הגדרה ניסיונית מקורי לחימום תאים בצלחת תרבות באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף הקרנת לייזר מוצג כאן. באמצעות שיטה זו, התגובות הביולוגיות של פיגמנט רשתית אפיתל (RPE) תאים לאחר חשיפות תרמיות שונות ניתן לחקור.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה מקורית לחמם תאים בתרבית באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף גל tholium להערכה ביולוגית הוא הציג כאן. קרינת לייזר תוליום נקלט מאוד על ידי מים, ואת התאים בחלק התחתון של צלחת התרבות מחוממים באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי לייזר עם קוטר של 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס"מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה, כך קוטר קרן הלייזר הוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ"מ). על ידי שמירה על כמות עקבית של המדיום תרבות בכל ניסוי, אפשר להקרין את התאים עם עלייה בטמפרטורה לשחזור מאוד.
כדי לכייל את עליית הטמפרטורה ואת התפוצה שלה בצלחת אחת התא התרבות עבור כל הגדרה כוח, הטמפרטורה נמדדה במהלך 10 s של הקרנה בעמדות שונות ברמה התאית. חלוקת הטמפרטורה יוצגה באמצעות תוכנת גרפיקה מתמטיתתוכנית, ואת התבנית שלה על פני צלחת התרבות היה טופס גאוס. לאחר הקרנת לייזר, ניסויים ביולוגיים שונים יכולים להתבצע על מנת להעריך תגובות תא תלוי טמפרטורה. בכתב היד הזה, מכתים הכדאיות ( כלומר, הבחנה בין תאים חיים, אפופטוטיים, מתים) הוא הציג כדי לסייע לקבוע את טמפרטורות הסף אפופטוזיס התא ומוות לאחר נקודות שונות בזמן.
היתרונות של שיטה זו הם דיוק של הטמפרטורה ואת הזמן של חימום, כמו גם יעילות גבוהה שלה תאים חימום בתא שלם תרבות התא. יתר על כן, הוא מאפשר ללמוד עם מגוון רחב של טמפרטורות ומשך זמן, אשר יכול להיות נשלט היטב על ידי מערכת הפעלה ממוחשבת.
מבוא
הבנת התגובות הביולוגיות לתאים תלויי טמפרטורה היא בעלת חשיבות רבה לטיפולי היפרתרמיה מוצלחים. לייזר photocagulation לייזר עם לייזר תרמי, המשמשים אופתלמולוגיה, הוא אחד הטיפולים לייזר הוקמה ביותר ברפואה. אור גלוי, בעיקר מ אור ירוק אור צהוב, משמש בטיפול לייזר ברשתית. האור הוא נספג מאוד על ידי מלנין בתאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) תאים, המהווים את monolayer התא החיצוני של הרשתית. יש לאחרונה התעניינות בקרב רופאים וחוקרים בקרינה תרמית קלה מאוד (photocagulation תת גלוי) כאסטרטגיה טיפולית חדשה עבור סוגים שונים של הפרעות רשתית 1 , 2 . בעקבות מגמה זו, האינטרס שלנו הוא תת חיטה תת תאים....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות תא RPE
- בידוד של תאים RPE מעיניים חזירי
- השג עיניים טריות מחורצות טרי מבית המטבחיים המקומי. שמור אותם מגניב (4 ° C) בסביבה חשוכה.
- הסר רקמות תאיים עם מספריים להשרות את העיניים בתמיסה חיטוי במשך 5 דקות.
- מניחים את העיניים במי מלח פוספט מעוקרים ללא סידן ומגנזיום (PBS (-)) עד לשימוש.
- ב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חלוקת טמפרטורה לאחר הגדרות צריכת חשמל שונות
כל ההתפתחויות טמפרטורה עבור כל הקרנה אחת היו פיקוח בכיול הטמפרטורה. מנתונים אלה, הטמפרטורה המקסימלית בנקודה הנמדדת הושגה ומוגדרת כ- T max (° C). כפי שמוצג בתרשים 3A , התוכנית בוצעה בנקודת זמן כאשר צלחת התרבות הונח על צלחת החימום. לאחר 140 "זמן לחימום מראש 1", אשר היה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהתייחסות לתגובות תאולוגיות ביולוגיות הקשורות לטמפרטורה, לא רק הטמפרטורה, אלא גם משך הזמן של הטמפרטורה המוגברת, היא בעלת חשיבות, שכן רוב התהליכים הביוכימיים תלויים בזמן. במיוחד בתחום של היפרתרמיה המושרה בלייזר ברפואת עיניים, בשל טווח הזמן הקצר - בין אלפיות השנייה לשניות - קשה לחקור תופעות תרמיות תאיות עם בקרת טמפרטורה מדויקת. לכן, תוכנית הקרנה בלייזר מתאים למודל התרבות התא, עם מערכת הפעלה המאפשרת בקרת טמפרטורה קפדנית זמן שליטה. ההערכה הביולוגית של תגובות התא לאחר חשיפה תרמית, כגון.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לגלות.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (BMBF) (מענק # 13GW0043C) וכן משרד אירופי של מחקר ופיתוח חלל (EOARD, מענק # FA9550-15-1-0443)
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| דולבקו' s Modified Eagle' s בינוני - גלוקוז גבוה | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | הוסף (2)-(4) לפני השימוש. חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש. |
| תמיסה אנטי-פטריית אנטיביוטית (100 ופעמים;) | סיגמא-אולדריץ' | A5955-100 מ"ל | מכיל 10,000 יחידות פניצילין, 10 מ"ג סטרפטומיצין ו-25 μ g אמפוטריצין B ב-1 מ"ל. יש להוסיף 5.5 מ"ל בבקבוק בינוני של 500 מ"ל (1) לפני השימוש. |
| נתרן פירובט (100 מ"ל) | סיגמא-אולדריץ' | S8636-100 מ"ל | הוסף 5.5 מ"ל בבקבוק בינוני של 500 מ"ל (1) לפני השימוש (ריכוז סופי: 1 מ"מ) |
| סרום חזיר | סיגמא-אולדריץ' | 12736C-500 מ"ל | הוסף 50 מ"ל בבקבוק בינוני של 500 מ"ל (1) לפני השימוש (סופי: 10%) |
| מי מלח חוצצים פוספט (PBS) | סיגמא-אולדריץ' | D8537-500 מ"ל | |
| טריפסין מלבלב חזיר | סיגמא-אולדריץ' | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R& D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| <חזק>ציוד | |||
| תוליום לייזר | Starmedtec GmbH | אב טיפוס | 0-20 W |
| 365 מ"מ סיבים בקוטר ליבה | רכיבי לייזר גרמניה | CF01493-52 | |
| צמד תרמי | אומגה הנדסה בע"מ | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| צלחת חימום | MEDAX | ||
| קורא מיקרופלייט ( ספקטרופלואורומטר) | מכשיר מולקולרי | Spectramax M4 | |
| הומוגנייזר תאים | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| תוכנה מתמטית | The Mathworks. Inc | MATLAB שחרור 2015b | |
| פלטפורמת עיצוב מערכת | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
מקורות
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
