יתר Ci -ZicL ברקמות ectodermal ו neuroectodermal נותח על ידי שיתוף electroporation של pmyt-R3> LacZ ו pmyt-R5> כתבים LacZ (איור 3B ", ב '' ו ג ', ג' ', בהתאמה). ניתוחי electroporation שלנו מראים כי Ci -ZicL יוכל להפעיל ביטוי Ci -MYT דרך pmyt-R3 ואזורים משפרים pmyt-R5 הוא בונה הכתב הראו ביטוי LacZ אקטופי באזורי ectodermal (ראשי חץ ירוקים 3 ב איור ', ב' 'ו ג &# 39;, ג '',). כפי שניתן לראות בתרשים 3D, electroporation של DNA פלסמיד ב מאות ביצים Ciona מאפשר כימות סטטיסטית הרלוונטיים של השינויים ביטוי, מאויר pmyt-R3 אקטופי> ביטוי LacZ על ריכוז תלוי, פאן-ectodermal ביטוי Ci -ZicL.

Electroporation עבור in vivo לוקליזציה subcellular

איור 4 מתאר את לוקליזציה subcellular של גורמי שעתוק מתויג כאשר הביע על electroporation ב בלסטומרים ectodermal באמצעות בונה ביטוי מותאמים (schematized באיור 2B). על ידי C-סופני גורמי שעתוק תיוג (כגון Ci -GATAa) עם תג ונוס (איור 4 ב) או (איור 4C) HA-תג overexpressing אותם ברקמות ectodermal (pfog) נוכל להבחין כי in vivo, "Ci -GATAa הוא מקומי בעיקר גרעינים, כצפוי עבור גורם שעתוק, ואילו הביטוי ונוס הוא נמצא בכל מקום, כולל בציטופלסמה. ניסויים דומים ניתן לבצע כדי ללמוד את הדינמיקה של לוקליזציה subcellular לאורך זמן, של פרט או שילובים של גורמי שעתוק, ואולי חושפים שיתוף הלוקליזציה שלהם עם תגים שונים.

