הגדרה ניסיונית מקורי לחימום תאים בצלחת תרבות באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף הקרנת לייזר מוצג כאן. באמצעות שיטה זו, התגובות הביולוגיות של פיגמנט רשתית אפיתל (RPE) תאים לאחר חשיפות תרמיות שונות ניתן לחקור.
מאמר שיטה
רציף גל תוליום לייזר עבור תאים תאים מתורבת לחקור אפקט תרמי נייד
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטה מקורית לחמם תאים בתרבית באמצעות 1.94 מיקרומטר גל רציף גל tholium להערכה ביולוגית הוא הציג כאן. קרינת לייזר תוליום נקלט מאוד על ידי מים, ואת התאים בחלק התחתון של צלחת התרבות מחוממים באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי לייזר עם קוטר של 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס"מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה, כך קוטר קרן הלייזר הוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ"מ). על ידי שמירה על כמות עקבית של המדיום תרבות בכל ניסוי, אפשר להקרין את התאים עם עלייה בטמפרטורה לשחזור מאוד.
כדי לכייל את עליית הטמפרטורה ואת התפוצה שלה בצלחת אחת התא התרבות עבור כל הגדרה כוח, הטמפרטורה נמדדה במהלך 10 s של הקרנה בעמדות שונות ברמה התאית. חלוקת הטמפרטורה יוצגה באמצעות תוכנת גרפיקה מתמטיתתוכנית, ואת התבנית שלה על פני צלחת התרבות היה טופס גאוס. לאחר הקרנת לייזר, ניסויים ביולוגיים שונים יכולים להתבצע על מנת להעריך תגובות תא תלוי טמפרטורה. בכתב היד הזה, מכתים הכדאיות ( כלומר, הבחנה בין תאים חיים, אפופטוטיים, מתים) הוא הציג כדי לסייע לקבוע את טמפרטורות הסף אפופטוזיס התא ומוות לאחר נקודות שונות בזמן.
היתרונות של שיטה זו הם דיוק של הטמפרטורה ואת הזמן של חימום, כמו גם יעילות גבוהה שלה תאים חימום בתא שלם תרבות התא. יתר על כן, הוא מאפשר ללמוד עם מגוון רחב של טמפרטורות ומשך זמן, אשר יכול להיות נשלט היטב על ידי מערכת הפעלה ממוחשבת.
מבוא
הבנת התגובות הביולוגיות לתאים תלויי טמפרטורה היא בעלת חשיבות רבה לטיפולי היפרתרמיה מוצלחים. לייזר photocagulation לייזר עם לייזר תרמי, המשמשים אופתלמולוגיה, הוא אחד הטיפולים לייזר הוקמה ביותר ברפואה. אור גלוי, בעיקר מ אור ירוק אור צהוב, משמש בטיפול לייזר ברשתית. האור הוא נספג מאוד על ידי מלנין בתאי אפיתל פיגמנט רשתית (RPE) תאים, המהווים את monolayer התא החיצוני של הרשתית. יש לאחרונה התעניינות בקרב רופאים וחוקרים בקרינה תרמית קלה מאוד (photocagulation תת גלוי) כאסטרטגיה טיפולית חדשה עבור סוגים שונים של הפרעות רשתית 1 , 2 . בעקבות מגמה זו, האינטרס שלנו הוא תת חיטה תת תאים RPE תחת בקרת טמפרטורה מדויקת, טכניקה המכונה טמפרטורה מבוקרת פוטותרמית (TC-PTT).
אופטו אחרוניםטכנולוגיה אקוסטית של המכון שלנו אפשרה את המדידה בזמן אמת של עליית הטמפרטורה באתרי מוקרן הרשתית. זה מאפשר שליטה על עליית הטמפרטורה במהלך קרינה 3 . עם זאת, מאז היפרתרמיה תת-קטלנית על הרשתית, הנגרמת על ידי חימום תאים RPE תת תת קטלני, לא נחשב בעבר בשל חוסר האפשרות של מדידה ושליטה על הטמפרטורה, תגובות תא תלוי טמפרטורה של תאים RPE בעקבות הקרנה בלייזר תרמי יש נחקרו מעט מאוד עד כה. יתר על כן, לא רק ההבדל הטמפרטורה לא נדונו בפירוט, אלא גם את ההבדל בהתנהגות התא של תאים ששרדו לאחר הקרנה תת קטלני קטלני. לכן, כדי לאסוף ראיות מדעיות על TC-PTT מבוססי טיפולים, אנו שואפים להבהיר את התאים תלויי הטמפרטורה תא RPE התא והמנגנונים שלהם באמצעות setups ניסיוני חוץ גופית .
