פיתוח של מערכת כנס עמית התרבות שני סוגים סלולריים בהעדר לתקשר Cell-Cell

סיכום

באורגניזמים רב-תאיים, גורמים מסיסים המופרשים מעוררים תגובות מסוגי תאים שונים כתוצאה מאיתות פרקריני. מערכות תרבית משותפת מציעות דרך פשוטה להעריך את השינויים המתווכים על ידי גורמים מסיסים המופרשים בהיעדר מגע תא-תא.

תקציר

תפקידם של גורמים מסיסים המופרשים בשינוי התגובות התאיות הוא נושא חוזר בחקר כל הרקמות והמערכות. בניסיון להבהיר את היחסים המורכבים מאוד בין מספר תת-הסוגים התאיים המרכיבים אורגניזמים רב-תאיים, פותחו טכניקות במבחנה כדי לסייע לחוקרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תאים בודדים. אחת הטכניקות הללו משתמשת בתוספות עם קרום חדיר המאפשר לגורמים מסיסים המופרשים להתפזר. לפיכך, אוכלוסיית תאים הגדלה בתוספות יכולה להיות מתורבת בבאר או בצלחת המכילה סוג תא אחר להערכת שינויים תאיים בעקבות איתות פרקריני בהיעדר מגע תא-תא. מערכות תרבית משותפת כאלה מציעות יתרונות שונים על פני טכניקות אחרות של תרבית משותפת, כלומר איתות דו-כיווני, קוטביות תאים שמורה וזיהוי ספציפי לאוכלוסייה של שינויים תאיים. בנוסף לשימוש בתחום הדלקת, הסרטן, אנגיוגנזה והתמיינות, מערכות קו-תרבית אלה הן בעלות חשיבות עליונה בחקר הקשרים המורכבים הקיימים בין תת-הסוגים התאיים השונים הקיימים במערכת העצבים המרכזית, במיוחד בהקשר של דלקת עצבית. מאמר זה מציע קווים מנחים מתודולוגיים כלליים על מנת להקים ניסוי על מנת להעריך שינויים תאיים המתווכים על ידי גורמים מסיסים המופרשים באמצעות מערכת תרבית משותפת. יתר על כן, יפורט פרוטוקול ספציפי למדידת ההשפעות הנוירו-דלקתיות של ציטוקינים המופרשים על ידי מיקרוגליה N9 המופעלת על ידי ליפופוליסכריד על תאי PC12 עצביים, המציע הבנה קונקרטית של מתודולוגיית תרבית משותפת.

מבוא

המחקר של רקמות, איברים או מערכות במבחנה הוא ניסיון לפשט את היחסים המורכבים מאוד הקיים בין תת הסלולר מספר המרכיבות יצורים רב-תאיים. ואכן, מחקרים במבחנה מאפשרים לרכוש הבנה מפורטת של אוכלוסיות תא בודדות. ישנם שני יתרונות גדולים של עורכת ניסויים במבחנה: 1) מופחתים אינטראקציות הסלולר, ו -2) את היכולת לתפעל את הסביבה התאית בקלות. לפיכך, שני יתרונות אלה מדענים מותר לחזות את ההתנהגות של סוגי תאים מסוימים in vivo, שמוביל את היכולת לווסת תוצאות של השפעות חיצוניות באורגניזמים כולו. במובן זה, תרבית תאים במבחנה בדרך כלל עובדת כגשר מחבר מדעי חיים בסיסיים ויישומים. עם זאת, ישנם גם כמה חסרונות של עבודה במבחנה, אחד החשוב ביותר להיות כי הזמנה מסוימת עשויה לשכון הפיזיולוגיאל הרלוונטיות של פנוטיפים שנצפו. ואכן, כאשר סוג תא בודד הוא גדל בתוך סיר, התרבות מאבדת במידה שונה, קשרים בין התאים עם סוגי תאים אחרים, תרומתה לסביבת הלחות מן רקמות האורגניזם מוצא, ואת העוגנים בתוך הרקמה, שאיפשרה לו לקיים מבנה תלת ממדי בפרט לפעמים חיוני לתפקוד התא.