איור 1:. הערכת Ci תקנה -MYT ידי microinjection בביצים Ciona ביטוי mRNA Ci -MYT ב WT ו Morpholino (MO) מוזרק עוברים. (א) דפוס ביטוי WT של Ci -MYT בצלחת העצבית. (א ') ייצוג סכמטי של מבשר מוכתם בצלחת העצבית (NP). השורה I / II: גורל עצבי אחורי; בשורה III / IV: גורל עצבי קדמי; בשורה V / VI: גורל מָשׁוֹשׁ. ( .. g> ב - ז) ביטוי Ci -MYT על microinjection של MOS השונה עבור דריסת גנים הצביעו על כך להשתתף מוקדם Ciona GRN (תמונות מותאמות אימאי et al, 2006) ¹¹ Ci -MYT, Ci -myelin גורם שעתוק; WT, סוג בר; ראשי חץ כחול: אובדן אות -MYT Ci; ראשי חץ אדום: אות Ci -MYT חוץ רחמים. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר מתייחסים כל התמונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: Workflow עבור בחיפוש סיליקון של אזורים משפר רקומבינציה שיבוט transgenesis חולף ידי electroporation בעוברים Ciona (א) תמונת מצב מן אניס ²³ asci.דפדפן הגנום דיאן מזהה רצפים רגולטוריים במעלה הזרם של Ci - שעון מלזיה. מסגרות האדום לסמן שני אזורים רגולטורית ציס פוטנציאל, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) ו pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) שנבחרו לניתוח על ידי electroporation. שמות של שירים: בדיקות ZicL: שבב על שבב נתונים ^14; תעתיקי KH2012: Ciona intestinalis מודלי תמליל; יישור ציון Cs / Ci LastZ: שימור רצף בין savignyi Ciona (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) ^15,24; . סגל 2006 ניבא גרסת תפוסת הנוקלאוזום 1: חומוס מאומנת אלגוריתם חישוביות ידי סגל et al, 2006 ¹⁶ להחיל Ci כמו Khoueiry et al, 2010 ¹⁷ ברים ירוקים:.. Ci -ZicL שבב פסגות ^14; חצים כתומים: אתרים חזויים ZIC; GCTG: אתר הקישור ZIC הליבה. (ב) תוכנית להפקת בונה ביטוי יתר של Cionספריית cDNA באורך מלא ORF, recombined לתוך וקטורי יעד הכוללות נהגה רקמות ספציפיות (pfog) ותגיות חלבון ובהמשך שיתוף electroporated עם בונת כתב (כגון pmyt-R3> LacZ או pmyt-R5> LacZ) עבור in vivo הודעת Ci. - שעון מלזיה, Ci גורם שעתוק -myelin; Ci -ZicL, Ci -Zinc אצבע של גורם שעתוק L המוח הקטן;. pfog, אזור הרגולציה של Ci -Friend של Gata אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: עוברים Electroporated Ciona מראה Ci -ZicL במרחב ובזמן מושרה -regulation cis של Ci -MYT עוברים מוכתם LacZ אמצע gastrul.A (מ"ג) / מאוחרת gastrula (LG) או neurula בשלבים מוקדמים (HE) מוצגים שהיו שיתוף electroporated עם או pmyt-R3> LacZ או pmyt-R5> LacZ ואת מבנה השליטה (pfog> mCherry) או pfog> ZicL. נהג pfog ¹⁹ מתווכת אקטופי (פאן-חי) ביטוי ZicL ב האאקטודרם ו neuroectoderm וגורם כתם LacZ אקטופי בתאים אלה. (א) pmyt-R3 פעילות LacZ במ"ג / LG בשלב עוברי (חצים קטנים, בחלונית הימנית) או בטריטוריות סכמטי צבעוניים בהתאמה (עיגולים כחולים, פאנל מימין); נוף צמחי (טוב מאוד). השורה I / II: גורל עצבי אחורי; שורת III / IV: גורל עצבי קדמי; שורה V / VI: גורל מָשׁוֹשׁ. (ב) פעילות pmyt-R3 בשלבים eN ברקמות כמו בבית. (ב ') פעילות pmyt-R3 מחוץ לרחם על electroporation-שיתוף Ci -ZicL מותווה על ידי ראשי חץ ירוק. (ב '') עוברים זהה ב ', מוט החיה אוריינטציה עד (AN). ( pmyt-R5 פעילות LacZ בשלבים eN (ג ') פעילות pmyt-R5 מחוץ לרחם על electroporation-שיתוף Ci -ZicL מותווה על ידי ראשי חץ ירוק. (ג '') עוברים אותו כמו ג 'אבל במעלה התורן חיה אוריינטציה (AN). (ד) כימות של ניסויים נציג Ci -ZicL יתר הפעלת pmyt-R3 בריכוזים נמוכים. חוזרים ביולוגית אחת מיוצגת Ci -MYT, גורם שעתוק Ci -myelin;. Ci -ZicL, אצבע Ci -Zinc של גורם שעתוק המוח הקטן L; Ci -FOG, Ci -Friend של Gata; WT, סוג בר; מיליגאוס, אמצע gastrula; LG, בסוף-gastrula; צמוד, מוקדם neurula; AN, נוף בעלי חיים; VG, נוף צמחי; NLS LacZ, אות לוקליזציה גרעינית עבור LacZ. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4:. לוקליזציה subcellular דיפרנציאלי של חלבונים על electroporation לוקליזציה של ונוס מתוייגים או Hemagglutinin- (HA) -tagged חלבונים ביטוי יתר בתאים ectodermal באמצעות pfog הנהג ^19. (א - ג) תמונות דסק"ש. (א ', ב') מקבילה תמונות קרינה. (ג ') מקביל תמונת קרינה על תיוג היסטולוגית חיסוני עם TRITC. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר מתייחס כל התמונות. דסק"ש, התערבות ההפרש לעומת זאת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