עבור tמטרתו, יש צורך להקים התא חימום המערכת העומדת בתנאים הבאים: 1) אפשרות להגדלת הטמפרטורה מהר, 2) זמן מבוקרים מדויק טמפרטורה, 3) מספר גבוה יחסית של תאים שנבדקו עבור ניסויים ביולוגיים . לגבי שיטת החימום, לייזר קליני, כגון תדר Nd.YAG הכפול תדר (532 ננומטר), הוא למרבה הצער לא מתאים לתא התרבות התא. הסיבה לכך היא מספר מופחת של מלנוזומים בתאי RPE תרבותי. הקליטה של אור הלייזר עשויה להיות בלתי-הומוגנית, ועליית הטמפרטורה ברמת הסלולר משתנה בין ניסויים, גם כאשר מוקרנת עם אותה עוצמת קרינה. מספר מחקרים קודמים דיווחו על שימוש בנייר שחור מתחת לתחתית התבשיל במהלך הקרנה 4 או שימוש במלנוזומים נוספים, כי הם phagocytized על ידי תאים התרבות לפני הניסויים 5 , 6 . הרבה מבמבחנה ביולוגית מחקרים להערכת תגובות התא המושרה היפרתרמיה בוצעו באמצעות צלחת חמה, אמבט מים, או CO 2 חממה עם הגדרת טמפרטורה 7 . שיטות אלה דורשות תקופת חימום ארוכה כי זה לוקח קצת זמן ( כלומר, כמה דקות) כדי להגיע לטמפרטורה הרצויה. יתר על כן, בשיטות אלה, קשה להשיג היסטוריה תרמית מפורט ( כלומר, טמפרטורה כפול זמן) ברמה התאית. יתר על כן, הטמפרטורה בין התאים בעמדות שונות בצלחת תרבות אחת עשויים להשתנות בשל דיפוזיה טמפרטורה משתנה. ברוב המקרים, מידע טמפרטורתי וזמני מרחבי זה במהלך היפרתרמיה לא נלקח בחשבון לצורך ניתוחים ביולוגיים, למרות שתגובת התא הביולוגי עלולה להיות מושפעת בצורה קריטית מהטמפרטורה ומהמשך הזמן של הטמפרטורה המוגברת.
כדי להתגבר על בעיות אלה, contiהלייזר גל thulium נוזל שימש כאן כדי לחמם את התאים. קרינת לייזר תוליום (λ = 1.94 מיקרומטר) הוא נספג מאוד על ידי מים 8 , ואת התאים בחלק התחתון של צלחת תרבות הם מגורה תרמית אך ורק באמצעות דיפוזיה תרמית. סיבי הלייזר עם קוטר 365 מיקרומטר מוגדר כ 12 ס"מ מעל צלחת התרבות, ללא כל אופטיקה בין לבין. קוטר קרן הלייזר מפריד כזה שהוא כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות (30 מ"מ) על פני השטח של המדיום תרבות.עם כמות עקבית של המדיום תרבות, אפשר להקרין את התאים עם עליית הטמפרטורה של הדירות גבוהה. הגדרות כוח משתנה מאפשרות הקרנה עם עד 20 ואט, והטמפרטורה בינונית ברמה התאית יכולה להיות מוגברת עד ΔT ≈ 26 ° C ב 10 שניות.
על ידי שינוי תנאי הקרנה, ניתן גם לשנות את פרופיל קרן הלייזר כדי לשנות את הטמפרטורה distributiעל בצלחת תרבותית. לדוגמה, ניתן לחקור עם הפצה טמפרטורה כמו גאוס, כמו במחקר הנוכחי, או עם חלוקת טמפרטורה הומוגנית. זה האחרון עשוי להיות מועיל לחקר ההשפעות של התגובות הטמפרטורה תלויי תא יותר ספציפי עבור טמפרטורות קטלניות מתחת לטמפרטורות, אבל לא ללחץ מוות של תאים או תגובות ריפוי הפצע.