שאל יחסים בין תאים טופל על ידי הפיתוח של טכניקות תרבות מעורבות. בשיטה זו, שתיים או יותר אוכלוסיות תאים גדלות יחד באותו כלי התרבות. עם זאת, תרבויות המעורבות אלה לשאת טרדות חשובות. מצד אחד, תת תא מסוים אינו אינטראקציה פיזית עם אחד אחר בתוך הרקמה ממוצא ולהסתמך אך ורק על תקשורת paracrine שנגרמה גורמים מסיסים מופרשים קולטנים סמוכים. זהו המקרה במשך כמה תהליכים דלקתיים שתלויים איתות ציטוקינים הפרוקסימלי. ב- C מעורבתultures, אינטראקציות פיסיות הם בלתי נמנעות ולעשות את זה אי אפשר ללמוד תקשורת paracrine בהעדר קשר תאי תאים שיכולים להניב תוצאות שינו. מצד שני, השגת פרשנויות תא ספציפי מתוך אוכלוסייה מעורבת הופך ישים ללא שימוש בטכניקות הפרדה קשים שיש בהם כדי להשפיע באופן משמעותי תוצאות.

כדי לפתור סוגיות חשובות אלה, השימוש בתקשורת מותנית פותח כטכניקה המאפשרת תרבויות ממודרות וחקר האיתות אוטוקריני. שיטה זו דורשת העברת supernatant של סוג תא אחד, ובכך בשם בינוני מותנה, כדי בארות המכילות אוכלוסייה אחרת של תאים. עם זאת, חיסרון שחשוב זה מולקולות קצרת אינם שורדים מספיק זמן במדיום מותנה שיועברו הבארות של האוכלוסייה השנייה של תאים. גם מולקולות האריכה ימים ידוללו באופן משמעותי לאורך זמן עקב דיפוזיה. יתר על כן, הן תאאוכלוסיות להשתתף רק בתקשורת paracrine חד כיווני ולא בתקשורת דו-כיוונית פעילה. זה מוביל בהעדר איתות כי משוב הוא חיוני מחדש יחסים רב-תאיים מדויק ככל שהם קיימים in vivo.

כתוצאה מכך מונע על ידי הצורך לדמות את המקורי טוב יותר בתנאי vivo בסביבת הסלולר במבחנה, כמה התקדמות טכניקות תרבית תאים הושגה במהלך השנים. אחד הפיתוחים המשמעותיים ביותר כבר בשימוש תומך חדיר עם ממברנות microporous עבור מידור בתרביות תאים, השתמשו בפעם הראשונה על ידי Grobstein בשנת 1953 ^1. תומך חדיר כאלה כבר מותאם לאורך השנים כדי להתאים סוגי תאים רבים כדי לשמש בכמה יישומים שונים. כיום, עזרה כזאת להתקיים כתוספות חלולות אשר נועדו לנוח בבארות מתוך צלחת תרבות multiwell רקמות או circuמנות Lar. במערכת שיתוף תרבות, את הכנס מכיל סוג תא אחד ואילו הבאר או צלחת מכילה האוכלוסייה התאית האחרת, מה שמאפשר ללמוד את התרומה של שתי אוכלוסיות שונות של תאים על סביבת הלחות שלהם (איור 1). כתוצאה מכך, קוטביות הסלולר (basolateral vs הפרשת פסגה או קבלת אות) נשמרה, ובכך מקנה מערכות שיתוף תרבות כנס יתרון חשוב על פני תרבויות מעורבות וטכניקות בינוניות מותנות. ישנם מספר סוגים של חומרי קרום זמינים, אלה הנפוצים ביותר פוליאסטר להיות (PET), פוליקרבונט (PC) או מצופה קולגן polytetrafluoroethylene (PTFE), והם קיימים בגדלים נקבוביים שונים הנעים בין 0.4 מיקרומטר 12.0 מיקרומטר. אלו סוגים של חומרים וגדלים נקבוביים מציעים קשת של הוסיף הפעלת תכונות משתנות רלוונטיות תכונות אופטיות, עובי קרום ודבק תא שהופכים אותם מעשיות ברמות שונות עבור השימושים הבאים לא מוגבלים ל:
-studyingהתמיינות תאים, התפתחות עוברית, גרורות של גידולים ותיקון פצע על ידי מבחני chemotaxic דרך ממברנות חדירות;
-evaluating חדירה התרופה על ידי הערכת התחבורה שלהם באמצעות monolayers אפיתל או אנדותל בתרבית על תומך חדיר, ו;
תא שיתוף תרבויות -ביצוע לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים.