ישנן שתי טכניקות גדולות כדי ליצור עבר Ciona מהונדסים: microinjection של רנ"א או דנ"א electroporation של ה- DNA. טכניקות אלו עבור הפרעות גנים העוברים Ciona שמשו ראשונות בשנת 1990 ^7,8 ומכאן ואילך שיפור ברציפות, ועכשיו מנוצלות Ciona (וסוגי ascidian אחרים) ²⁰ ברחבי עולם.

צעדים קריטיים בפרוטוקול

Transgenesis המוצלח לתוך הגמטות Ciona שנאספים בקלות מחיות מבוגרות תלוי בכמה גורמים קריטיים. איכות הגמטות תלויה בעונת ההשרצה (בדרך כלל ממאי עד דצמבר באוקיינוס ​​האטלנטי הצפוני, משתנית עם טמפרטורת מי חמצון), על האיכות מי ים האקווריומים (ב מליחות נכונה, מבוגרים להישאר בריאים במשך 2-4 שבועות) , ולבסוף על טיפול נכון הגמטות על חילוץ מן המבוגרים, כמפורט להלן עבור השלבים השונים שלפרוטוקול.

במהלך שלבים כנים, דוגרי טפטפות פסטרו עם מי ברז ימנע עוברים יידבקו מראש דגירה מי ים של בצלחות פטרי מצופה agarose יסיר חומרים רעילים שוחררו מן agarose. באופן כללי, מנות עשויות להיות מוכנים עד 2 שבועות לפני השימוש, לאחסן 4 ° C כדי למנוע התפתחות חיידקים ושטף טרי לפני השימוש. יום אחד זקן, מנות קטנות נראים הכי טובים עבור זריקות.

יעילות ואורך dechorionation הוא צעד חיוני בפרוטוקול כטיפול ממושך של ביצים / עובר יפגע בפיתוח. הכנה קפדנית (לא רועד) ואחסון נכון (ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע) לשמור על איכות פתרון dechorionation. פרוטאזות בתמיסה לאבד יעילות אם אחד מעורב באלימות מדי הכנה או לאורך זמן, בעיקר אם כל הזמן בטמפרטורת החדר למשך שעות / ימים ארוכים יותר. יש לנו אופטימיזציה שלב קריטי זה באמצעות פתרון dechorionation טרי נוחשהוכן aliquots הקפוא של פתרון מניות 20x.

טיפול נכון / עובר ביצי dechorionated שברירי חיוני גז או דקירה של עוברים תוך pipetting יהיה מזיק. כאשר pipetting, עובר נשמרים ככל האפשר בתרחיף (על ידי בעדינות 'נושב' נוזל להתערבל אותם ואחריו pipetting החלקה אך מהירה), תוך כדי לחיצה על פיפטה זכוכית אנכית ולא במצב אופקי. טיפול כאמור חל על כל השלבים pipetting לשטיפה, resuspension והעברת ביצים / עוברים פנימה והחוצה של צינורות, cuvettes או צלחות, לפני ואחרי קיבוע. עם קיבעון, טיפול מיוחד צריך גם לקחת כדי בהתקן פיפטה נפרד חי מול עוברי קבוע כדי למנוע רעילות מ- שרידי fixatives.