בסך הכל, קרינה לייזר תוליום עשוי לאפשר את החקירה של סוגים שונים של גורמים ביולוגיים, כגון ביטוי גנים / חלבון, קינטיקה מוות של תאים, התפשטות תאים, ופיתוח פונקציונליות התא, לאחר חשיפות תרמיות שונות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תרבות תא RPE
- בידוד של תאים RPE מעיניים חזירי
- השג עיניים טריות מחורצות טרי מבית המטבחיים המקומי. שמור אותם מגניב (4 ° C) בסביבה חשוכה.
- הסר רקמות תאיים עם מספריים להשרות את העיניים בתמיסה חיטוי במשך 5 דקות.
- מניחים את העיניים במי מלח פוספט מעוקרים ללא סידן ומגנזיום (PBS (-)) עד לשימוש.
- באמצעות אזמל, לחדור את sclera על 5 מ"מ האחורי אל ליבת הקרום. משמרים את החלק הקדמי של העין על ידי חיתוך במספריים לכל אורך הדרך, במקביל לאיבר הקרום.
- הסר את החלק הקדמי של העין ( כלומר, הקרנית ואת העדשה) ואת זגוגית. הוסף 1 מ"ל של PBS (-) בעדינות להסיר את הרשתית העצבית.
הערה: זה "כוס העין", המורכב sclera, choroid, ו RPE, מוכן כעת. - הוסף מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) 0.25% טריפסין ב PBS (-) על כוס העין. התאם את עוצמת הקול כך כ 80% של כוס העין מלא פתרון זה טריפסין.
- דגירה את כוס העין עם פתרון טריפסין 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- הסר את כוס העין מן האינקובטור ולהחליף את הפתרון טריפסין 0.25% עם פתרון PBS (-) עם 0.05% טריפסין + 0.2% ethylenediaminetetraetetic מלח טטרסודיום (EDTA · 4N). דגירה את כוס העין באינקובטור במשך 45 דקות.
הערה: לאחר 45 דקות, תאי RPE יהיה גם מחובר רק רופף קרום של ברוץ או כבר מנותקים וצפים פתרון טריפסין-EDTA. - איסוף תאים RPE ידי pipetting עדין. לאסוף את התאים ואת הפתרון בצינור חרוטי מלא 10 מ"ל של המדיום תרבות (DMEM גלוקוז גבוהה עם L- גלוטמין), כולל 10% בסרום חזיר, אנטיביוטיקה / antimycotic, pyruvate נתרן (1 מ"מ).
הערה: הסרום עשוי לנטרל את ההשפעה של טריפסין. - צנטריפוגהההשעיה תא ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל של מדיום טרי. צנטריפוגה שוב תחת אותם תנאים במשך 5 דקות.
- הסר את supernatant ולהוסיף בינוני חדש, כך ריכוז התא תוצאות 5 x 10 5 תאים / מ"ל (שנקבע על ידי ספירת התאים באמצעות hemocytometer). מערבבים היטב על ידי pipetting עדין.
- להפיץ את ההשעיה התא בצלחות תרבות התא. השתמש 3 מ"ל לכל צלחת 60 מ"מ קוטר התרבות.
הערה: תרבות זו נקראת מעבר אפס (P0). - לשמור על התאים 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C. שנה חצי בינוני מותנה בינוני טרי מדי יום שני.
- Subculture (שלב 1.2) אם הוא הופך להיות confluent.
- תת התרבות של התרבות התא RPE
- הסר את המדיום תרבות לשטוף את התאים פעמיים עם PBS (-).
- דגירה התאים עם PBS (-) פתרון עם 0.05% טריפסין + 0.2% EDTA אניNa 5% CO 2 באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לנתק את תאים RPE ידי pipetting עדין ולאסוף את ההשעיה התא בצינור חרוטי מלא 10 מ"ל של המדיום תרבות, כולל 10% בסרום חזיר.
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב XG 400 במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הסר את supernatant ולהוסיף בינוני תרבות חדשה, מה שהופך את ריכוז התא 5 x 10 5 תאים / מ"ל (שנקבע על ידי ספירת מספר התא עם hemocytometer). להפיץ את התאים חדשים 60 מ"מ קוטר מנות התרבות, כמתואר בשלב 1.1.13.
