מטרת פרוטוקול זה היא להראות את הפרוטוקול לתכנות מחדש של לימפוציטים חודרים לגידול מלנומה לתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
דור של תאי גזע מושרים ממלנומה האדם שחדר-גידול לימפוציטים
במאמר זה
סיכום
תקציר
העברת מאמצת של vivo לשעבר מורחבת לימפוציטים עצמיים שחדר-גידול (TILs) יכולה לתווך תגובות יציבות ומלאות תת משמעותי של חולים עם מלנומה גרורתית. מכשולים עיקריים של גישה זו הם כדאיים המופחתת של תאי T להעברה, הנגרמים על ידי קיצור הטלומרים, והמספר המצומצם של TILs המתקבל חולה. פחות בדיל תאי T טלומרים ארוכים יהיו משנה תאי T אידיאלי עבור טיפול בתאים T מאמצת, אולם יצירת מספר גדול של תאי T פחות בדיל אלה הן בעייתית. מגבלה זו של טיפול T תא מאמצת ניתן להתגבר באופן תיאורטי על ידי תאי גזע מושרים אלקטרוניים (iPSCs) כי עצמי לחדש, לשמור pluripotency, יש טלומרים מוארכים, ומהווה מקור בלתי מוגבל של תאי T עצמיים עבור חיסוני. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצור iPSCs באמצעות וקטורי וירוס סנדאי עבור התמרה של גורמי תכנות מחדש לתוך TILs. פרוטוקול זה ליצורזה מלא לתכנות מחדש, שיבוטים וקטור חינם. TIL נגזר אלה iPSCs עלול להיות מסוגל לייצר פחות בדיל בפציינט, ואת הגידול ספציפי תא T עבור טיפול בתא מאמצת T.
מבוא
הטכנולוגיה לתכנות מחדש של תאים המאפשר דור של תאי גזע מושרים (iPSCs) דרך ביטוי יתר של קבוצה מוגדרת של גורמי שעתוק טומן בחובו הבטחה גדולה בתחום טיפולים מבוססי תאים 1,2. IPSCs אלה להפגין תכונות תעתיק ו אפיגנטיים ויש להם את היכולת התחדשות עצמית pluripotency, בדומה לתאי גזע עובריים (ESCs) 3-5. התקדמות מרשימה שנעשו בטכנולוגיה תכנות מחדש בעשור האחרון אפשרה לנו ליצור iPSCs האנושית אפילו תאים מובחנים סופני, כגון תאי T 6-8. T תאים שמקורם iPSCs (TiPSCs) לשמור על אותה התצורה מחדש של קולטן תא T (TCR) גני שרשרת כמו תאי T המקוריים, אשר מאפשרת התחדשות של תאי T אנטיגן ספציפי מן TiPSCs 9-11.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: חולים צריכים לתת הסכמה מהדעת להשתתף דירקטוריון הסקירה המוסדי האנוש pluripotent גזע ועדת Cell אשרה מחקר.
1. ניתוק והתרבות של TILs
- להשיג חומר גידול כי אינו נדרש לאבחון histopathologic מליבת רכש פתולוגיה שירות / רקמות. מניחים 20-100 גרם של דגימות הגידול בתוך שפופרת 50 מ"ל עם 30 מ"ל התקשורת איסוף הגידול (טבלה 1).
- לנתח מוצק, מוצק, רקמות בריאות של דגימת גידול מאזורים נמקי שברירי ו / או דמים באמצעות מספריי....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1 מציג סקירה כללית של ההליך המערבת את ההתפשטות הראשונית של מלנומה TILs עם rhIL-2, אשר מלווה הפעלה עם אנטי CD3 / CD28 ו הגן העברת OCT3 / 4, KLF4, Sox2, ו- c-myc כדי TILs עבור הדור של iPSCs. בדרך כלל, TILs על תרבות עם תחילת rhIL-2 כדי ליצור כדורים 21-28 ימים לאחר תחילת התרבות. בשלב זה, TILs מוכנים להיות מופעל עם אנטי CD3 / CD28. איור 2 א מראה TILs, על תרבות עם rhIL-2 ביום 21, כי הם מוכנים להיות מופעל עם אנטי CD3.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הנה, הראינו פרוטוקול תכנות מחדש מלנומה TILs כדי iPSCs ידי התמרה בתיווך sev של שעתוק ארבעה גורמים OCT3 / 4, Sox2, KLF4, ו- c-myc. גישה זו, באמצעות מערכת sev לתכנת מחדש תאי T, מציעה את היתרון של שיטת שילוב אי 7.
מחקר קודם הראה כי מערכת תכנות מחדש sev היה יעיל מאוד ואמין לתכנת מחדש לא רק פיברובלסטים אלא גם תאים היקפיים דם T 7,17. בנוסף, אנו לאחרונה הראינו כי TILs מלנומה כי הם מובחנים יותר ולהבי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים לגב' דבורה פוסטיף ולגב' ג'קלין בריקדר בליבת רכש הרקמות ולד"ר סינדי דלונג במעבדת ליבת תאי גזע פלוריפוטנטיים באוניברסיטת מישיגן על הסיוע הטכני שלה. מחקר זה נתמך על ידי מימון סטארט-אפ של אוניברסיטת מישיגן ומענקים מהאגודה הכירורגית המרכזית, הקולג' האמריקאי למנתחים, ברית מחקר המלנומה ו-NIH/NCI (1K08CA197966-01) ל-F. Ito.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| צינורות MACS C עדינים | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | |
| MACS Dissociator עדין | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| ערכת דיסוציאציה של גידולים, Human | Miltenyi Biotec | 130-095-929 | |
| RPMI 1640 | Life technologies | 11875-093 | |
| Falcon 70 um Cell Sfilters | BD | 352350 | |
| BD Falcon 50 מ"ל צינורות קנטריפוגה חרוטיים | BD | 352070 | |
| IMDM | טכנולוגיות חיים | 12440053 | |
| סרום AB אנושי | טכנולוגיות חיים | 34005100 | |
| L-גלוטמין (200 מ"מ) | טכנולוגיות חיים | 25030-081 | |
| 2-מרקפטואתנול (1000x, 55 מ"מ) | טכנולוגיות חיים | 21985-023 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | טכנולוגיות חיים | 15140-122 | |
| גנטמיצין | טכנולוגיות חיים | 15750-060 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE | 17-1440-02 | |
| D-PBS (-) | טכנולוגיות חיים | 14040-133 | |
| רקומביננטי אנושי (rh) IL-2 | Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc. | ||
| עכבר NA/LE מטוהר אנטי-אנושי CD3 | BD | 555329 | |
| מטוהר NA/LE עכבר אנטי-אנושי CD28 | BD | ||
| 15 | Lonza | 04-418Q | |
| FBS | Gibco | 26140-079 | |
| HEPES | Life technologies | 15630-080 | |
| N-אצטילציסטאין | קמברלנד פרמצבטיקה בע"מ | NDC 66220-207-30 | |
| צלחות תרבית רקמות פלקון (6 בארות) | פלקון | 353046 | |
| (24 בארות) | קורנינג | 353047 | |
| וקטור וירוס סנדאי | תאי הזנה DNAVEC | ||
| SNL | Cell Biolabs, Inc | CBA-316 | |
| מיטומיצין C | SIGMA | M4287 | מסיס במים (0.5 מ"ג/מ"ל) |
| ג'לטין | SIGMA | G1890 | |
| גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF) | טכנולוגיות חיים | PHG0264 |
מקורות
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibrobl....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