Microinjection הוא מסובך למדי Ciona ביצים / עוברים בשל גודלם הקטן ואת עמידותו של קרום vitelline ובביקורתיות תלוי בגודל טיפ אופטימיזציה שלמחט הזריקה, זווית מושלמת של הזרקה (תנועת מחט בשורה אחת, לאורך רדיוס הביצה) וכן שבירה, הוראות מכוונות היטב של קרום vitelline (על ידי שאיבה לפני שאיפה להזרקה). זו האחרונה הוא אפשרי רק אם בועות אוויר בוטלו לחלוטין מן צינורות ההזרקה המכיל שמן מינרלים להחלקת לחץ יניקה / הזרקה. בנוסף, את החלקים הקטנים ביותר של פסולת אבק או ביצה יסתמו את המחט, והם להימנע בקלות על ידי תנאי עבודה נקיים צעדי שטיפה לביצים לפני העברה על צלחת ההזרקה. הזרקת הודעה, העברת ביצים על מנות טריות תמנע השפעות רעילות מעובר מת שלא שרדו הליך ההזרקה.

פתרון בעיות

בעיות פוטנציאליות ההליך עשוי להיות מטופל על ידי הפתרונות הבאים. שיעורי הפריה נמוכים לנבוע הפעלת זרע מספיק, ניקיון ביצה נמוך או כרכי הפריה גדולים. השתמש freshly ונקווה ופחות בדילול הזרע. בדוק את התנועה זרע באקטיבציה. לשטוף את הביצים עם ASWH לפני הפריה כמתואר בשלב 4.2. הקטנת נפח המים ולהפחית את כמות ביצים לכל צלחת הפריה / טוב. עובר לאבד במהלך השלבים בהכנה יכול להימנע על ידי הוספת ירידה של פתרון dechorionation ומייעלים צנטריפוגות במורד הביצים / עובר undechorionated. Dechorionation זמן צריך להיות מותאם כמו ביצי dechorionated חלקית לא משקעים dechorionation הממושך הוא רעילים, בגרימה עובר להתפוצץ.

פיתוח אסינכרוני לנבוע זרע שיורית שפורסם במהלך לנתיחה. שמור על יצוות הביצה הופרד בעלי חיים שונים כדי למנוע הפריה הדדית בלתי מבוקרת. התפתחות לא תקינה יכולה להיות סיבות שונות. בתחילה ובסוף העונה, לאחר השמירה על העובר מאנשים שונים המופרדים, הקבוצות הטובות ביותר ניתן לבחור. הימנע מביך את העוברים על10 דק 'כי אחרי הפריה כדי למנוע הפרעות הפרדה ooplasmic שלהם. ודא כי עוברי לא להתחיל חלוקת בזמן שהוא מועבר כמו pipetting המפריד בין בלסטומרים אחות ותוצאות בעוברים חלקית. שימוש בזרע פחות ביצים dechorionated להימנע polyspermy. השתמש מוכנים טרי אבל שטפו מנות agarose. ודא שהתקן pipetting הוא מקבע בחינם. שמור עוברת בקרה שלא dechorionated ולא electroporated לזהות בה צעד פיתוח שובש. להשלים את העוברים עם אנטיביוטיקה אם זיהום ופירוק מתרחשים.

אם התקן הזריקה 'סתום' פתיחת מחט הזריקה עלולה להיות מאומתת על ידי גירוש חלק מתכולת המוכתם שלה. חומר סתימה עלול להימחק מעל ידי גרירת קצה המחט בעיון את agarose. בועות אוויר בצינור ההזרקה ו / או שיש להסירו מחט. שנה את המחט לשליטה טובה יותר את עוצמת הזריקה כמו לביתטיפ DLE עלול לשבור או לסתום יחד ההזרקה. יש לשטוף את הביצים ומניחים אותם בצלחת הזרקה נקיה אם פסולת שהצטברה המנה. צנטריפוגה הפתרון הזריק לפני מילוי מחטים טריות כדי משקעים כל חלקיקים או גבישים קטנים. לעזר גם מתאמן הזרקה רק עם צבע חיוני. בדוק את טכניקת ההזרקה בדישון ביצים מוזרקות ולא מוזרקים. לבסוף, התייעצות עם עמית מנוסה יכול להיות מועיל כדי לשפר את טכניקת ההזרקה.