הערה: תרבות התא הוא עכשיו מעבר 1 (P1). - לאחר confluency הוא הגיע, תת תרבות P1 ל P2, תוך שימוש באותו הליך המתואר צעדים 1.2.1-1.2.5. מן התרבות P2, זרע התאים על מנות תרבות קטנות יותר (30 מ"מ קוטר פנימי) במקום 60 מ"מ קוטר מנות תרבות.
- עבור הניסויים, השתמש P2 או תרבויות P3.
2. ת'ולהקרנת לייזר
- הקמת תחנת ההקרנה
- חיבור מכשיר הליום תוליום (1.94 מיקרומטר, טווח כוח: 0-20 W) כדי 0.22-NA, 365 מיקרומטר סיבי קוטר הליבה.
- מכני לתקן את קצה סיב הזרוע המתכת כי הוא קבוע אופקית אל עמדת מתכת אנכית של תחנת הקרנה. מניחים את ההודעה אנכי כך קצה סיבי הלייזר נמצא מעל צלחת חמה שעליו צלחת התרבות התא הוא להיות ממוקם במהלך הקרנה.
- הנח נייר לבן על צלחת חם ולהפוך את הקורה מכוון על (λ = 635 ננומטר, מקסימום = 1 mW, קוטר ברמת נייר ≈ 30 מ"מ). סמן את היקף הקורה מכוונת על הנייר הלבן, כך המיקום שבו צלחת התרבות היא להיות ממוקם במהלך הקרנה ידוע.
הערה: המטוס z של קצה סיב ניתן לשינוי. ללא כל אופטיקה הדמיה נוספת, קוטר נקודה לייזר על המטוס התרבות תאים, להציב 12 ס"מ מתחת קצה סיב, אני S על 30 מ"מ, אשר כמעט שווה את הקוטר הפנימי של צלחת תרבות התא. ציור סכמטי של ההתקנה מוצג באיור 1 .
איור 1: תמונה סכמטית של תחנת הלייזר תוליום לייזר. צלחת תרבות מונחת על צלחת החימום. התאים ממוקמים 12 ס"מ מתחת עצה סיבי הליום תוליום כך גודל הקרן הוא כמעט זהה לקוטר הפנימי של צלחת תרבות (כ 30 מ"מ). הלייזר הקרנה לייזר נשלטת על ידי שבשגרה זמן בשליטה של פלטפורמת עיצוב מערכת בהתאמה אישית. יש לקבוע את הגדרת הכוח לפני הפעלת תוכנית ההקרנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
- Start = "2">
- הקרנה בלייזר של תרבות התא
- 1 שעה לפני הקרנה, להחליף את המדיום התרבות לחלוטין עם 1.2 מ"ל של המדיום הטרי.
הערה: זהו שלב קריטי ויש לעקוב אחריו בקפידה. - מניחים את תחנת ההקרנה ( כלומר, את הצלחת החמה ואת ההודעה שבה כדי לתקן את סיבי הלייזר) על ספסל נקי.
- הסר את צלחת התרבות התא מן החממה ומניחים אותו על המיקום מסומן על צלחת חמה (שלב 2.1.3).
- ללבוש משקפי מגן. הפעל את הלייזר תוליום. הגדר את העוצמה הרצויה במכשיר הלייזר (מתכוונן מ - 20 - 20 W). הפעל את הפליטה.
- התחל פלטפורמת תכנון מערכת השולטת על קרינה בלייזר ופרוטוקול תזמון (קובץ משלים).
- מיד לאחר הנחת צלחת התרבות על צלחת חם, לחץ על "זמן חימום מראש" כדי להפעיל את הטיימר עבור 140 s ("זמן חימום מראש 1"); זה ישמור על הטמפרטורה בינוני בינוני ב 37 ° C לפני הקרנה.
הערה: לאחר 140 שניות, צליל ביפ יופעל, והקוצב הבא ("זמן החימום המוקדם") יתחיל לספור באופן אוטומטי 8 שניות. במהלך 8 זה, הבוחן עשוי לפתוח את צלחת התרבות. לאחר 148 של חימום מראש, 10-s הקרנה בלייזר ארוך על התרבות התא יתבצע באופן אוטומטי. במקרה חירום, הצייד את מכשיר הלייזר בלחיצת עצירה כדי לעצור את הלייזר באופן מיידי. זהו שלב קריטי חייב להיות אחריו בהחלט. נקודה מיוחדת של זהירות מתייחסת לפתיחת הכיסוי של המנה בדיוק לפני ההקרנה, בתחילת זמן 8 חימום מראש. פתיחת המכסה עלולה להתקרר מהר מאוד. - לאחר הקרנה, מיד במקום לכסות בחזרה על צלחת התרבות, לעזוב את צלחת תרבות על צלחת חמה במשך 7 שניות נוספות, ומניחים אותו בחזרה 5% CO 2 באינקובטור ב 37 ° C.