מטרת מאמר זה היא לתאר שיקולים מתודיים הרחב למלא את הפונקציה השלישית כאמור לעיל, כי היא להעריך שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. שדות שונים של מחקר לעשות שימוש במערכות שיתוף תרבות הכנס על מנת לענות על שאלות רלוונטיות שפעת גורמים מסיסים המופרשים על אוכלוסיות של תאים. ואכן, איתות אוטוקריני כי מודולציה התנהגות הסלולר ברמות שונות היא רלוונטית בכל הרקמותומערכות, מה שהופך מערכות שיתוף תרבות הכנס הכרחית כדי להבטיח התקדמות בתחומים אלה. לעומת זאת, השימוש מוסיף יכול לאשר כי תמרת אות על ידי מגע תאי תאים ישיר ולא על ידי גורמים מופרשים. אחד השימושים החשובים ביותר של מוסיף הוא במחקרי דלקת ^2-14 בם ההשפעה של ציטוקינים מופרשים מוערכת ב שחקנים הסלולר שונים של חסינות. בפרט, המחקר של דלקת במערכת העצבים המרכזית (CNS) הרוויח מאוד ממחקרי שיתוף תרבות כנס, אשר אפשרו עדיפה בהגדרת תפקידי paracrine הברור של נוירונים המיקרוגליאה נהיגת neuroinflammation ^15-21. מערכות אלו תוכננו גם ללמוד את הפוטנציאל האנטי-דלקתיות של מולקולות המסתמכת על יכולתם להפחית או למנוע את הפרשת גורמים פרו-דלקתיים ^22-26. מחקר הנוגע סרטן ^27-31, בפרט מנגנוני אנגיוגנזה ^32-34 ו inflammatiעל ^35-42 ב tumorigenesis, נהנה גם מערכות שיתוף תרבות הכנס. יתר על כן, גורמים מסיסים הם בעלות חשיבות עליונה בתהליכים שמניעי הבידול מספר מחקרים השתמשו מוסיף לענות על שאלות בדרך מסוימת שדה ^43-50. במערכת העצבים המרכזית, כמו לראות רקמה עצבית יש פוטנציאל התחדשות מוגבלת מאוד, חקר neurotrophism ו neuroprotection הוא יסודי כבר הבטיחו נרחב על ידי שימוש בתאי גזע במערכות שיתוף התרבות ^51-56. בנוסף, מוסיף גם מנוצלים בתחומים מגוונים כמו נפרולוגיה ^57,58, אינטראקציות האנדותל אנגיוגנזה ^59-62, אפופטוזיס איתות ^63-65, דלקת השמנה ותסמונת מטבולית ^22,23,66-67, אוזן פנימית הגנה על תאי שיער ^68,69, ואפילו ארסי פטריית ^70,71 ופרזיטולוגיה ^72,73.