כדי לשלוט על תופעות מחוץ היעד שני שאינם חופף MO והצל עם mRNA שונה שאינו מוכר על ידי MOS יכול לשלול נאמנו את השפעות פנוטיפי נוקב ב Ciona.

Microinjection: משמעות ומגבלות

Microinjection ב Ciona נוצל כדי ליצור לטיוטה הראשונה עבור רשת גנטית העובר כולו (GRN) בתוך chordate ^11. עם זאת, למרות הרמ"א כגוןהישג rkable, microinjection בעוברים Ciona יש מגבלות, בשל גודלו הקטן יחסית (0.14 מ"מ קוטר) של ביצים Ciona. בהשוואה לאל של מיני chordate אחרים שבם דנ"א זר / mRNA הוא הציג ידי microinjections, ביצי Ciona קשות יחסית להתמודד והשיעור העוברים Ciona מוזרק לכל ניסוי נותר נמוך (בממוצע 30 עד 50 עובר לכל ניסוי), פגיעת ניתוחים כמותיים. אף על פי כן, עבור גורמים אימהיים ומטרידים ב Ciona, microinjection של Mos היא השיטה של בחירה גם ללמוד מעורבותם הופעת zygotic התפתחות מן התא 16 עד 32 שלבי ^15. בנוסף, זה אפשרי אם כי הרבה יותר קשה microinject בלסטומרים בודדים עד שלב התא 16-32. לבסוף, microinjection נשאר הטכניקה היעילה ביותר להפקת עוברים מהונדסים (על ידי ה- mRNA או הזרקת DNA) במיני ascidian מלבד Ciona, עבורו מלא OptimiZed פרוטוקולים electroporation אינם קיימים.

Electroporation: משמעות ומגבלות

כדי להתגבר על מספרים נמוכים ואילוצים אחרים של microinjection, רוב הקהילה Ciona השתמשה electroporation של DNA פלסמיד שכן הוא פותח ופורסם כמו פרוטוקול אופטימיזציה וסטנדרטי ידי זלר et al. בשנת 2004 ^9. ואכן, אלפי עוברים מהונדס Ciona יכול להיווצר בתוך שעה אחת עם עד 500 עוברים electroporated בו זמנית קובט אחד באמצעות הדופק יחיד 50 V של 16 מילי-שניות. הגישה של יצירת מספרים מסיביים של עוברים מהונדסים הוא עדיין ייחודית בין אורגניזמים מודל chordate. הידיעה הביאה Ciona שיכירו במהירות כמערכת מודל עוצמה לביצוע in vivo מנתח של אזורים רגולטורית ציס פוטנציאליים לוקליזציה הסלולר / subcellular, כפי שהודגם כאן.

למרות electroporatiעל ב zygotes Ciona חוללה מהפכה באופן מהותי לתחום המחקר chordate GRN, הטכניקה בכל זאת כמה פרצופים גבולות. ראשית, פלסמידים מוצגים זמניות לעוברי Ciona ורוב עוברים בירושה כפי הנראה מערכי extrachromosomal, מה שהופך את היציבות של ה- DNA פלסמיד electroporated ספקולטיבי. יתר על כן, זה מאוד קשה, ואולי אף בלתי אפשרי, לשלוט על עותקים של פלסמידים electroporated כי יילקחו לכל הזיגוטה, ובכך וכתוצאה מכך תנודות פנוטיפי. בעיה נוספת מקשה לפרש תוצאות electroporation היא תופעה שאנו קוראים פסיפס. פלסמיד דנ"א Electroporated ניתן לקחת עד בנקודות שונות של העובר בשלב אחד התא; המכרז קובע אילו וכיצד בחוגים רבים של הזיגוטה יקבלו פלסמיד הנורשים ידי בלסטומרים צאצא. וריאציות כאלה בבירור להפוך את הפרשנות להשפעות כמותיות יותר קשה. עם זאת, רוב הבעיות שמגיעות עם electroporaהשתנות tion נפתרות על ידי כמות מתאימה של דגימות ביולוגיות, עם ספירה וסטטיסטיקות של LacZ (או GFP) תאים חיוביים, אשר הוא בר השגה בקלות תצווה אחת.

צדדי ואת הפוטנציאל של electroporation עבור הנדסה גנטית

Electroporation בסופו של דבר מאפשר הקרנת אמצע תפוקה של אזורי רגולטורית ציס פוטנציאליים ניתוחים כמותיים של תפקוד גן המשובט פעם לתוך פלסמידים כתב או ביטוי. בשל הגנום Ciona הקומפקטי, זיהוי שיבוט של אזורי רגולטוריים פוטנציאל הוא פשוט למדי ^3. אסטרטגיה באמצעות השפע של נתוני קהילה מודגמת באיור 2A. שיבוט של פלסמידים קידוד כתב גן הוא קל עוד יותר על ידי הדור של Ciona מותאם, סוויטות וקטור תואמות GATEWAY ¹⁹ ובאורך מלא תואם ספריית ORF ^18. שני הכלים הם העומדים לרשות הקהילהלאפשר רקומבינציה אנזים ללא יעיל, הגבלה של נהגי רגולטוריות אזורי קידוד, כמתואר באיור 2B.

בשנים האחרונות, electroporation הותאמה בהצלחה להשיג מניפולצית גן במיקוד רקמה עם פלסמידים מבטאי כלי עריכת גן כמו רכיבי CRISPR / Cas9 בשליטה נהגית רקמות ספציפיות ^21,22. גישות כאלה תקדמנה ההבנה שלנו במהירות של הדינמיקה של GRNs ואת מנגנוני איתות נשמרים באופן פוטנציאלי, כוללים קודים גורמים שעתוק המעורבים ביצירת רקמות היציאה מתפשטת מן pluripotency. יתר על כן, loss- רקמות ספציפיות או לזכות של פונקציה גישות (על ידי CRISPR / Cas9 או על ידי ביטוי יתר) באמצעות electroporation יהיה אינסטרומנטלי ללמוד orthologs Ciona של גנים של מחלות הקשורות אדם. ואכן, קטלוגים עבור orthologs Ciona של גנים של מחלות האדם באורך מלא שלהם ORF קידוד שיבוטים הם בקלות available לניתוח ב Ciona ^{1 8.} בשל הכפילויות הרחבות הגנום חוליות, רוב הגנים האנושיים להחזיק paralogs מיותר מבחינה תפקודית אשר מקשה על ניתוחים של גן פונקצית ^1. Ciona להיות מערכת פשוטה עם הסדר רקמות chordate הטיפוס זחלים צריכים לחשוף תפקידים בסיסיים של כל כך חשובים, לעתים קרובות גנים נשמרים מבחינה תפקודית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מעבדה עם טמפ' קבועה (~18 ° ג)			לעבודת עובר
Ciona intestinalis מבוגרים	UPMC - Station Biologique, Roscoff, France		לאיסוף גמטות
NaCl	Roth	3957.1	עבור ASWH
KCl	Roth	6781.1	עבור ASWH
CaCl2x2H2O	Roth	A119.1	עבור ASWH
MgCl2x6H2O	Roth	2189.1	עבור ASWH
MgS04x7H2O	Roth	P027.2	עבור ASWH
NaHCO3	Roth	6885.1	עבור ASWH
Hepes	רוט	HN78.3	עבור ASWH
נתרן תיוגליקולט	סיגמא	MZ-6	לדכוריונציה
פרונאז	סיגמא	T0632-100G	לדכוריונציה
D-מניטול	סיגמא אולדריץ'	M9546-250G	לאלקטרופורציה
DNA פלסמיד (הכנה >1µ g/µ l)	Macherey-Nagel	740410.100	עבור אלקטרופורציה או מיקרו-הזרקה
אגרוז	כל ספק		לציפוי כלי תרבית עוברים
כלי פטרי מפלסטיק	VWR	612-2079	מצופה 1% אגרוז ב- ASWH, מכוסה
במספריים קטנות	כל ספק		לניתוח גמטות
NaOH	רוט	6771.1	להפעלת תמיסת דכוריונציה
Tris	רוט	5429.3	1 מ' pH 9.5, להפעלת זרע
פיפטות פסטר	VWR	612-1701	מטופל על ידי טבילה במי ברז למשך 12 שעות לפחות
צנטריפוגה ידנית	Hettich Zentrifugen	1011	השתמש בצינורות צנטריפוגה מזכוכית
1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	סיגמה	T3406-250EA
2 מ"ל צינורות אפנדורף	סיגמא	T3531-200EA
אלקטרופורטור מרובע	Bio Rad Gene Pulser Xcell
קובטות אלקטרופורציה 4 מ"מ	Eurogentec	CE-0004-50
Coverslips	Sto Premium	PR248212600
זכוכית שקופיות	VWR	ECN 613-1551
Glutaraldehyde	Sigma	G6257-10ML	לקיבוע ב-LacZ מכתים
Paraformaldehyde	Sigma	P6148-500G	לקיבוע דגימות פלורסנט
Vectashield	Vector	H-1000	להרכבת דגימות פלואורסצנטיות
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside)	Roth	2315.2	מצע LacZ; מלאי ב-40 מ"ג/מ"ל DMF (Dimethylformamide)
K4Fe(CN)6• 3H2O	Merck	4984	עבור מאגר צביעה LacZ
K3Fe(CN)6	Merck	4973	עבור מאגר צביעה של LacZ
Na22HPO4	Roth	4984.2	עבור PBT
KH2PO4	Roth	3904.2	עבור PBT
Tween	Sigma	SLBJ5103V
לשמן מינרלי	Sigma	M8410	נבדק תרבית עובר
צבע חיוני	מהיר ירוק סיגמא	F7251	למיקרו-הזרקה; 10 ומיקרו; g/µ l
חולץ מיקרופיפטה (בוער / חום)	מכשירי סאטר	דגם P-97	למשיכת מחטי הזרקה
נימי זכוכית בורוסיליקט GC100TF-10	מכשירי הרווארד בע"מ בריטניה	30-0038	1.0 מ"מ OD x 0.78 מ"מ תעודת זהות, המכיל נימה, למיקרו-הזרקה
מיקרומניפולטור	Narishige	MWS-2	מערכת הידראולית שמן תלת צירית; לתנועה עדינה תלת מימדית במהלך ההזרקה
מחזיק הזרקה	Narishige	1M-H1	להחזקת מחטי הזרקה, כל המערכת מלאה בשמן מינרלי
כל מזרק זכוכית	Walter Graf & Co GmbH & חברת KG	מס' 95199.10427A4	10 מ"ל FortunaOptima; מלא בשמן מינרלי, לכוונון עדין של לחץ מיקרו-הזרקה
מורפולינוס	GeneTools LLC, Pilomath, OR, ארה"ב		הזרקה ב-0.25-0.5 מ"מ
mRNA מכוסה	אמביון mMessage ערכת		הזרקה ב-0.05-0.5&מיקרו; g/µ l
		פלסמיד	ב-20 ng/µ l
ערכת שיבוט רקומבינציה	Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen	11789-013
ערכת שיבוט רקומבינציה	Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen	11791-019
נוגדן תג אנטי-HA	abcam	ab9110	לאימונופלואורסצנטי, השתמש ב-1:400 ב-3% BSA/PBT
TRITC נוגדן נגד ארנב עז	ג'קסון	111-025-144	עבור אימונופלואורסצנטי, יש להשתמש ב-1:300 ב-3% BSA/PBT