- 1 שעה לפני הקרנה, להחליף את המדיום התרבות לחלוטין עם 1.2 מ"ל של המדיום הטרי.
- מדידת התפלגות הטמפרטורה ברמה תאית (כיול טמפרטורה)
- הפוך חורים קטנים (כ 300 מיקרומטר בקוטר) קרוב לתחתית על ארבעה צדדים (כל 90 מעלות) של צלחת 30 מ"מ קוטר תרבות (ללא תאים); להשתמש קצה מחט (20G) מחומם עם מבער Bunsen. חותם את החורים עם סרט בידוד חשמלי מבחוץ ולעשות חור קטן עם מחט בסדר כך שרק תרמי קנס (200 מיקרומטר בקוטר) ניתן להכניס דרך חור זה בתנאים אטום למים.
- בחלק החיצוני של צלחת בתחתית התרבות, לצייר 2 בקוטר אנכי ולהגדיר את נקודת המעבר ( כלומר, במרכז הצד התחתון) כמו קואורדינטות אפס (0). סמן כל 3 מ"מ רדיאלי החוצה את המנה ( כלומר, 0, 3, 6, 9, 12, ו -15 מ"מ) בכל כיוון לאורך השורות ( איור 2 , נקודות כחולות); מספר הנקודות צריך להיות 21 בסך הכל.
- ממלאים את צלחת תרבות התא עם 1.2 מ"ל של המדיום תרבות חדשה. מניחים את התרבות dIsh על צלחת חמה על 37 מעלות צלזיוס, הכנס תרמית בסדר (200 מיקרומטר בקוטר) לתוך החור בצד, ומניחים קצה רגיש שלה על מיקום מסומן להימדד.
- ללבוש משקפי מגן. הפעל את הלייזר תוליום באופן ידני להגדיר את הכוח (בין 0 ל 20 W, ב 0.1-W במרווחים) של לייזר לתכנן.
הערה: עבור כיול טמפרטורה, מדידות עם הספק במרווחים של 3W צריך להיות מספיק. - הפעל את פלטפורמת תכנון המערכת ולחץ על הלחצן "התחל טמפ. רכישה" (קובץ משלים) כדי להתחיל את מדידת הטמפרטורה.
- בצע את הנוהל כמו בשלב 2.2.6.
הערה: תוכנית הבקרה מודדת את טמפרטורת הצינור המותקן בכל 100 אלפיות השנייה ומראה את התקדמות הטמפרטורה במהלך ההקרנה בממשק הגרפי. - בצע פעולות אלה עבור כל 21 נקודות המדידה ובגדרות צריכת חשמל שונות. חזור על התהליך כולו שלוש פעמים עבור כל נקודות עבור כל כוח settinGs כדי להשיג נתונים אמינים.
- ייצוא נתוני טמפרטורה כמו נתוני csv, אשר בסופו של דבר ניתן להמיר לגיליון אלקטרוני. ממוצע הטמפרטורה המקסימלית בסוף הקרנה למדידות בשלושה עותקים בכל נקודה. ממוצע הערכים מנקודות על אותו מעגל (4 נקודות בסך הכל, למעט הנקודה המרכזית).
- קנו את הטמפרטורה המקסימלית הממוצעת על הגרף, מה שהופך את המרחק ממרכז המנה (מ"מ) כמו ציר x ואת עליית הטמפרטורה (ΔT, C °) כמו ציר y. השתמש בפונקציית ההתאמה של תוכנה מתמטית שתתאים למודל גאוס לנתונים הגולמיים. יצירת הפצה טמפרטורה להתאים גאוס.
איור 2: הנקודות לכיול טמפרטורה בתרבות אחת תא תרבות. נתוני הטמפרטורה נמדדו במרכז ובגיל 5נקודות רדיאלי מעל 4 זוויות שונות (נקודות כחולות). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
3. הערכות ביולוגיות עבור תגובות תאים לאחר אירי תרמי שונים
- הערכה של הכדאיות התא ( כלומר, חיים, אפופטוטיים, מת) בעקבות הגדרות כוח שונות וקביעת סף המוות התא
- בנקודות הזמן שצוינו ( כלומר, 3, 24, ו 48 שעות לאחר הקרנה), לשטוף את התאים עם PBS (-) ולהשתמש בערכה זמין מסחרית להעריך כדאיות התא ( כלומר, חיוני, אפופטוטי, מת) פרוטוקול.
