מאמר שיטה

התנהגויות חוש הריח assayed ידי מעקב ממוחשב של תסיסנית בתוך אולפקטומטר ארבעה-רביע

DOI:

10.3791/54346

⸱

20 באוגוסט 2016

 ,  , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Center for Sensory Biology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2MRC Clinical Sciences Center, Imperial College London

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן הגדרה התנהגותית ושיטת ניתוח נתונים לבדיקת תגובות הריח של עד 100 זבובי חומץ (Drosophila melanogaster). ניתן להשתמש במערכת זו עם גירוי ריח יחיד או מרובה, וניתנת להתאמה להפעלה אופטוגנטית או להשתקה של תת-קבוצות עצביות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין כיצד מעגלים עצביים לתפקד להנחות התנהגויות בעלי חיים מתאימות. תסיסנית היא מערכת מודל מצוינת עבור חקירות כאלה בשל ההתנהגויות המורכבות שלה, טכניקות גנטיות חזקות, ומערכת עצבים קומפקטית. מבחני התנהגות מעבדה כבר זמן רב בשימוש עם תסיסנית לדמות תכונות של הסביבה הטבעית לחקור את המנגנונים העצביים שבבסיס את ההתנהלויות (למשל phototaxis, chemotaxis, למידה חושית וזיכרון) 1-3. עם הזמינות האחרונות של אוספים גדולים של קווי תסיסנית מהונדס כי תווית תת עצביים ספציפיים, מבחני התנהגות לקחו על תפקיד בולט לקשר נוירונים עם התנהגויות 4-11. פרדיגמות צדדית לשחזור, יחד עם השגרה חישובית הבסיסית לניתוח נתונים, הן הכרחיות עבור בדיקות מהירות של קווים לטוס מועמד עם genotyp השונהes. שימושי במיוחד הם setups גמישים במספר לחיות ניסוי, משך הניסויים והטבע בגירויים מוצגים. את assay של בחירה צריך גם להפיק נתונים לשחזור כי הוא קל לרכוש ולנתח. כאן, אנו מציגים תיאור מפורט של מערכת ופרוטוקול עבור assaying תגובות התנהגותיות של תסיסנית זבובים בתוך זירת ארבעה שדה גדולה. ההתקנה משמשת כאן assay תגובות של זבובים לגירוי חוש ריח יחיד; עם זאת, אותה התכנית ההתקנה עשויה להיות שונה כדי לבדוק הרחה מרובה, גירויים חזותיים או optogenetic, או שילוב של אלה. התקנת אולפקטומטר מתעדת את הפעילות של אוכלוסיות זבוב להגיב לריחות, ושיטות אנליטיות חישובית מוחלות לכמת התנהגויות זבוב. הנתונים הנאספים מנותחים לקבל לקריאה מתוך מהירה של ריצת ניסיוני, אשר הינה הכרחית עבור איסוף נתונים יעיל אופטימיזציה של תנאי הניסוי.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היכולת להסתגל ולהגיב הסביבה החיצונית היא קריטית להישרדות של כל בעלי החיים. בעל חיים צריכים למנוע סכנות, לחפש מזון למצוא בנות זוג, וללמוד מניסיונם הקודם. מערכות חושיות לתפקד לקבל מגוון של גירויים, כגון חזותי, כימי mechanosensory, ולשלוח אותות אלה למערכת העצבים המרכזית צורך לפרש מפוענח. המוח ואז מפנה התנהגויות מוטוריות המתאים בהתבסס על הסביבה הנתפסת, כגון תר אחר מזון או לברוח טורף. הבנה כיצד מערכות חושיות לזהות את העולם החיצוני, וכיצד המוח מפענח ומפנה החלטות, הוא אתגר גדול בנוירוביולוגיה.

תסיסנית היא מערכת מודל עוצמה על חקירת התנהגויות מדריך מעגלים עצביים איך. מלבד היותו פשוט וזול יותר לתחזק, תסיסנית תערוכה רבות התנהגויות מגוונות ומורכבות סטריאוטיפיות, עדיין עושה זאת עם compact מערכת העצבים של כ 100,000 נוירונים. טכניקות גנטיות עצמה קיימות מניפולציה של הגנום תסיסנית, ואלף קווים מהונדסים נוצרו כי סלקטיבי reproducibly לתייג אותה תת הקבוצות של נוירונים 10-13. קווים מהונדסים אלה יכולים לשמש כדי לתפעל את הפעילות באופן סלקטיבי של נוירונים שכותרתו (להפעיל או לעכב), ואת המניפולציות האלה יכולים לשמש כדי לחקור התנהגויות מדריך פונקציות איך עצבי.

