Method Article

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

DOI:

10.3791/54389

⸱

July 27th, 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גישות טיהור זיקה הצליחו לבודד מתחמי יליד לאפיון proteomic. ההטרוגניות מבנית ומידה של ההטרוגניות הלחנה של קומפלקס בדרך כלל לא לעכב את ההתקדמות בביצוע מחקרים כאלה. לעומת זאת, קומפלקס המיועד אפיון מבניים צריך להיטהר בתוך מדינה שהיא גם בעלי הרכב הומוגני מבחינה מבנית כמו גם בריכוז גבוה מהנדרש עבור חקר החלבונים. לאחרונה, חלה התקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית לקביעת מבנה של קומפלקסי macromolecular גדולים. זה הגביר עניין גישות לטהר מתחמי יליד באיכות מספקת וכמות לקביעה מבנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. טיהור זיקה טנדם (TAP) השיטה בצורה מיטבית כדי לחלץ ולטהר 18-למקטע, ~ 0.8 הרכבה ribonucleoprotein מד"א שמרים ניצני (שמר האפייה)

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תהליכים תאיים גדולים רבים מבוצעים על ידי קומפלקסי חלבונים גדולים החלבון-RNA 1. צוואר בקבוק משמעותי לעריכת מחקרי biophysical והמבניים של קומפלקסים כאלה הוא מקבל אותם באיכות מתאימה (כלומר, הומוגניות) ותמורת ריכוז מתאים. בידוד קומפלקס ממקור ילידים יש יתרונות רבים, כולל שמירת שינויים שלאחר תעתיק ו / או translational רלוונטיים של יחידות משנה וביטוח הרכבה מורכבת ראויה. עם זאת, מתחמי הסלולר גדולים הם בדרך כלל נוכח בתא לעבר מספר נמוך עותק ואת הטיהור חייבת להיות יעילה להתרחש בתנאים פיסיולוגיים ליד מנת לשמור על שלמות מורכבת נשמרה. טיהור קומפלקס ממקור איקריוטיים מאתגרת במיוחד ולא יכול להיות כלכלי מונע. לכן, אסטרטגיות א....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: הפרוטוקול הבא תוכנן עבור טיהור של קומפלקס מ 4 ליטר של תרבית תאים, כ 40 גרם משקל רטוב של תאים. ברגע מוכן, הכל צריכים להיות מאוחסן המאגרים ב 4 ° C בשימוש בתוך חודש של ההכנה שלהם. מעכבי פרוטאז סוכן צמצום מתווספים רק כדי מאגרים רק לפני השימוש.

1. הכנת תמצית התא כולו עבור טיהור טנדם זיקה

  1. צמיחה של ס תאי cerevisiae
    1. Streak בתכנית הבדיקות הרצויות מתויגות ס זן ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטת TAP שונה שמשה לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, תסביך ribonucleoprotein 18-למקטע. טיהור TAP ראשונית של המתחם בעקבות 2,3 הפרוטוקול שפורסם ניב קומפלקס שהופיע הטרוגנית, נודדות כמו שלוש להקות על כסף מוכתמות ג'ל polyacrylamide ילידים (איור 2 א). סבבים רבים של אופטימיזציה של שיטת TAP, ניב מקומפלקס הגר בעיקר כלהקה יחידה על ג'ל יליד מעיד על הרכבה הומוגנית יותר (איור 2 א). באמצעות צבעי ניאון להכתים.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה TAP מנצל שני תגים לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. בנוסף, TAP הפרט מתויג ORFs זמין ממקור מסחרי, כך שאף אחד יכול להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. שמירה על שלמות קומפלקס ואת הזמינות של משאבים כדי לבדוק שימוש של יחידות משנת חלבון מתויגות שונות במתחם לטיהור שני יתרונות עבור ניצול שיטת TAP לטיהור קומפלקס יל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים אסירי תודה על תמיכתו ועצתו של ניקולאוס גריגוריף. אנו מודים לאנה לאבלנד, אקסל ברילוט, צ'ן שו ומייק ריגני על דיונים מועילים והדרכה EM. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, פרס מס' 1157892. מתקן ברנדייס EM נתמך על ידי מענק P01 GM62580 של המכונים הלאומיים לבריאות.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
S. cerevisiae TAP מתויג זןOpen BiosystemsYSC1177זהו זן השמרים העיקרי המשמש לפיתוח פרוטוקול TAP. הרקע שלו הוא S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2&Δ 0, met15&דלתא; 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
מטחנת קפהMrCoffee IDS77משמש להמוציטומטר ליזיס תאים
, Bright LineHausser Scientific3120משמש להערכת ליזיס תאים
JA 9.100 צנטריפוגה רוטור  בקמן קולטר בע"ממשמש לקצירת תאי השמרים
רוטור צנטריפוגה בזווית קבועה JA 20Beckman Coulter, Inc.משמש לניקוי תמצית התא מחומר סלולרי לא מסיס
Ti 60 רוטור צנטריפוגה בזווית קבועהBeckman Coulter, Inc.משמש לניקוי נוסף של תמצית התאים המסיסים
ThermomixerEppendorfR5355שייקר מבוקר טמפרטורה
מערכת ג'ל NovexThermo Fisher Scientific 
שרף IgGGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6
שרף קלמודוליןAgilent Technologies, Inc.214303
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמא אולדריץ'589297מיני cOmplete טבליות נטולות EDTA
קוקטייל מעכב פרוטאז, טבליות גדולותטבליות סיגמא אולדריץ'5892953cOmplete ללא EDTA
פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)מומס באיזופרופנול
2 מ"ל עמודת ביו-ספיןביו-ראד מעבדות בע"מ7326008משמש לאריזה ושטיפה של שרף קלמודולין
10 מ"ל עמודת פולי-הכנהBio-Rad Laboratories, Inc.7311550משמש לאריזה ושטיפה של שרף
IgG ג'ל מקורי PAGE Bis-TrisTechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% ג'לים פוליאקרילאמיד טרומיים
חלבון NativeMark ThermoFisher ScientificLC0725תקן חלבון לא מוכתם המשמש לתקן PAGE מקורי. עומס 7.5 μ l לג'ל מוכתם בכסף ו-5 μ l לג'ל מוכתם SYPRO Ruby
Precast SDS PAGE Bis-Tris gelsLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% ג'לים פוליאקרילאמיד טרומיים 
תקן חלבון PageRulerThermo Fisher Scientific26614תקן חלבון לא מוכתם המשמש למערב ספיגה
SDS מאגר ריצהLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS מאגר
נוגדן TAPThermo Fisher ScientificCAB1001נוגדן ראשוני נגד תג CBP
נוגדן משניThermo Fisher Scientific31341עיזים אנטי-ארנב אלקליין פוספטאז מצומד
BCIP/NBTתרמו פישר סיינטיפיק340425-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-פוספט/ניטרו כחול טטרזוליום 
יחידות דיאליזהThermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer מיני יחידות דיאליזה
יחידות סינון צנטריפוגליות, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם Ultracel-100 ממברנה
חרוזי ספיגת חומר ניקויBio-Rad Laboratories, Inc.1523920ביו-חרוז SM-2 סופגים
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564צבע פלואורסצנטי לצביעה של חומצות גרעין, בעת זיהוי עם SYPRO Ruby, השתמש באורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 532 ננומטר
SYPRO Rubyבדיקות מולקולריותS-12000צבע פלואורסצנטי לצביעת חלבון, בעת זיהוי עם SYBR Green II, השתמש באורך גל עירור של 457 ננומטר ואורך גל פליטה של 670 ננומטר
רשתות נחושתמיקרוסקופיה אלקטרוניתG400-CP
. זרימה מהירה שרף Affinity, טבליות מיני Life תקן מדעי

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tandem Affinity PurificationNative Complex PurificationStructural Homogeneity AssessmentYeast Cell LysisIgG Sepharose BindingTEV Protease CleavageCalmodulin Affinity BindingNegative Stain EMSDS PAGE AnalysisMass Spectrometry Identification

Related Articles