- הכן פתרון מכתים על ידי הוספת 5 μL של isothiocyanate פלואורסצין (FITC) -annexin V, 5 μL של ethidium homodimer III, ו 5 μL של Hoechst 33342 100 μL של חיץ 1x מחייב (כל ערכתרכיבים). הכן פתרון מכתים מספיק כדי לכסות את התאים. דגירה התאים במשך 15 דקות.
- שטפו את התרבות התא עם חיץ מחייב פעמיים, להחליף את חיץ מחייב עם PBS (-), ולהגדיר את התרבות על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
- החלף את הנתיב האור אל העדשה העין, בחר את 4 ', 6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI) מסנן, להדליק את האור תאורה, ולמצוא את המטוס ממוקדת עם המטרה 4x.
- לשנות את הנתיב האור אל המצלמה, למצוא את התמונה על מסך המחשב של תוכנת הדמיה מיקרוסקופ, ולהתאים את המיקוד.
- השתמש בפונקציה תפר ( כלומר, את הפונקציה כדי להקליט מספר תמונות על פני המנה ולאחר מכן ליצור תמונה אחת גדולה) של התוכנה ספציפית מיקרוסקופ כדי לקבל את התמונה הקרינה של צלחת התרבות כולה התא. השתמש 3 ערכות מסנן שונים, DAPI, FITC, ו tetramethylrhodamine (TRITC) לתמונה Hoechst 33342 תאים חיוביים (כל גרעיני התא), FITC-Annexin V-positiתאים ותאים (אפופטוטיים), ותאי ה- ethidium homodimer III חיובי (מת), בהתאמה.
- למדוד את רדיוס (מ"מ) של המת (ethidium homodimer III חיובי) האזור ואת רדיוס החיצוני / הפנימי של אפופטוטיים (Annexin V חיובי) הלהקה טופס באזור בתרביות תאים מוכתמים. החל רדיוס זה על הפונקציה גאוס מצויד של הפצה הטמפרטורה עבור הגדרת הכוח המקביל. חישוב הטמפרטורה המדויקת בשולי האזור מת או אפופטוטיים כדי להבהיר את טמפרטורות הסף למוות התא שינוי אפופטוטי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
חלוקת טמפרטורה לאחר הגדרות צריכת חשמל שונות
כל ההתפתחויות טמפרטורה עבור כל הקרנה אחת היו פיקוח בכיול הטמפרטורה. מנתונים אלה, הטמפרטורה המקסימלית בנקודה הנמדדת הושגה ומוגדרת כ- T max (° C). כפי שמוצג בתרשים 3A , התוכנית בוצעה בנקודת זמן כאשר צלחת התרבות הונח על צלחת החימום. לאחר 140 "זמן לחימום מראש 1", אשר היה ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בהתייחסות לתגובות תאולוגיות ביולוגיות הקשורות לטמפרטורה, לא רק הטמפרטורה, אלא גם משך הזמן של הטמפרטורה המוגברת, היא בעלת חשיבות, שכן רוב התהליכים הביוכימיים תלויים בזמן. במיוחד בתחום של היפרתרמיה המושרה בלייזר ברפואת עיניים, בשל טווח הזמן הקצר - בין אלפיות השנייה לשניות - קשה לחקור תופעות תרמיות תאיות עם בקרת טמפרטורה מדויקת. לכן, תוכנית הקרנה בלייזר מתאים למודל התרבות התא, עם מערכת הפעלה המאפשרת בקרת טמפרטורה קפדנית זמן שליטה. ההערכה הביולוגית של תגובות התא לאחר חשיפה תרמית, כגון...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לגלות.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (BMBF) (מענק # 13GW0043C) וכן משרד אירופי של מחקר ופיתוח חלל (EOARD, מענק # FA9550-15-1-0443)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ריאגנטים | |||
| דולבקו' s Modified Eagle' s בינוני - גלוקוז גבוה | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | הוסף (2)-(4) לפני השימוש. חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש. |
| תמיסה אנטי-פטריית אנטיביוטית (100 ופעמים;) | סיגמא-אולדריץ' | A5955-100 מ"ל | מכיל 10,000 יחידות פניצילין, 10 מ"ג סטרפטומיצין ו-25 μ g אמפוטריצין B ב-1 מ"ל. יש להוסיף 5.5 מ"ל בבקבוק בינוני של 500 מ"ל (1) לפני השימוש. |
| נתרן פירובט (100 מ"ל) | סיגמא-אולדריץ' | S8636-100 מ"ל | הוסף 5.5 מ"ל בבקבוק בינוני של 500 מ"ל (1) לפני השימוש (ריכוז סופי: 1 מ"מ) |