מבחני התנהגות נפוצים פותחו ללימוד התנהגויות תסיסנית שונות. תסיסנית, כמו בעלי חיים רבים, להשתמש בחוש הריח שלהם להדרכת בחירות התנהגותיים רבות, כגון מציאת מזון, מציאת בני זוג, לבין הימנעות סכנות. Olfaction לכן מערכת חושית טובה חוקר כיצד לגירויים חיצוניים מזוהים ופורשו על ידי מערכת העצבים של בעלי חי להנחות בחירות מתאימות. ככזה, מספר מבחני פותחו עבור investigaזחל טינג והתנהגויות הרחה מבוגרת. באופן מסורתי, התנהגויות ההרחה תסיסנית היו assayed ידי פרדיגמת שתי הבחירה T-מבוך, אשר ניתן להשתמש בהם עבור assaying מולד למדו התנהגויות ההרחה 3. ב assay זה, כ -50 זבובים מקבלים בחירה בין שני צינורות: צינור אחד מכיל את הריח מדובר והשני מכיל odorant מלא (בדרך כלל ממס הריח). הזבובים ניתנים לתקופה קצובה של זמן לעשות בחירה, ולאחר מכן את מספר הזבובים הנמצאים בתאים השונים נספר. למרות T-המבוך הוא assay פשוט עבור ניסויים רבים, ישנם מספר מגבלות. לדוגמא, התנהגויות הרחה נמדדות רק בנקודת זמן אחת, ואת האפשרויות שונות שנעשו לפני נקודת זמן זו מבוטלות. בדומה לכך, התנהגויות הפרט של הזבובים בתוך האוכלוסייה מוזנחות. בנוסף, T-המבוך דורש ספירה ידנית של זבובים, אשר עשוי להציג שגיאות. לבסוף, שכן יש רק שתי אפשרויות מדודות, זהמקטין את הכח הסטטיסטי נדרש לעתים קרובות כדי לזהות שינויי התנהגותיים עדינים. חלופת מבוך T ושתיים בחירה היא של ארבעה רביעים (ארבעה-שדה) אולפקטומטר 14-18. ב assay זה, חיות לחקור זירה שבה כל אחת מארבע הפינות של הזירה מתמלאת מקור פוטנציאלי של אוויר odorized. הזירה יש צורת כוכב המכווץ על מנת למקסם את ההיווצרות של ארבעה רביעי ריח מוגדרים באופן ניסיוני. אם ריח מסופק באחת הפינות ואז הוא מוכל רק באותה ברבע אחד. ההתנהגויות של בעלי החיים ניתן לעקוב כפי שהוא להיכנס ולצאת ברבעים הריח, ובקלות לעומת התנהגותם הרביעים המלאים השלושה. את assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ובכך רשום בתגובה במרחב ובזמן התנהגותיות לגירויי הריח פני זירה ניסיונית גדולה.

אולפקטומטר ארבע ברבע פותחה לראשונה על ידי Pettersson et al. 15 Vet et al. 17 לחקור את olתגובות מפעל התנהגותיים של דבוראים טפילים פרט. Faucher et al. 18 Semmelhack וואנג 16 התאימו את ההגדרה כדי לפקח על התגובות חוש הריח של תסיסנית הפרט. אולפקטומטר הארבעה ברבע רגיש לא פחות לתגובות אטרקטיביות ודוחות, המאפשר מגוון רחב של בדיקה ניחוחי ותנאים. תוכנת מעקב-אישית בכתב זבוב, שפותחה על ידי אלכס Katsov 19 ומתוחזק כיום על ידי ג'וליאן בראון (המפורטים חומרים), הציג יתרונות נוספים למימושים עדכנית יותר של אולפקטומטר ארבע ברבע 14,20-23. עכשיו זה אפשרי כדי assay עד 100 זבובים בו זמנית מרחבית גבוהה (27.5 פיקסלים / ס"מ) ובזמן (30 פריימים לשנייה) רזולוציה, המאפשר חילוץ פרמטרים שונים, כגון מיקום, מהירות ותאוצה של זבובים בכל נקודת זמן. זה מאפשר חקירות הדינמיקה של תגובות התנהגותיות "הזבובים לריחות 20 . יצוין, עם זאת, כי זהותו של זבובים בודדים בתוך האוכלוסייה בתקופת המעקב כולו אינו נשמר. במקום זאת, כל מסלול זבוב נרשם עוד שני מסלולי זבוב לא מצטלבים. בנקודה זו, שירים חדשים מוקצים לאחר הזבובים לסטות. על ידי שילוב תוכנה לכיד וידאו אחר (המפורטים חומרי טבלה), אותה התצורה מאפשרת תקופות מעקב גמישות ויכולה לשמש למעקב אחר זבובים עד 24 שעות על ידי לקיחת תמונות בקצב מסגרת נמוכה. אפשרות זו שמשה ללמוד התנהגויות הטלה של זבובים ולהשוות תנוחות הגוף שלהם עם העדפות ovipositional 14. אולפקטומטר ארבעה השדה עשוי לשמש גם כדי ללמוד תגובות מולטימודליות (למשל חוש ריח וחזותי) גירויים, או לשלב optogenetic 9 או thermogenetic 21 גירוי עם מצגות של גירויים חושיים. יתר על כן, הרזולוציה הגבוהה הזמנית מאפשרת המיצוי של מסלולי FOr כל זבובי פירות בערכת הנתונים האנסמבל. לכן, השיטה מאפשרת חקירת התנהגויות אוכלוסיית הרחה מודרכת גם אינטראקציות חברתיות פרט. הנתונים שנוצרו על ידי assay זה הם חזקים מאוד לשחזור, המאפשרים את השימוש אולפקטומטר ארבעת שדה למסכים התנהגותי.

אנו מתארים כאן את הרכבת ההתקנה עבור אולפקטומטר של ארבעה רביעים. בנוסף, אנו מראים את השימוש בו מנסה לאמוד משיכה ההרחה בתגובה חומץ תפוחים ודחייה בתגובה propionate אתיל מרוכז מאוד. לבסוף, אנו מתארים ולספק קוד לדוגמא עבור הניתוח של נתוני מעקב זבוב המוקלטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הגדרת עצרת

  1. ייצור בזירה בצורת כוכב (19.5 ס"מ על 19.5 ס"מ על 0.7 ס"מ) מתוך polytetrafluoroethylene (PTFE) פי (חומרים משלים, SupplementalSketch_StarShapedArena.pdf) ציור מסופק. הזירה עשויה להיות מיוצרת על ידי בפרסומת או מתקן מותאם אישית.
  2. רוכשת שתי צלחות זכוכית (20.25 ס"מ על 20.25 ס"מ עם עובי של 2 מ"מ), לקדוח חור (~ 0.7 ס"מ קוטר) בדיוק במרכז אחד מלוחות הזכוכית באמצעות המקדח מצופה יהלומים.
  3. ייצור תיבת התנהגות אור חזק עבור התנהגותית. גם לייצר קופסות מצלמת אור חזקה עבור מצלמת וידאו CCD-אדום אינפרא לי תרשים סיפק (חומרים משלימים, SupplementalSketch_LightTightBox.pdf). התיבות עשויות להיות מיוצרות על ידי מסחרי או מתקן מותאם אישית.
  4. להתקין את יחידת המזגן על הקיר האחורי ואת מערכי LED על הקירות הצדדיים של תיבת ההתנהגות. מניח את חללית הטמפרטורהבתיבת התנהגות דרך חור בצד משוב וכוונון טמפרטורה בזמן אמת (ראה איורים 1 ו -2 לפרטים נוספים).
  5. חבר את מסנן IR ו מקטב מעגלי למצלמה, ולעגן את המכלול לתוך תיבת המצלמה. תיבת התנהגות תיבת מצלמה מופרדת חלון זכוכית עבור בקרת טמפרטורה טובה יותר של תיבת ההתנהגות (ראה איורים 1 ו -2 לפרטים נוספים).
  6. חבר את מצלמת CCD אינפרא האדומה למתאם מצלמה. חבר את מתאם מצלמת ממיר USB. חבר את ממיר ה- USB ליציאת USB במחשב לרכישת נתונים.
  7. התקן את מנהל ההתקן עבור ממיר וידאו במחשב על פי הוראות היצרן. לחלופין, להתקין תוכנות עיבוד תמונה שסיפק היצרן של ממיר וידאו USB לגשת למגוון רחב יותר של הגדרות המצלמה ופרמטרים הרכישה.
  8. חבר את יחידת המזגן (באמצעות "פלט"על גביו של בקר טמפרטורה) ואת בדיקת הטמפרטורה (באמצעות" תרמי "בגב בקר טמפרטורה) אל בקר הטמפרטורה. מניח את החללית לתוך תיבת ההתנהגות.
    הערה: מערכת בקרת הטמפרטורה בפריסה שלנו היא מסוגלת לשמור על טמפרטורת התיבה בין 18 ° C ו- 30 ° C. כאשר טמפרטורה סביבתית גבוהה או נמוכה יותר יכולה להיות שימושית עבור thermogenetic (dTrpA1, TS TrpM8 או shibire) ניסויים לתמרן פעילות עצבית או לעכב בשידור סינפטי. עבור רוב הניסויים, הטמפרטורה נשמרת על 25 מעלות צלזיוס.
  9. הרכיבו את מערכת המסירה ריח בשלבים הבאים (ראה איור 1B עבור שרטוטים מפורטים ואביזרים חיבור):
    1. השתמש ווסת לחץ האוויר לשלוט קלט האוויר ממערכת האוויר המרכזית. חבר מסנן אוויר פחמן (מלא פחם) אל ווסת הלחץ כדי לטהר את האוויר מן המרכזימערכת ir.
    2. הרכב את מערכת בקרת זרימה המורכבת של ערוצים מרובים מוסדרים על ידי צינורות flowmeter ברזולוציה גבוהה.
    3. חברו את יציאת ממסנן האוויר פחמן אל צינורות flowmeter דרך סעפת כפי שמוצג באיור 1B ו 2F. כוון את הפלט של צינורות flowmeter דרך שסתומי סולנואיד 3 כיוונים נשלטו אלקטרוני להסדיר אם אוויר נקי לעזוב את למדידת התצרוכת מסולק לחדר או התקשר תאי ריח מחוייט 24.
    4. התקן את בקר שסתום סולנואיד פי הוראות היצרן.
  10. תקן מד זרימת האוויר האלקטרוני על ידי חיבורו להתקן רכישת נתונים (DAQ) וכן אספקת חשמל בהתאם למדריך של היצרן. התקן את תוכנת ממשק DAQ לאמת ספיקות שווות בכל רבע של הזירה לפני כל ניסוי.

2. הכנת גירויי חוש ריח

  1. הכן ריח 5תאי נמלה 24 מורכבות של מכל חיצוני פלסטיק, זכוכית מיכל פנימי, להכניס מכסת מחוייט PTFE, מכסה מיכל מקורי עם חלק מרכזי הוסרו, ושני שסתומים חד כיווניים.
    הערה: O-Ring מסביב למכסת PTFE יכול לשמש כדי למנוע דליפת אוויר מאולם הריח במהלך זלוף ריח. ראה איור 1 עבור סכמטי באיור 2 לתמונות של תאי.
  2. השתמש ארבעה תאי odorant עבור פקדי ממס, קאמרית אחת עבור odorant הבדיקה. מלאו את מיכלי זכוכית עם 1,000 μl של דילול ממס או odorant (ניחוחי מבחן + ממיסים המתאים, ומערבבים היטב לפני ניסויים), מניחים את מיכל זכוכית בפנים הקאמרית פלסטיק המקביל (לא לשפוך את הנוזל לתוך תא פלסטיק) והדק את המכסה . הקפד תמיד להשתמש בתא נקי עבור odorant מבחן ובקרות ממס.
    הערה: משיכת חוש ריח יכולה להיות מופעלת על ידי 1/16 דילול של חומץ תפוחים (5% חומציות) ב wאטר. לעומת זאת, התנהגות דחייה חוש הריח עלול להיחקר באמצעות דילול 10% של propionate אתיל בשמן מינרלי. גירויי בקרה במקרים אלה הם תאי ריח עם שמן מינרלים טהור.

3. הכנה טס

  1. אחורי זבובים על מדיום קמח תירס רגיל. מניח 30 זכר 30 זבובים הוריים נשיים בקבוק סטנדרטי, ולתת להם להטיל ביצים במשך 5 ימים של 25 מעלות צלזיוס או בטמפרטורת חדר.
  2. עבור כל ניסוי, לאסוף eclosed החדש (<1 יממה) 25 גברים ו 25 נשים זבובים בהרדמה CO 2 קצר.
  3. שמור זבובי בקבוקון עם מדיום לטוס תקן 2-4 ימים.
  4. 40-42 שעות לפני הניסוי, להעביר את הזבובים בלי CO 2 הרדמה   בקבוקון עם ג'ל agarose ~ 10 מ"ל 1%. זה ישמור על הזבובים humidified ללא מזון, אשר מסייע להגביר את הפעילות של התנועה שלהם.
    הערה: יותר מ -90% של הזבובים צריכים לשרוד את הרעב. גנוטיפים חלקם פחות לרפאעמך וייתכן שלא לעשות את זה דרך רעב 40 שעות. במקרים אלה, לתקופות קצרות כגון 24-28 שעות תתקבלנה, אבל צריך להישמר זהה עבור כל התנאים והחוזרים ניסיוני.

4. תגובות התנהגותיות ניחוחות אטרקטיביים ודוחים

  1. הפעל את בקר הטמפרטורה ולהגדיר אותו ל -25 מעלות צלזיוס.
  2. חבר את תאי odorant (ניחוחי מלא בדיקה) על ידי החדרת צינורות לשקע של תא odorant ואל שכיבות כדי להתחבר הולם על קופסא ההתנהגות.
  3. בדוק את קצב הזרימה בכל רבע באמצעות מד זרימת אוויר לוודא כי מלאה איירסטרים odorant שווים ל -100 מ"ל / דקה.
  4. נקו את הזירה PTFE זבוב ואת לוחות זכוכית עם 70% 2-3 פעמים אתנול ולאפשר להם אוויר יבש לגמרי (~ 3-4 דקות).
  5. הצמד את לוחות הזכוכית לזירה עם מהדק.
  6. העברת זבובים בלי CO 2 הרדמה לזירה דרך החור אחד מלוחות הזכוכית. אָחוֹראה ההעברה, להציב רשת מעגלית על החור כדי למנוע זבובים לברוח.
    הערה: הרדמת CO 2 הוכחה כדי להשפיע על התנהגות תסיסנית 25 ולא אמור לשמש תוך 24 שעות של ניסוי התנהגותי.
  7. מניח את הזירה עם זבובים לתוך תא האור חזק, לחבר את זרמי אוויר ארבע שליטה על ידי חיבור הצינור המחובר אל שכיבות כדי להתחבר הולם על קופסא ההתנהגות לפינות הזירה, לסגור את הדלת של החדר ולחכות 10- 15 דקות כדי לתת את הזבובים להתאקלם בסביבה החדשה. במידת האפשר, כיבתה את האורות בחדר שבו הניסויים מבוצעים, כדי למנוע דליפת אור מינימלית האפשריים שעשויים להטות את התוצאה הניסיונית.
  8. הפעל ניסוי בניהול 5-10 דקות, שבו זבובים נחשפים פרצי אוויר 4 שליטה.
  9. לנתח את הנתונים באופן מיידי (ראה סעיף ניתוח נתונים להלן) כדי לוודא כי הזבובים מופצים באופן אחיד בזירה, ואת משיכת האינדקס קרובהצעד ל -0 זה חיוני, כפי שהוא מוודא כי אין מקורות בלתי מבוקרים של העדפה או הימנעות בתוך הזירה (למשל חדר אור דולף מבחוץ, התפלגות טמפרטורה אחידה, בזירה אחידה, זיהום ריח, וכו '). אם הזבובים מופצים שוויוניים או הפעילות של התנועה שלהם היא נמוכה, לבטל את הזבובים, לנקות את הזירה שוב (שלב 4.4) ולהשתמש קבוצה חדשה של זבובים לחזור על הניסוי.
  10. חבר את תא odorant המבחן כדי ההתקנה כשיפעיל שסתומי 3 הכיוונים או מחדש חיבור הצינורות המחברים.
  11. הפעל ניסוי מבחן למשך 5-10 דקות ולנתח את הנתונים כפי שפורט בסעיף 5 להלן (ראה גם הפניה 14 ו איור 3). הקלטות ארוכות מ -20 דקות יכולות לגרום קבצי נתונים שעשויות להיות קשה תהליך מחשוב. אם הקלטות ניסיוניות יותר הם רצויות, במהירות לעצור מחדש להפעיל את תכנית המעקב. התוצאה היא פער ~ 10 שניות בין הקלטות ניסיוניות.
  12. Discarזבובים ד.
  13. בזירה וזכוכית נקיות צלחות עם אתנול 70% (שלב 4.4), ולהחליף צינורות מחבר בתוך מתחם האור חזק. כדי לזרז את ניסויים, זירה נקיה חדשה יכולה לשמש, ובזירה המלוכלכת לנקות בעת ביצוע ריצות ניסיון.
  14. הפעל ניסוי נוסף עם קבוצה חדשה של זבובים, אם נדרש. אם מספר ניסויים מנוהלים באותו היום, לקחת בזהירות רבה, כדי לוודא ששום odorant נשאר במערכת מריצת בדיקה קודמת. זה בדרך כלל לא בעיה עם ריכוזים נמוכים של ניחוחי או עם CO 2, אבל עבור מרוכז מאוד גירויים עד פער 24 שעות בין ריצות ניסיוניות עשויים להיות נחוץ. בנוסף, כל הצינורות לאחר צינורות הזרימה יכולים להיות מוחלפים אם זיהום odorant חשוד במהלך ניסויים שליטים. תמיד להשאיר באוויר היבש בין הניסויים כדי לרוקן את המערכת באופן רציף

ניתוח 5. נתונים

הערה: softwar רכישת מעקב זבוב הציעדואר (המפורטים חומרים), עוקב אחר הזבובים בזמן אמת במהלך הרכישה, ושומר את חותמת זמן הקואורדינטות של כל הזבובים מזוהה בפורמט .dat *. פיתחנו שגרה מחוייט Matlab כדי להמיר את הנתונים לפורמט Matlab, ולנתח את הנתונים. דוגמאות קוד ניתנות חומרים משלימים, אך פרטים של יישום יהיו תלויים בתוכנה המשמשת לרכישת נתונים.

  1. טען את הנתונים הגולמיים. יצירת מסכה מרחבית, בהתאם לקווי המתאר של הזירה ולהחיל את המסכה על הנתונים הגולמיים כדי להסיר את כל נקודות נתונים שנופלים מחוץ לזירה כפי שהם מייצגים רעש (איור 4 א, ​​משלים קוד MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask. M).
  2. הסר את כל נקודות נתונים שנעים במהירות מתחת 0.163 ס"מ / s עבור יותר -3, מכיוון שמידע זה עשוי להיות רעש או שנוצר על ידי זבובים שאינו זז (איור 4 ב ', משלים קוד TemporalFiltering.m).
  3. דמיינו נתונים הנותריםנקודות על ידי התוויית אותם בבת אחת או כמו מסלולי יחיד (איור 3, קוד משלים SingleTrajectoryViewer.m).
    הערה: המיקום של גבולות ריח של שדה ארבעה תלוי סביר על מספר גורמים, כגון המאפיינים של כל odorant ושיעורי זרימת האוויר בשימוש. לדוגמא, ניחוחי בתנודתיות גבוהה ימלא ברבע הריח סביר באופן מלא יותר מאשר ניחוחי תנודתי פחות. לפיכך סביר להניח כי כל odorant עשוי להפגין גבולות ריח שונים במקצת. השימוש בגלאי photoionization למדוד גבולות ריח יכול להיות בעייתי כפי שהיא משתמשת בוואקום לדגום אוויר מנקודה מסוימת, וכך משבש את הריכוז odorant בנקודה זו. עם זאת, גבולות ריח יכולים יוערכו בהתבסס במהירות על נתונים התנהגותיים זבוב. לדוגמא, גבול ריח המבוסס על מסלולי זבוב שנצברו בתגובת ריחות שונים ניתן להבחין בבירור 3C דמויות 3D.
  4. קאלculate אינדקס משיכה כדי לקבוע אם ניסויים שליטים לייצר שום תגובת העדפה, וגם לגשת בתגובת odorant (או 9 optogenetic) גירוי. כדי לחשב אטרקצית האינדקס (AI), להשתמש ב -5 הדקות האחרונות של הקלטה מלאה או בדיקה. כדי להשיג מידה של משיכה שנופלת בין +1 (משיכה מוחלטת) ו -1 (דחייה מוחלטת), הנוסחא הבאה משמשת לחישוב AI:
    figure-protocol-1
    שם בדיקת N היא מספר נקודות נתונים ברבע הבדיקה, בקרת N הוא המספר הממוצע של נקודות נתוני הרביעים המלאים השלושה. צעד זה הוא אינטואיטיבי כמו העדפה תצוין ערכים אפסיים. עם זאת, זה לא נכון לציין את חלקם של המספר הכולל של זבובים ממוקמים ברבע odorant. כדי להשיג מידה זו, אחוז במדד (PI) ניתן להשתמש:
    figure-protocol-2 שם בדיקת N היא מספר נקודות נתונים ברבע הבדיקה, ומוחלט N הוא המספר הכולל של נקודות נתונים בכל ארבעת הרביעים. נוסחה זו מספקת מדד שנופל בין 0 ל -1, עם 0.25 המתאים אין העדפה התנהגותית (איור 3E ו 4C, משלים קוד AttractionIndex.m).
  5. הפעל 5-10 חזרות על כל תנאי הניסוי, באמצעות קבוצה חדשה של זבובים לכל חוזרים. השוואת מדדי משיכה בין התנאים או נגד שולטת באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב הלא פרמטרית (איור 3F, פונקציה kstest2 ב- Matlab).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשומות assay אולפקטומטר הארבעה ברבע ומנתחות את פעילות הליכת זבובים רבים על פני שטח גדול התנהגותי. יכולים להיות הציגו ניחוחות לתוך הנחלים-האוויר שנכנסים אחת, שתיים, שלוש, או כל ארבעה רביעים. בהעדר ריחות, הזבובים יהיה לנוע בחופשיות בין כל ארבעת הרביעים. התנהגות זו היא קריטית להתבונן כפי שהוא מעיד כי הטיות בלתי מכוונות לא הוכנסו לתוך assay. הטיות אלו יכולים לכלול אור, תנודות הטמפרטורה, ההבדלים זרימת האוויר, או מזהמים ריח. איור 3 ב מצי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אולפקטומטר ארבע השדה המתוארת כאן הוא מערכת התנהגותית צדדית ללימוד תגובות חוש הריח של אוכלוסיות גדולות של wild-type ו מוטצית תסיסנית זבובים. כל ניסוי לוקח ~ 1 hr (כולל התקנה, ריצות ניסיון, וניקוי), ו 4-6 ניסויים ניתן לבצע באופן שיגרתי בכל יום. Assay טיפוסי באמצעות 40-50 זבובים במשך 5 דקות מייצר כ -450,000 במעקב נקודות נתונים לצורך ניתוח. תצורת המתוארים יכולה לשמש גם, עם שינויים קלים, כדי לפקח על תנועות של חרקים אחרים או זחלי חרקים בתגובת חוש ריח או גירויים חושיים אחרים על ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לטרי שלי על ייצור זירת הזבובים והמארז האטום לאור, לליז מאר על העזרה בתחזוקת מלאי הזבובים, ולשיאוג'ינג גאו וג'ונג'י לואו על העזרה בקוד Matlab המשמש לניתוח נתונים. אנו מודים ליוהאן לונדסטרום ממרכז מונל לחושים כימיים על הדגמת מערך אספקת הריחות שלו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן וייטהול (CJP) ו-NIH NIDCD (R01DC013070, CJP).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<מערכת אספקת אוויר >חזקה  <חזק>(הכמות הדרושה)
<חזק>צינורות ומחברים
תרמופלסטי NPT(F) סעפותקול-פארמר, אילינוי, ארה"בR-31522-311
הפחתת משושה  פטמה (1/4MNPT->1/8MNPT)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5232T3141
צינורות ( ID:1/8)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5108K43צינורות 50 רגל
(ID:1/16)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב52355K41אביזרי
צינור דוקרנייםמקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5117K71חבילה אחת
אביזרי צינור דחיפה לחיבורמקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5779K102אביזרי
צינור דוקרניים 4 (1/4MNPT->1/8BF)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5463K439חבילה 1 (10)
אביזרי צינור דוקרניים (1/8MNPT->1/8BF)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5463K4382 יח' (10) 
אביזרי צינור דוקרניים (1/8MNPT->1/16BF)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב5463K42 חבילות (10) 
אביזרי צינור דוקרניים (1/4MNPT->1/4BF)מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב  5670K841
תקע ראש משושהמקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב48335K1521
<חזק>ווסת לחץ אוויר, מסנן אוויר ומדי זרימה<חזק>(כמות דרושה)
יחידת ייבוש גז מעבדתיW A HAMMOND DRIERITE CO LTD, OH, ארה"בדגם: L68-NP-303; מלאי #268401
מסגרות Multitube לצינורות זרימה 150 מ"מCole-Parmer, IL, ארה"בR03215-301
מסגרות Multitube לצינורות זרימה 150 מ"מCole-Parmer, IL, USAR03215-761
צינורות זרימה 150 מ"מCole-Parmer, IL, ארה"בR-03217-159
מחסנית שסתומיםCole-Parmer, IL, ארה"בR-03218-729
ווסת אוויר מדויקמקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב6162K131
שסתומי סולניודאוטומציה מדעית, ברקלי, קליפורניה02-10i4
בקר שסתום סולנואידValveLink 8.2, אוטומציה מדעית, ברקלי, קליפורניה01-181
מד זרימה אלקטרוניHoneywellAWM3100V1
DAQ (NI USB-6009, National Instruments) ו-A National InstrumentsNI USB-60091
ספק כוחExtech Instruments3822001
תאי
צנצנת פה רחבה מפוליפרופילן 2 אונקיות; 60 מ"לNalgene562118-0002נדרשים לפחות 5 לכל ניסוי, אך נדרש תא נפרד לכל דילול של כל ריח. ניתן להשיג בחנות המכולות, חלק #635114)
תא ריח מזכוכית, 0.25 אונקיותבקבוק SunburstLB4Bנדרשים לפחות 5 לכל ניסוי 
שסתום "פנימה" לתא ריחSmart Products, Inc., CA, ארה"ב214224PB-0011S000-40741 מהחלקים הללו משמש לכל תא ריח אך יש להחליפם לעתים קרובות
שסתום "החוצה" לתא ריחSmart Products, Inc., CA, USA224214PB-0011S000-40741 מהחלקים הללו משמש לכל תא ריח אך יש להחליפם לעתים קרובות
טבעת O RTDygert International, מינסוטה, ארה"בAS568-029 Buna-N O-R1 חבילה (100)
זירה, תיבות מצלמה והתנהגות<חזק>(כמות נדרשת)
חומר התנהגות ותיבת מצלמהפלסטיק בין-מדינתי, CA, ארה"ABS שחור שחול (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)1803 אינץ'
רבועטפלון לזירת זבובים ותוספות תא ריח, עובי 3/8 אינץ', 12 אינץ' x 12 אינץ'מקמאסטר-קאר, אילינוי, ארה"ב8545K27 1
לוחות זכוכית, עובי 1/8 אינץ', 9 אינץ' x 9 אינץ'מקמאסטר-קאר, IL, ארה"ב8476K191 2
בקר תרמו-אלקטרי בעל פעולה כפולהWAtronix Inc, CA, ארה"בDA12V-K-01
מערך LED IRתאורה מתקדמת, רוצ'סטר, VT, ארה"בAL4554-88024, PS24-TL2 מערכי LED וספק כוח אחד
יחידת מזגןחנות מלקור  MAA280T-12
1Imaging System(Quantity required)
Cosmicar/Pentax C21211TH (12.5 מ"מ F/1.4) עדשת C-mount Bו-H Photo and Electronics Corp, NY, USAPEC21211 KP1
CCXC-12P05N כבל חיבורB ו-H Photo and Electronics Corp, NY, ארה"בSOCCXC12P05N 1
DC-700 מתאם מצלמהB AND H צילום ואלקטרוניקה CORP, NY, USASODC700 1
B+W 40,5 093 מסנן IRB ו-H צילום ואלקטרוניקה CORP, NY, USA65-0724421
TiFFEN 40.5 מ"מ מקטב עגולאמזון1
IR מצלמת וידאומקור ראייה תעשייתית, FL, ארה"בSony XC-EI50 (SY-XC-E150)1
ממיר וידאו USBThe Imagingsource, NC, ארה"בDFG / USB2-It1
iFlySpy2 (תוכנת מעקב זבובים)ג'וליאן בראון, סטנפורד, קליפורניה: julianrbrown@gmail.comiFlySpy21
IC Capture 2.2 תוכנהThe Imagingsource, NC, ארה"ב (http://www.theimagingsource.com/en_US/products/software/iccapture/)<
em>שונות(כמות דרושה)
Dremel כלי סיבובידרמל, רסין, ויסקונסין, ארה"בDremel 8000-03 1
מקדחים מצופים יהלום לחיתוך זכוכיתזמינים מספקים שונים; MSC אספקה תעשייתית ושות', מלוויל, ניו יורק906063281
100 רגל ריחב

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (3), 1112-1119 (1967).
  2. Thorpe, W. H. Further studies on pre-imaginal olfactory conditioning in insects. Proc R Soc B. 127 (848), 424-433 (1939).
  3. Tully, T., Quinn, W. G. Classical conditioning and retention in normal and mutant Drosophila melanogaster. J Comp Physiol A. 157 (2), 263-277 (1985).
  4. Anholt, R. R., Mackay, T. F. Quantitative genetic analyses of complex behaviours in Drosophila. Nat Rev Genet. 5 (11), 838-849 (2004).
  5. Vosshall, L. B. Into the mind of a fly. Nature. 450 (7167), 193-197 (2007).
  6. Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila. Sleep. 31 (4), 465-472 (2008).
  7. Dankert, H., Wang, L., Hoopfer, E. D., Anderson, D. J., Perona, P. Automated monitoring and analysis of social behavior in Drosophila. Nat Methods. 6 (4), 297-303 (2009).
  8. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  9. Aso, Y., et al. Mushroom body output neurons encode valence and guide memory-based action selection in Drosophila. Elife. 3, e04580(2014).
  10. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  11. Pfeiffer, B. D., et al. Refinement of tools for targeted gene expression in Drosophila. Genetics. 186 (2), 735-755 (2010).
  12. Venken, K. J., et al. Genome engineering: Drosophila melanogaster and beyond. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. , (2015).
  13. Diao, F., et al. Plug-and-play genetic access to drosophila cell types using exchangeable exon cassettes. Cell Rep. 10 (8), 1410-1421 (2015).
  14. Lin, C. C., Prokop-Prigge, K. A., Preti, G., Potter, C. J. Food odors trigger Drosophila males to deposit a pheromone that guides aggregation and female oviposition decisions. Elife. 4, (2015).
  15. Pettersson, J. An aphid sex attractant. Insect Systematics & Evolution. 1 (1), 63-73 (1970).
  16. Semmelhack, J. L., Wang, J. W. Select Drosophila glomeruli mediate innate olfactory attraction and aversion. Nature. 459 (7244), 218-223 (2009).
  17. Vet, L. E. M., Lenteren, J. C. V., Heymans, M., Meelis, E. An airflow olfactometer for measuring olfactory responses of hymenopterous parasitoids and other small insects. Physiological Entomology. 8 (1), 97-106 (1983).
  18. Faucher, C., Forstreuter, M., Hilker, M., de Bruyne, M. Behavioral responses of Drosophila to biogenic levels of carbon dioxide depend on life-stage, sex and olfactory context. J Exp Biol. 209 (Pt 14), 2739-2748 (2006).
  19. Katsov, A. Y., Clandinin, T. R. Motion processing streams in Drosophila are behaviorally specialized. Neuron. 59 (2), 322-335 (2008).
  20. Gao, X. J., et al. Specific kinematics and motor-related neurons for aversive chemotaxis in Drosophila. Curr Biol. 23 (13), 1163-1172 (2013).
  21. Gao, X. J., Clandinin, T. R., Luo, L. Extremely sparse olfactory inputs are sufficient to mediate innate aversion in Drosophila. PLoS One. 10 (4), e0125986(2015).
  22. Ronderos, D. S., Lin, C. C., Potter, C. J., Smith, D. P. Farnesol-detecting olfactory neurons in Drosophila. J Neurosci. 34 (11), 3959-3968 (2014).
  23. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 219-222 (2015).
  24. Lundstrom, J. N., Gordon, A. R., Alden, E. C., Boesveldt, S., Albrecht, J. Methods for building an inexpensive computer-controlled olfactometer for temporally-precise experiments. Int J Psychophysiol. 78 (2), 179-189 (2010).
  25. Colinet, H., Renault, D. Metabolic effects of CO2 anaesthesia in Drosophila melanogaster. Biology Letters. 8 (6), 1050-1054 (2012).
  26. Ramdya, P., et al. Mechanosensory interactions drive collective behaviour in Drosophila. Nature. 519 (7542), 233-236 (2015).
  27. Ofstad, T. A., Zuker, C. S., Reiser, M. B. Visual place learning in Drosophila melanogaster. Nature. 474 (7350), 204-207 (2011).
  28. Beshel, J., Zhong, Y. Graded encoding of food odor value in the Drosophila brain. J Neurosci. 33 (40), 15693-15704 (2013).
  29. Steck, K., et al. A high-throughput behavioral paradigm for Drosophila olfaction - The Flywalk. Sci Rep. 2, 361(2012).
  30. Thoma, M., Hansson, B. S., Knaden, M. High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm. J. Vis. Exp. (106), (2015).
  31. Claridge-Chang, A., et al. Writing memories with light-addressable reinforcement circuitry. Cell. 139 (2), 405-415 (2009).
  32. Parnas, M., Lin, A. C., Huetteroth, W., Miesenbock, G. Odor discrimination in Drosophila: from neural population codes to behavior. Neuron. 79 (5), 932-944 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Olfactory Behavior AssayDrosophila TrackingFour quadrant OlfactometerOdorant Chamber SetupFly Population AnalysisAirflow Rate VerificationData Analysis ScriptAttraction Index CalculationOlfactory Stimulus ResponseBehavioral Data Quantification

מאמרים קשורים