מאמר זה מציע קווים מנחי מתודולוגיים כללי כדי להקים experimאף אוזן גרון לאור הערכת שינויים הסלולר בתיווך גורמים מסיסים מופרשים באמצעות מערכת שיתוף תרבות הכנס. בפרט, נוכל למקד את תשומת הלב שלנו על תרבויות-שיתוף תא העצב ואת השימושים שלהם בלימוד תהליך neuroinflammatory. בהתחשב הספקטרום רחב מאוד של ניסויים מוסיף לאפשר לטייס, זה בלתי נסבל לכסות כל היבט של טכניקת תרבית תאים זה. כדוגמא, פרוטוקול ספציפי כדי למדוד את ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי lipopolysaccharide (LPS) -activated microglia N9 על תאי PC12 עצביים שיפורט, מציע הבנה בטון של המתודולוגיה שיתוף תרבות כנס.

פרוטוקול

נ.ב: כל אחד מן השלבים הבאים צריך להתבצע בתנאים סטריליים במנדף זרימה למינרית כנדרש על תרבית תאים יונקת. בנוסף, ההנחיות הכלליות לגידול תאים סטריליים אופטימליים להחיל, למשל., השלכת טיפים בכל עת שהם עלולים לגרום זיהום צולב, הפחתת כמות תאי הזמן נחשפים לאוויר בעת ביצוע שינויים התקשורת כולו, כמו שצריך, אבל בעדינות כדי ערבוב את כל המתלים תא כדי להבטיח pipetting הומוגנית שלהם, ועוד יותר מכך, מוסיף הם סוג של plasticware הדורשים טיפול מיוחד. ראשית, בכל פעם מוסיפה הם מניפולציה, אל תיגע קרום השביר, הקורעת בקלות ולכן עלול לסכן את הניסוי. כמו כן, אין זה נכון להציג ואקום שאיפה של מדיום תרבית תאים, כפי קיים סיכון של ניקוב הקרום או מתנערים תאים חסידים. לאחר מכן, מוסיף לתלות רופפת בצלחת תרבות multiwell רקמות, ולכן יש להיזהר מועסק כאשר מווינג plasticware או כאשר pipetting להימנע מתנערים תאים חסידים. בנוסף, בעת שימוש מוסיף עם גדלים נקבוביים גדולים, קיימת אפשרות כי מדיום תרבית תאים מחלחל דרך הממברנה, ולכן חשוב לעקוב אחר רמת נוזל לעתים קרובות. לבסוף, יש לציין כי הפרוטוקול הבא מיועד תאים חסידים ודורש שינויים קלים כדי להיות מתאים תאי השעיה.

1. הנחיות כלליות לביצוע ניסויי שיתוף התרבות כנס

1. סוג תא מתזמן # 1 מוסיף
   1. לגולל את מוסיף מהאריזה שלהם.
   2. מניחים את מוסיף ב צלחת בתרבית רקמה multiwell ריק של הממד הנכון. לשם כך, אחיזה בקצה העליון של הכנס באמצעות פינצטה.
   3. כדי לשפר את ההתקשרות והפצת תאים חסידים, להתנות מחדיר עם תרבית תאים בינוני לפני הזריעה. לשם כך, לכסות את כל פני השטח של הממברנה עם mediu תרבית תאיםמ באמצעות micropipette.
      הערה: בצע פעולה זו עבור רבים מוסיפים כנדרש.
   4. החלף את המכסה על הצלחת דגירה במשך לפחות שעה 1 או O / N באותם תנאים (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס, 5-10% CO _2).
   5. כאשר מוסיף מותנים, להסיר את כל מדיום תרבית תאים באמצעות micropipette. מחק את המדיום בשימוש.
   6. סוג תא זרע # 1 במדיום תרבית תאים טרי באותו אופן כמו צלחת multiwell. לשם כך, לצייר נפח מתאים של השעיה התא עם micropipette לוותר הנוזל להכניס את.
      הערה: כן כמו רבים מוסיפים כנדרש.
   7. לאחר זריעת כל המוסיף, נער בעדינות את הצלחת על ימין ועל שמאל, אז קדימה ואחורה כדי לפזר את התאים באופן שווה. הימנע בתנועות סיבוביות, כמו זה יגרום לתאים לצבור במרכז מוסיף.
   8. מניחים את המכסה על הצלחת דגירה כפי שצוין על ידי בהתאם לדרישות הסלולר (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס, 5-10% CO _2).
2. סוג תא מתזמן # 2 צלחות בתרבית רקמה multiwell
   1. סוג תא זרע # 2 במדיום תרבית תאים טרי לפי סעיף 1.
   2. הכן כמה בארות כנדרש עבור מספר מוסיף. Rock the צלחת כמו בשלב 1.1.7) על מנת להבטיח כי התאים מופצים בצורה אחידה בתוך הבארות.
   3. מניחים את המכסה על הצלחת דגירה באותם תנאים (בדרך כלל 37 מעלות צלזיוס, 5-10% CO _2).
3. בינוני מרענן מוסיף
   1. שימוש micropipette, להסיר חלק או את כל תרבית תאים בינוניים, ב מחדיר המכיל סוג תא # 1. מחק את המדיום בשימוש.
   2. צייר נפח מתאים של תרבית תאים בינוניים טריים. בעדינות לנוח הקצה על הקיר הפנימי של להכניס ולאט לאט לוותר על תרבית תאים בינונית.
   3. מניחים את המכסה על הצלחת דגירה לפי צעד 1.1.4.
4. בינוני מרעננת צלחות בתרבית רקמה multiwell
   1. באמצעות micropipette, להסיר חלק או את כל מדיום תרבות תאי הבארות המכילות סוג התא # 2. מחק את המדיום בשימוש.
   2. צייר נפח מתאים של תרבית תאים בינוניים טריים. הנח את הקצה על הקיר הפנימי של הבאר לאט לוותר על תרבית תאים בינונית.
   3. מניח את המכסה על הצלחת דגירה על פי פרוטוקולי תרבית תאים הוקמו בעבר.
5. העברת מוסיף המכיל סוג תא # 1 צלחות תרבות multiwell רקמה המכילה תאים מסוג # 2.
   הערה: בצע פעולה זו כאשר סוגי התאים הן הגיעו לשלב הצמיחה המתאים.
   1. לפני ההעברה מוסיפה לתוך בארות, לבצע שינויים בינוניים צורך, כפי שתואר לעיל בצעדים 1.3) ו -1.4).
      הערה: בשלב זה, חשוב לוותר הכרכים המתאימים של תקשורת בשני התאים כפי שצוין על ידי ל'הוסף של היצרן.
   2. בעזרת פינצטה, אחיזה בקצה העליון של אינסרט המכיל תאי Type # 1 ובעדינות למקם אותו # סוג התא המתאים היטב המכיל 2.
   3. לאחר העביר כל המוסיף, לבדוק את קיומו של בועות אוויר מתחת הקרום של מוסיף.
      הערה: בועות אוויר למנוע כל חילופי דרך הממברנה של הכנס ויכולות לסכן את הניסוי כולו.
   4. אם בועות אוויר נוכחים, מאוד בעדינות להרים את הכנס מהמלקחיים באמצעות היטב לצלול בחזרה לתוך המדיום תרבית תאים. הבועות תיעלמנה. אם הם עדיין יהיו קיימים, כדאי לטבול בעדינות מוסיף בחזרה לתוך המדיום תרבית תאים בזווית.
      הערה: אין לדבר סר או לעורר מוסיפים להימנע מתנערים תאים חסידים.
   5. לאחר הסרת כל בועות האוויר והבדיקה כי הכרכים של תקשורת בתאי שניהם, לשים את המכסה על הצלחת דגירה.
6. תקשורת מרעננת מערכת שיתוף התרבות
   הערה: למרות הממברנה בקלות מאפשר חילופי תקשורת בין הכנס היטב, מרענן המדיום נעשההן תאים מאז הזמן הנדרש כדי להגיע לשיווי משקל במדורים העליונים והתחתונים ידי דיפוזיה לבד יכול להיות ארוך למדי.
   1. בינוני מרענן הוסיף המכיל סוג תא # 1 נעשה באותה הדרך כמו בשלב 1.3).
   2. כדי לרענן בינוני בבארות התא המכיל סוג # 2, החלק בעדינות את הכנס לצד ליצור מרחב רחב מספיק כדי להכיל קצה פיפטה. רענן המדיום כמו בשלב 1.4).
   3. לבדוק את קיומו של בועות אוויר ולאמת הכרכים לפי 1.5.3 צעדים) דרך 1.5.5).

דוגמה 2: מדידת ההשפעות של ציטוקינים המופרשים על ידי microglia N9 המופעל LPS בתאי PC12 העצבית

הערה: השלבים הבאים יועד בקבוק ספציפי, גם וגדל צלחת. עם זאת, הפרוטוקול יכול להיות מותאם אישית עבור כל ממד plasticware. לגבי המדיה רכב ראה טבלת חומרים.

1. זריעה ומבדל תאי PC12 ב רבגם צלחות בתרבית רקמה
   1. בינוני PC12 תרבית תאים שגרה חם, בינוני בידול PC12 טריפסין-EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   2. השתמש בתאי PC12 בנקודת מפגש 60-80% מבקבוקון ² 75 סנטימטר.
   3. עם טפטף 15 מ"מ פסטר, לבצע שאיפת ואקום של מדיום תרבית תאים כולו בבקבוק.
   4. לשטוף בעדינות את monolayer תא עם 5 מ"ל של בופר פוספט סטרילי ולהסיר את הנוזל עם פיפטה פסטר. היזהר שלא לנתק תאים בשלב זה.
   5. מכסים את monolayer תא עם 3 מ"ל של טריפסין-EDTA דגירה במשך 2-3 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
   6. ודא כי כל התאים מנותקים תחת מיקרוסקופ. אם תאי מעטים הם צפים, דגירה לתקופה ארוכה לתקופה מקסימלית של 5 דקות.
   7. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים שגרת PC12 כדי לנטרל את טריפסין-EDTA.
   8. עם פיפטה 10 מ"ל, בעדינות triturate תוך שהוא מוודא כי רוב התאים הם ניתק מלמטה of הבקבוק. הימנע מיצירת בועות אוויר השעית התא.
   9. עם אותה פיפטה 10 מ"ל, ולהעביר את ההשעיה תא צינור צנטריפוגה 50 מ"ל.
   10. צנטריפוגה 1 דקות ב 3,200 XG
   11. בטל supernatant עם פיפטה פסטר תוך הקפדה שלא להפריע גלולה.
   12. הוסף 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים שגרת PC12 עם טפטפת 10 מ"ל.
       הערה: נפח זה יכול להיות מותאם אם הגלולה היא יוצאת דופן קטנה או גדולה.
   13. Triturate עם פיפטה 10 מ"ל אותו כדי homogenize גלולה. PC12 תאים לעתים קרובות גוש ביחד כך לפחות 20 pipetting למעלה downare הצורך.
       הערה: בעוד triturating הנמרץ הוא הכרחי, למנוע יצירת בועות אוויר השעית התא.
   14. בתוך צינור 1.5 מיליליטר, להכין דילול מתאים השעית תא trypan הכחולה. ספירת התאים באמצעות hemocytometer על פי פרוטוקולים הוקמו בעבר ^74.
   15. בתוך צינור 50 מ"ל נפרד, לפצל את ההשעיה תאעם בינוני בידול PC12 להשיג מתאים השעית תא בדילול זריעת בארות מתוך צלחת 24 גם (30,000 ¢ / ² סנטימטר, 0.6 מיליליטר לכל טוב פי הפרוטוקול של היצרן).
       הערה: צלחת 24 גם חייב להיות מצופה בעבר עם קולגן כפי שצוין על ידי פרוטוקולים הוקמה בעבר ^75.
   16. הפץ 0.6 מ"ל של ההשעיה תא לכל טוב באמצעות micropipette.
   17. כאשר כל הבארות הם זורעים, לטלטל את הצלחת כמו בשלב 1.1.7).
   18. כדי לאפשר הבידול התקין של תאי PC12, דגירת 24 גם הצלחות עבור 7-9 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה 5% CO ₂ במדיום בידול PC12 ^15,16 לפני ביצוע ניסויי תרבות המשותפת.
   19. בצע שינויים בינוניים כל כמה ימים על ידי הסרת מחצית הנוזל והחלפתו נפח שווה של בינוני בידול PC12 טרי.
2. זריעת microglia N9 ב מחדיר וטיפול עם LPS
   1. יום אחד לפני ביצוע ניסויי התרבות-שיתוף, טרום לטפל PTFE 0.4 מוסיף מיקרומטר נקבובי עם תרבית תאים בינוני שגרת N9 לייעל דבקות תא, ביצוע שלבי 1.1.1) דרך 1.1.4)
   2. בינוני N9 תרבית תאים שגרה חם טריפסין-EDTA באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
   3. בינתיים, שוקל כ 10 מ"ג של LPS צינור 1.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר.
      הערה: מאז LPS הוא רעלן פנימי הפר דלקתי חזק דורש אמצעי זהירות מסוימת, משקפים, כפפות, ומכשיר נשמת חלקיקים מומלץ בחום.
   4. השתמש בתאים N9 בנקודת המפגש 80-90% מבקבוקון ² 75 ס"מ.
   5. בצע את השלבים 2.1.3) כדי 2.1.14). השתמש תמיד בינוני N9 תרבית תאים שגרתית במקום בינוני תרבות PC12 תא שגרתית. כמו כן שים לב microglia N9 לא להתגודד יחדיו ככל תאי PC12 לעשות, כך פחות pipetting למעלה ולמטה עשוי להיות נחוץ בשלב 2.1.13).
   6. בתוך צינור 50 מ"ל נפרד, לפצל את ההשעיה תא עם תרבית תאים בינוניים N9 כדי obtain השעית תא בדילול מתאימה זריעה מוסיפה נועד להחזיק ב 24 גם צלחות (60,000 ¢ / ² סנטימטר, 0.05 מיליליטר לכל כנס פי הפרוטוקול של היצרן, עבור שטח פן קרום לראות מידע יצרן).
      הערה: מוסיף אלה כבר מצופה קולגן על ידי היצרן והם אופטימיזציה עבור הידבקות התא.
   7. פזר 0.05 מ"ל של ההשעיה תא לכל הכנס באמצעות micropipette.
   8. כשכל מוסיף הם זורעים, לטלטל את הצלחת כמו בשלב 1.1.7).
   9. בצע דילולים סדרתי של LPS באמצעות מדיום טיפול N9 להשיג 4 מיקרוגרם / מ"ל, 2 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​פתרונות עובד.
   10. פיפטה 0.05 מ"ל של הפתרון עובד 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​באחד הסט של מוסיף על מנת להניב דילול הסופי של 2 מיקרוגרם / מ"ל.
   11. חזור על שלב 2.2.10) עבור פתרונות עובד בשתי אחרים מוסיף קבוצות שונות, מניב דילולים סופי של 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​בהתאמה.
   12. בcubate צלחות המכילות מחדיר למשך 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס באווירה לחה 5% CO ₂ כדי לאפשר הפעלת microglia N9 עם LPS לפני ביצוע ניסויי התרבות המשותפת.
3. Co-טיפוח PC12 תאים עצביים עם microglia N9
   1. בשעה 7-9 ימים של הבחנה PC12 תאים, להפעיל את microglia N9 לאחר 24 שעות של דגירה עם LPS ידי בינוני טיפול N9 חם ובינוניים טיפול PC12 באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
   2. בצע שינוי בינוני הכולל microglia N9 כמו בשלב 1.3), החלפת בינוני משומשים כולה ב -0.1 מ"ל של מדיום טיפול N9. האם זה עבור כל insert.This יש צורך להסיר את כל עקבות של LPS, עוזב microglia N9 מופעל רק מוסיף.
   3. בצע שינוי בינוני הכולל תאי PC12 עצביים כמו בשלב 1.4). מעבירים את מוסיף לתוך 24 גם הצלחות כמו בשלב 1.5) .Incubate N9-PC12 שיתוף תרבויות למשך 24 שעות או 48 שעות ב 37 ° C באווירה לח 5% CO _2.
   4. אחרי 24hr או 48 שעות, לקצור את supernatant ו / או תאים עבור cytotoxicity, assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA), כתם המערבי, או מבחני אחרים.

תוצאות

השימוש במערכות שיתוף תרבות כנס רלוונטי במיוחד בחקר של תהליכי neuroinflammatory שופכי אור יחסי paracrine בין שחקנים סלולריים השונים של מערכת העצבים המרכזית. חסינות של מערכת העצבים המרכזי מושגת בעיקר על ידי תאי תושב קרואי מיקרוגליאה מנטר סביבתם במצב מסועף הנח שלהם (איור 2 א) ומסוגלים הפרעות חישה שיכול להטריד את הומאוסטזיס יקרה מאוד הכרחית לתפקוד עצבי ראוי ^76-78. הפעלת microglial, המאופיינת אימוץ צורה אמבואידית (תרש...

דיון

השלב הקריטי ביותר של כל ניסוי מערכת שיתוף תרבות כנס למעשה שוכן בבחירת הכנס הראוי לשימוש. גודל נקבובי וחומר קרום חייבים להילקח בחשבון יסודי, מבלי לשכוח לקחת בחשבון את הסוג של תא יהיה זורע ואת מטרת הניסוי. לדוגמה, מבחני chemotaxic עשויים להשתמש באותו סוג של קרום מ שיתוף תרבויות התא לנתח מודולציות התנהגות התא הנגרמת על ידי גורמים מסיסים מופרש בהעדר מגע תאים תאים. עם זאת, שני סוגי ניסויים דורשים גדלים נקבוביים שונים: בגדולים עבור לשעבר, כדי לאפשר נדידת תאים, ואת קטנים באפשרות השנייה, ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
RPMI-1640 בינוני	סיגמא	R8755	חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
Dulbecco' s Modified Eagle' s תערובת בינונית/תזונתית F-12 חזיר	Sigma	D6421	חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש, יש להוסיף 0.365 גרם/ליטר סרום L-גלוטמין
לסוסים	ATCC	30-2040	חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש
סרום בקר עוברי	MultiCell	80350	חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
Nerve Growth Factor-7S מבלוטה תת-לסתית של עכברים	Sigma	N0513	להרכיב מחדש את האבקה הליופילית בתמיסה של תמיסת מלח חוצצת או מדיום תרבית רקמה המכיל 0.1– 1.0% אלבומין בסרום בקר או 1-10% סרום
תמיסת טריפסין-EDTA	Sigma	T3924	חם ב-37 מעלות; אמבט מים C לפני השימוש
ליפופוליסכרידים מ  Escherichia coli  055:B5	Sigma	L2880
מוסיף תרבית תאים רעילים לשימוש עם צלחות 24 בארות	BD Falcon		353095 0.4 μ m נקבוביות
צלחות 24 בארות	ציפוי TrueLine	TR5002	עם קולגן לפני השימוש
מדיום			שגרתי מדיום תרבית תאי N9 שגרתי
-            85% RPMI בינוני			-            90% DMEM-F12 בינוני
-            10% סרום סוסים מומת בחום			10% סרום סוסים מומת בחום
-            5% סרום
PC12 מדיום			התמיינות N9 מדיום טיפול
-              99% RPMI בינוני			-            99% DMEM-F12 בינוני
-              1% סרום בקר עוברי מומת בחום			1% סרום בקר עוברי מומת בחום
-              50 ננוגרם/מ"ל גורם
PC12 מדיום
-              99% RPMI בינוני
-              1% סרום