| סרום חזיר | סיגמא-אולדריץ' | 12736C-500 מ"ל | הוסף 50 מ"ל בבקבוק בינוני של 500 מ"ל (1) לפני השימוש (סופי: 10%) |
| מי מלח חוצצים פוספט (PBS) | סיגמא-אולדריץ' | D8537-500 מ"ל | |
| טריפסין מלבלב חזיר | סיגמא-אולדריץ' | T4799-25G | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| Human VEGF Quantikine ELISA Kit | R& D System | DVE00 | |
| Oxiselect Total Glutathione Assay Kit | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| Apoptotic/Necrotic/Healthy Cells Detection Kit | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| <חזק>ציוד | |||
| תוליום לייזר | Starmedtec GmbH | אב טיפוס | 0-20 W |
| 365 מ"מ סיבים בקוטר ליבה | רכיבי לייזר גרמניה | CF01493-52 | |
| צמד תרמי | אומגה הנדסה בע"מ | HYP-0- 33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| צלחת חימום | MEDAX | ||
| קורא מיקרופלייט ( ספקטרופלואורומטר) | מכשיר מולקולרי | Spectramax M4 | |
| הומוגנייזר תאים | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | Nikon | ECLIPSE Ti | |
| תוכנה מתמטית | The Mathworks. Inc | MATLAB שחרור 2015b | |
| פלטפורמת עיצוב מערכת | National Instrument | Labview | Laboratory Virtual Instrument Engineering Workbench |
מקורות
- Inagaki, K., et al. Comparative efficacy of pure yellow (577-nm) and 810-nm subthreshold micropulse laser photocoagulation combined with yellow (561-577-nm) direct photocoagulation for diabetic macular edema. Jpn J Ophthalmol. 59 (1), 21-28 (2015).
- Roider, J., et al. Selective retina therapy (SRT) for clinically significant diabetic macular edema. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 248 (9), 1263-1272 (2010).
- Brinkmann, R., et al. Real-time temperature determination during retinal photocoagulation on patients. J Biomed Opt. 17 (6), 061219(2012).
- Yoshimura, N., et al. Photocoagulated human retinal pigment epithelial cells produce an inhibitor of vascular endothelial cell proliferation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (8), 1686-1691 (1995).
- Denton, M. L., et al. Damage Thresholds for Exposure to NIR and Blue Lasers in an In Vitro RPE Cell System. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (7), 3065-3073 (2006).
- Shrestha, R., Choi, T. Y., Chang, W., Kim, D. A high-precision micropipette sensor for cellular-level real-time thermal characterization. Sensors (Basel). 11 (9), 8826-8835 (2011).
- Gao, F., Ye, Y., Zhang, Y., Yang, J. Water bath hyperthermia reduces stemness of colon cancer cells. Clin Biochem. 46 (16-17), 1747-1750 (2013).
- Jansen, E. D., van Leeuwen, T. G., Motamedi, M., Borst, C., Welch, A. J. Temperature dependence of the absorption coefficient of water for midinfrared laser radiation. Lasers Surg Med. 14 (3), 258-268 (1994).
- Iwami, H., Pruessner, J., Shiraki, K., Brinkmann, R., Miura, Y. Protective effect of a laser-induced sub-lethal temperature rise on RPE cells from oxidative stress. Exp Eye Res. 124, 37-47 (2014).
- Denton, M. L., et al. Spatially correlated microthermography maps threshold temperature in laser-induced damage. J Biomed Optics. 16 (3), (2011).
- Morgan, C. M., Schatz, H. Atrophic creep of the retinal pigment epithelium after focal macular photocoagulation. Ophthalmology. 96 (1), 96-103 (1989).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה