הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה

9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54389

⸱

27 ביולי 2016

 , 
1Department of Biochemistry, Brandeis University, 2Winship Cancer Institute, Emory University School of Medicine

במאמר זה

סיכום

שיטת טיהור הזיקה הטנדם (TAP) שימשה רבות לבידוד קומפלקסים מקומיים מתמצית תאית, בעיקר איקריוטית, עבור פרוטאומיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שיטת TAP המותאם לטיהור קומפלקסים מקומיים למחקרים מבניים.

תקציר

גישות טיהור זיקה הצליחו לבודד מתחמי יליד לאפיון proteomic. ההטרוגניות מבנית ומידה של ההטרוגניות הלחנה של קומפלקס בדרך כלל לא לעכב את ההתקדמות בביצוע מחקרים כאלה. לעומת זאת, קומפלקס המיועד אפיון מבניים צריך להיטהר בתוך מדינה שהיא גם בעלי הרכב הומוגני מבחינה מבנית כמו גם בריכוז גבוה מהנדרש עבור חקר החלבונים. לאחרונה, חלה התקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית לקביעת מבנה של קומפלקסי macromolecular גדולים. זה הגביר עניין גישות לטהר מתחמי יליד באיכות מספקת וכמות לקביעה מבנית על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים. טיהור זיקה טנדם (TAP) השיטה בצורה מיטבית כדי לחלץ ולטהר 18-למקטע, ~ 0.8 הרכבה ribonucleoprotein מד"א שמרים ניצני (שמר האפייה)

מבוא

תהליכים תאיים גדולים רבים מבוצעים על ידי קומפלקסי חלבונים גדולים החלבון-RNA 1. צוואר בקבוק משמעותי לעריכת מחקרי biophysical והמבניים של קומפלקסים כאלה הוא מקבל אותם באיכות מתאימה (כלומר, הומוגניות) ותמורת ריכוז מתאים. בידוד קומפלקס ממקור ילידים יש יתרונות רבים, כולל שמירת שינויים שלאחר תעתיק ו / או translational רלוונטיים של יחידות משנה וביטוח הרכבה מורכבת ראויה. עם זאת, מתחמי הסלולר גדולים הם בדרך כלל נוכח בתא לעבר מספר נמוך עותק ואת הטיהור חייבת להיות יעילה להתרחש בתנאים פיסיולוגיים ליד מנת לשמור על שלמות מורכבת נשמרה. טיהור קומפלקס ממקור איקריוטיים מאתגרת במיוחד ולא יכול להיות כלכלי מונע. לכן, אסטרטגיות או שיטות שאינן יעילים להניב מורכבים הומוגנית הן מאוד רצויות.

אסטרטגיה כי כברמוצלח לטיהור מתחמי יליד מתאי איקריוטיים לאפיון הראשוני שלהם הוא טיהור זיקת טנדם 2,3 השיטה (TAP). שיטת TAP בתחילה תוכננה כדי לטהר חלבון יליד מן שמרי ניצנים (cerevisiae ס) בקומפלקס עם אינטראקצית גורם (ים) 2. שיטת TAP מנוצלת שני תגים, כל תג התמזג במקביל לאותו רצף גן מקודדי חלבונים. התגים נבחרו כדי לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. תג TAP משולב genomically הוצב בסוף (C-terminal) של גן מקודדי חלבונים וכלל רצף קידוד calmodulin מחייב פפטיד (CBP) ואחריו חלבון - תוספת של קצת יותר מ -20 kDa אל מתויג חֶלְבּוֹן. CBP הוא קצר, 26 חומצות אמינו, ומוכר על ידי ~ 17 kDa חלבון calmodulin (CAM) בנוכחות של סידן עם K D בסדר גודל של 10 -9 M 4. תג החלבון גדול, מורכב משתי חזרות של 58 שאריות עם מקשר קצר בין החזרות. כל חוזרות חומצה 58 אמינו הוא מוכר על ידי אימונוגלובולין G (IgG) עם -8 M 5 10 K D ~. בין שני אלה תגים התאגד אתר הכרת פרוטאז TEV, גידול endopeptidase מנגיף הטבק Etch 6,7. כמו באיור 1, בשלב זיקה הראשון של שיטת TAP מתויג חלבון מאוגד שרף IgG דרך א חלבון החלבון מתויג הוא eluted ידי על מחשוף טור על תוספת של פרוטאז TEV, אתר ספציפי ביקוע בין את שני התגים. זהו צעד הכרחי כאינטראקציה של IgG ו- A החלבון הוא חזק מאוד והוא יכול להיות רק מוטרד כראוי בתנאי פתרון denaturing. בהעדר Protein תג, החלבון הוא כבול שרף CAM בנוכחות סידן eluted משרף זה עם תוספת של EGTA chelator מתכת יון (חומצה tetraacetic אתילן גליקול) (איור 1).

זמן קצר לאחר כניסתה של שיטת TAP, היא שימשה במחקר בקנה מידה גדול כדי ליצור "מפה" של יחסי הגומלין המורכבים ב ס cerevisiae 8. חשוב לציין, כתוצאה ממאמץ זה המסגרת כולו שמר-TAP Tagged להרחיב קריאה (ORF) ספרייה וכן TAP פרט מתויג ORFs 9 זמינים ממקור מסחרי. לכן, אפשר להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. השיטה TAP גם דירבן שינויים או וריאציות של תג TAP, כולל: השימוש בו לטיהור מתחמי מ איקריוטיים אחרים, כמו גם תאים חיידקיים 10,11; העיצוב של "תג לפצל", שבה החלבון ו CBP מונחים על חלבונים שונים 12; ואת taGS השתנה, כדי להתאים את הצורך של החוקר, כגון רגישות של המתחם כדי Ca 2 + או EGTA 13.

ההתקדמות שחלה באחרונה בשני המכשור ומתודולוגיה הובילו להתקדמות משמעותית ביישום של מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM) לקביעת מבנה, שהובילו גבוהה, ליד תמונות ברזולוציה אטומית של מתחמי macromolecular 14. החלטת ההשגה של קומפלקס א"מ, לעומת זאת, נותרת מותנית באיכות של המתחם נחקר. מחקר זה נצל את גישת תג TAP לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, א-למקטע 18 (~ 0.8 מד"א) מורכב ribonucleoprotein נמוך עותק מספר כי הוא חלק 15,16 הספלייסוזום. מספר הצעדים ננקט כדי לטהר מורכב זה כזה שזה הומוגנית של ריכוז נאות. בעיות פוטנציאליות נתקלו בשלבים שונים של הטיהור מתוארות ואסטרטגיות נלקחו להתגבר challenges הדגיש. לפי הערכה ואופטימיזציה צעדים בזהירות הטיהור, U1 snRNP מטוהר הוא באיכות ובבית בכמות שנכנסה כתם שלילי אלקטרוני cryo מיקרוסקופיה (cryo-EM) מחקרים. פרוטוקול שיטת TAP אופטימיזציה עבור טיהור של מתחמי מקורית עבור מחקרים מבניים מתואר במסמך זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפרוטוקול הבא תוכנן עבור טיהור של קומפלקס מ 4 ליטר של תרבית תאים, כ 40 גרם משקל רטוב של תאים. ברגע מוכן, הכל צריכים להיות מאוחסן המאגרים ב 4 ° C בשימוש בתוך חודש של ההכנה שלהם. מעכבי פרוטאז סוכן צמצום מתווספים רק כדי מאגרים רק לפני השימוש.

1. הכנת תמצית התא כולו עבור טיהור טנדם זיקה

  1. צמיחה של ס תאי cerevisiae
    1. Streak בתכנית הבדיקות הרצויות מתויגות ס זן cerevisiae מאחסון (-80 ° C) על דקסטרוז שמרים peptone צלחת (YPD). דגירה של 3 - 5 ימים (30 ° C), עד תאי שמרים להופיע לבן ורך.
    2. לחסן פס של כ -2 מ"מ 2 של תאים טריים מהצלחת לתוך 10 מ"ל התקשורת YPD בתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל. לנער את הצינור ב 180 סיבובים לדקה (סל"ד) לילה (30 מעלות צלזיוס).
    3. לחסן 2 מ"ל של מעלתרבות הלילה לליטר מדיה YPD בתוך Erlenmeyer 2 L או בקבוק חרוטים. Shake ב 180 סל"ד (30 מעלות צלזיוס). צג צמיחת תאים על צפיפות אופטית של 600 ננומטר (OD 600) עד שלב יומן מאוחר, OD 600 של 1.8 ל 2, בדרך כלל 20 - 24 שעות.
  2. קציר ס תאי cerevisiae
    1. קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב 5400 XG במשך 15 דקות (4 ° C).
    2. במהירות למזוג supernatant ולשמור תאים ב 4 מעלות צלזיוס או על קרח.
    3. להשעות כל ליטר תא גלולה עם 2 מ"ל מקורר הצפת תמוגה (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 300 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 0.2 mM EDTA, pH 8.0; 5 מ"מ imidazole, pH 8.0; 10% גליצרול; 0.1% v / v NP-40). להשעות תאים על ידי מתערבל ו / או pipetting חוזרים באמצעות pipet סרולוגיות 10 מ"ל.
      הערה: חשיבותה של NP-40 כפי שהוא נוגע לאיכות וניתוחים מורכבים הטיהור פוסט נדון בהמשך.
    4. מעבירים את ההשעיה תא לתוך k צינור צנטריפוגות ריק 50 מ"ל חרוטי פוליפרופילןEPT על הקרח. לשטוף כל בקבוק צנטריפוגות עם 2 מ"ל נוספים של הצפת תמוגה מקורר ולהוסיף את ההשעיה תא בצינור 50 מ"ל.
    5. קבע את המשקל הרטוב של גלולת תא על ידי שקילת צינור הפחתת המשקל של השפופרת הריקה, כמו גם את מאגר תמוגה הוסיף.
      הערה: ליטר של תרבית תאים שיש OD של 600 1.8 הוא כ 10 גרם.
    6. צור באמבט חנקן נוזלי בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל. צייר תאים מושעה לתוך מזרק 5 מ"ל. חבר מחט 16 G המזרק. להקפיא את ההשעיה התא על ידי זה עובר דרך מזרק / מחט כדי ליצור תא "טיפות". שערי הקפאה צריכות להיות כ 1 דק '/ מיליליטר.
    7. אחסן טיפות תא קפוא (-80 ° C) או להמשיך תמוגה.
  3. תאי Lysate הבהרה lysing
    1. Lyse התאים שמרים באמצעות מטחנת קפה. Lyse תאי שמונה עד תשע פעמים עם 25 שניות שחיקה התפרצויות, תוך טלטול גמטחנת offee. לפני השימוש, מראש לצנן את מטחנת קפה עם חנקן נוזלי. כל שני סיבובים של שחיקה, להוסיף בשכבה רדודה של חנקן נוזלי אל המטחנה ולאפשר לו להתאדות.
    2. מערבבים עם מרית מקורר חנקן נוזלי לפי הצורך כדי לשמור על התאים מפני clumping. קח זהירות כדי למנוע הפשרת התאים, מה שיכול לגרום clumping התא. התאים צריכים להופיע כמו אבקה לבנה עדינה הבא תמוגה. גלולת תא מקסימלי מ 4 ליטר של תרבית שמרים (~ 40 גרם) יכולה להיות קרקע בכל פעם.
      הערה: תוכן לגבי שיטת תמוגה נדון להלן.
    3. להעריך את מידת תמוגה תא באמצעות hemocytometer או שיטת ספירת תאים חלופית. כדי לספק ניתוח נאות, לקחת הדגימות הבאות: (1) לפני תמוגה; (2) לאחר ארבעה סיבובים של תמוגה; ו (3) לאחר תמוגה. כדי לבדוק דגימות אלה, לקחת כמות קטנה של תאים עם מרית ומקום מקורר חנקן נוזלי בתוך שפופרת 1.5 מ"ל.
    4. לאחר התאים הם הפשירו, פיפטה 5 μl של תאיםומערבבים עם 495 מים μl. אם 40 - 60% תמוגה של תאים הוא ציין, המשך לשלב הבא בפרוטוקול.
      הערה: תוכן לגבי השפעת תקופות ארוכות של תמוגה נדונים להלן.
    5. לאחר תמוגה נאותה הוא ציין, תאי lysed חנות (-80 ° C) או להמשיך לשלב הבא.
    6. הכן שני צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן חרוטי 50 מ"ל כל אחד עם 15 מ"ל הצפת תמוגה, כולל פלואוריד phenylmethanesulfonyl 1 מ"מ (PMSF), 1 מ"מ dithiothreitol (DTT), וקוקטייל זמינים מסחרית של מעכבי פרוטאז.
      הערה: אם proteolysis משמעותי הוא ציין, לשקול שימוש זן פרוטאז לקוי.
    7. השתמש מרית מקורר חנקן נוזלי כדי לגרוף את האבקה התא lysed קפוא לתוך צינורות 50 מ"ל מוכן. מוסיפים את אבקת תא / מוצק באופן הדרגתי למאגר תמוגה, המכילה גם reductant ו מעכבי פרוטאז (ים).
    8. סובב את הצינורות 50 מ"ל בעדינות ב RT כדי להפשיר / לפזר את התאים, אלא גם כדי למנוע בועות מ טביעה. אזה אבקת תא / להמסת מוצק, להוסיף תא נוסף / אבקת מוצק.
    9. ממלאים כל אחד משני צינורות 50 מ"ל עד לכל אחד מהם יש כ 20 גרם של תאים או כל התאים הוסיף. המשך הפשרה / המסה עד שאין גושי תא קפוא שנצפו 50 מ"ל הצינורות. זה אמור לקחת בערך 50 דקות.
    10. צנטריפוגה lysate התא על תנאי למשך 20 דקות ב 25,000 XG (4 ° C). ובכן-lysed תאים עשויים להפגין כמות קטנה של משקע שחור.
    11. מעבירים את 50 מ"ל של supernatant כדי פוליקרבונט צינורות אולטרה צנטריפוגה (26.3 מ"ל צינורות בשימוש) ולהוסיף 10 μl 200 מ"מ PMSF על צינור אחד מלא.
    12. צנטריפוגה במשך שעה 1 ב 100,000 XG (4 ° C). ארבע שכבות צריכות להיות גלויות, מלמטה למעלה: (1) גלולה ברורה קשה, המכיל מתחמי ריבוזומלי; (2) גלולת שומנים עשירים רכה; (3) שכבה צהובה-מהולה גדולה המכילה ביותר של חלבוני מתחמי המסיסים של התא; ו (4) בשכבה עליונה "קשקשים" מורכבת של שומנים.
    13. בצע את כל היםצעדים ubsequent בחדר קר (4 ° C). להסיר כמה שיותר שכבת השומנים 'קשקשים' הדף ככל האפשר באמצעות pipet 1 מ"ל וזורקים. השתמש pipet 10 מיליליטר סרולוגיות להתאושש רוב ההשכבה הצהובה, ברורה.
    14. שחזור הבודדים מ"ל האחרון של שכבה זו בעזרת פיפטה 1 מ"ל, כדי למנוע להפריע שתי שכבות התחתונה. מ 40 גרם גלולה תא רטוב, כ 48 מ"ל של השכבה האמצעית הוא התאושש בדרך כלל ו -8 מ"ל של השומנים שכבת הסיר / מושלך.
      הערה: זרימת טיהור טור מתעכבת מאוד על ידי הנוכחות של שומנים, היכולים גם לפגוע באיכות של המתחם, נדון בהמשך.

2. טיהור טור צעד 1: כרומטוגרפיה IgG

  1. שרף איזון וכריכה
    1. הכינו תרחיף 300 μl IgG Sepharose עבור 40 גרם של התא גלולה. חותכים את הקצה של קצה pipet 1 מ"ל כדי להקל pipetting את התערובת הדלילה. לשטוף / לאזן שרף IgG שלוש פעמים, בכל פעם עם 5 מ"ל IgGD150 Buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl; 150 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl 2; 5 מ"מ imidazole, pH 8; 0.1% v / v NP-40; 1 מ"מ DTT; לוח מעכב פרוטאז לכל 50 נפח מ"ל).
      1. ספין כדי גלולה ב 160 XG (4 ° C) בין הכביסות ולהסיר supernatant.
    2. סובב את שרף IgG עם supernatant שלב באמצע והשני לוחות מיני פרוטאז מעכב לכל 40 גרם של תאים, באמצעות מסובבים מתאימים עבור 2 שעות (C ° 4). זהו הפתרון יצווה IgG.
    3. כן שני 10 מ"ל עמודות פולי-הכנה לשימוש על ידי חיתוך בסוף הטור לייצר חתך שטוח. כדי לזרז את האריזה ושטיפה של העמודה על ידי זרימת כוח הכבידה, לטעון לכל היותר 200 μl של שרף IgG ארוז או ~ 25 מ"ל של פתרון אצווה IgG לכל 10 מ"ל העמודה.
    4. יוצקים את הפתרון אצווה IgG לתוך הטור ולאפשר משקעים על ידי כוח הכבידה. אם השקיעה לוקחת יותר מ -30 דקות, שם ככל הנראה היה זיהום שומנים כאשר לשחזר את השלב האמצעי מן t צנטריפוגותubes.
    5. לשטוף את העמודה הארוזה עם ארבעה כרכים רצופים 10 מיליליטר של IgGD150 הצפה.
  2. על מחשוף TEV טור
    1. חותם את החלק התחתון של העמודה ולהוסיף 1 מ"ל של IgGD150 הצפת 100 μl של פרוטאז TEV (0.6 מ"ג / מ"ל ​​המניות, S219V גרסה מוטציה של TEV מיוצר ללא צורך במיקור חוץ). חותם את החלק העליון של העמודה ומערבבים במשך 20 דקות (18 ° C) בעזרת מערבל תרמית, רועד ב 750 סל"ד. שרף גלול ומערבב שוב במשך 20 דקות, לחזור פעם נוספת על סך של דגירת hr 1.
      הערה: זה קריטי כדי לשמור על זמן דגירה עד למינימום.
    2. החזר את העמודה עד 4 ° C ו elute החלבון / מורכבות על ידי כוח הכבידה. Elute את הנפח המת עם 200 μl נוסף של IgGD150 הצפה.

3. טור טיהור שלב 2: כרומטוגרפיה calmodulin זיקה

  1. שרף איזון וכריכה
    1. כן 200 μl של שרף זיקת calmodulin לכל 40 גרם של תאגְלוּלָה. שטפו את שרף שלוש פעמים, בכל פעם עם 5 מ"ל calmodulin חיץ מחייב (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl 2; imidazole 5 מ"מ, pH 8; 2 2 מ"מ CaCl; 0.1 NP-40 v / v%; 10 מ"מ β-mercaptoethanol), centrifuging ב 160 XG (4 מעלות צלזיוס) עד גלולה עבור כל שטיפה.
    2. לכל eluate 1 מ"ל IgG, להוסיף 3 כרכים של calmodulin חיץ מחייב. כדי לשמור על רמת סידן קבוע, להוסיף CaCl 2 ו β-mercaptoethanol כדי להסביר את חוסר המרכיבים הללו elution IgG. ריכוזים הסופי צריך להיות 2 מ"מ CaCl 2 ו -10 מ"מ β-mercaptoethanol.
    3. מוסיפים את מדגם שרף calmodulin לאגד עבור שעה 1 (4 ° C) באמצעות Rotator צינור.
  2. אריזת משחררי משרף calmodulin
    1. הכן טור פולי-prep 2 מ"ל לכל 100 סלארי calmodulin μl ידי חיתוך בסוף הטור כדי ליצור פתח שטוח. אין לטעון יותר מ -100 μl סלארי calmodulin לכל שיתוףlumn כדי למזער את הכמות של שרף המדגם בא במגע עם במהלך elution.
    2. ארוז את הטור על ידי כוח הכבידה ולשטוף את שרף בטור שלוש פעמים עם 5 מ"ל מאגר כריכה calmodulin.
    3. Elute חלבון עם תוספת של 200 μl calmodulin הצפת elution (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl 2; 5 imidazole מ"מ, pH 8.0; 4 מ"מ EGTA, pH 8.0; 0.08% v / v NP-40; 10 מ"מ β-mercaptoethanol). חזרו על התרגיל שש פעמים תוספת של 200 μl של calmodulin הצפת elution.
    4. לקבלת elutions 1 עד 3, להחיל את הנפח לעמודה ולאסוף את eluate מייד. עבור elution 4, לאטום את החלק התחתון של העמודה דגירה עם חיץ elution ב -2.5 דקות ולאחר מכן unseal ולאפשר elute על ידי כוח הכבידה. עבור elution 5, דגירה במשך 5 דקות ולאחר מכן unseal ו elute. עבור elution 6, דגירה במשך 10 דקות ולאחר מכן unseal ו elute.
      הערה: השלמות של המתחם עשויה להשתנות בין elutions / שברים (ראו סעיף תוצאות נציג) <./ Li>
    5. Dialyze elutions 2 עד 6 בנפרד הלילה באמצעות שיטת דיאליזת מייקרו מתאימה. Dialyze שברים נגד הצפת דיאליזה (10 mM Tris-HCl, pH 8.0; 150 מ"מ NaCl, 10 מ"מ KCl; 1 מ"מ MgCl 2; 5 מ"מ imidazole, pH 8; 10 מ"מ β-mercaptoethanol).
      הערה: NP-40 אינם עוברים באופן ניכר, אם בכלל, דרך הממברנה הדיאליזה.

4. ניתוח פוסט-טיהור כדי להעריך את איכות Complex

  1. ג'ל Native וכסף מכתים
    1. כן 4 - ג'ל יליד טרומי 16% לניתוח של המתחם על פי ההנחיות מהיצרן. השתמש תקן חלבון משקל מולקולרי המתאים והעומס 15 μl של כל אחד elution calmodulin dialyzed / שברים על הג'ל.
    2. Electrophorese את הג'ל על 150 V כ 3 שעות (4 ° C).
    3. כסף הכתם ג'ל על מנת להעריך את האיכות של כל אחד מששת elutions. לחלופין, להשתמש מסחרי רגיש באותה מידהכתם ניאון (ים). בשלב זה, את הריכוז של המתחם הוא ככל הנראה מתחת לרמה של זיהוי מכתים Coomassie כחול.
  2. שיטות ניתוח ג'ל נוספות
    1. כדי לזהות חלבון ידי המערבי סופג, לפתור את מורכבות על ידי SDS או עמוד יליד ולאחר מכן לחקור את הג'ל על calmodulin מחייב פפטיד (CBP) epitope באמצעות נוגדן תג TAP על פי הנחיות מהיצרן.
    2. באמצעות כתם ניאון ספציפי (s), לאשר את הקיום ואת היושרה של חלבון ו / או חומצות גרעין במתחם מטוהר TAP. תשמור על עצמך כי אין חפיפה ספקטרלית מזוהית בין כתמים אלה.
  3. ויזואליזציה הכתם מיקרוסקופית אלקטרונים שלילי
    1. השתמש רשתות פחמן רציף הזוהר המשוחרר ב -15 mA למשך 30 שניות, תוך 30 דקות של יישום מורכב.
    2. החל 3 μl של מורכבות מטוהרים TAP (בדרך כלל בריכוז של 1 ננומטר) לרשת. דגירה במשך דקה. כתם fROM בצד של הרשת על מנת להסיר עודפי חיץ.
    3. שטפו פעמיים עם 20 טיפות μl של מים ללא יונים. כתם Side בין שוטף.
    4. החל רשת לירידה כתם שלילית 50 μl דגירה במשך דקות. מכתים עם אצטט uranyl (2%) או formate uranyl (0.75%) מומלץ.
      זהירות: מלחים ופתרונות Uranyl הם בחולשה רדיואקטיביים ומכיל מתכות כבדות. אלה צריכים להיות מטופלים עם טיפול וכל החומר שבא במגע עם פתרונות אלה צריכים להיות מסולקים עמידים בהנחיות פסולות מומלצות מוסדיות.
    5. החל רשת לירידה כתם שלילי טרי 50 μl, בלי סופג. דגירה במשך דקות, ולאחר מכן כתם בצד, ולבסוף אוויר יבשים לדמיין.
  4. ויזואליזציה Cryo מיקרוסקופית אלקטרונים (cryo-EM)
    1. בצע-EM קריו עם מורכבות מטוהרים TAP, למרות אופטימיזציה ייתכן שיהיה צורך, על פי פרוטוקול של היצרן.
      הערה: נוכחות של חומרי ניקוי ב ma ריכוזים גבוהיםy לעכב את ההתקדמות והוא נדון להלן.

5. אחסון Complex

  1. הכנת Complex עבור אחסון
    1. לרכז את המורכבות, במידת הצורך, באמצעות מסנן צנטריפוגלי בעל חתך משקל מולקולרי מתאים המורכב. ספין על 14,000 XG עבור במרווחים של 1 דק 'עד לריכוז הרצוי הוא הגיע.
      הערה: ריכוז NP-40 יגדיל בריכוז במהלך להתרכז, כפי שהוא אינו עובר דרך הממברנה המסנן ולא דיאליזה.
    2. פלאש להקפיא את מורכבות 30 aliquots μl בחנקן נוזלי או קרח יבש מקורר אמבטיה אתנול ולאחר מכן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
  2. הסרה פוסט-טיהור אופציונלית של דטרגנט

הערה: הנוכחות של סבון כגון NP-40 ו בריכוז מעל זה של ריכוז micelle הביקורתי שלה עלול לעכב או למנוע התקדמות עבור יישומים מסוימים. ההשלכות של ההסרה שלה מן פרוטוcol וכן החלפה עם תוספים אחרים או-ממס שיתוף נדון להלן. אם לא NP-40 הוא רצויים, אופציה היא להשתמש ביישום מסחרי להסרה, למשל ביו-חרוזים.

  1. חרוזים לאזן קדם קליטת חומרי ניקוי זמינים מסחרית ב הצפת דיאליזה. מערבבים חמישה חרוזים לכל 30 μl של מורכבות (בדרך כלל 10 ריכוז ננומטר).
  2. דגירה חרוזים equilibrated משלב 5.2.1 עם מורכבות TAP מטוהרים במשך 15 דקות על הקרח. השתמש מורכב תוך מספר שעות לאחר הסרת חומר ניקוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

שיטת TAP שונה שמשה לטהר מ ס cerevisiae מספר U1 snRNP, תסביך ribonucleoprotein 18-למקטע. טיהור TAP ראשונית של המתחם בעקבות 2,3 הפרוטוקול שפורסם ניב קומפלקס שהופיע הטרוגנית, נודדות כמו שלוש להקות על כסף מוכתמות ג'ל polyacrylamide ילידים (איור 2 א). סבבים רבים של אופטימיזציה של שיטת TAP, ניב מקומפלקס הגר בעיקר כלהקה יחידה על ג'ל יליד מעיד על הרכבה הומוגנית יותר (איור 2 א). באמצעות צבעי ניאו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

השיטה TAP מנצל שני תגים לאזן צורך חזק וסלקטיבי מחייב שרף זיקה עם רצון לשמור כולה במזג אוויר פתרון פיזיולוגי. איזון זה משמש כדי לשמר אינטראקציה יציבה (ים) של החלבון מתויג עם אינטראקצית גורם (ים) לאפיון שלאחר טיהור. בנוסף, TAP הפרט מתויג ORFs זמין ממקור מסחרי, כך שאף אחד יכול להשיג כל זן שמרים עם חלבון מתויג לכל מורכבות שמרים. שמירה על שלמות קומפלקס ואת הזמינות של משאבים כדי לבדוק שימוש של יחידות משנת חלבון מתויגות שונות במתחם לטיהור שני יתרונות עבור ניצול שיטת TAP לטיהור קומפלקס יל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחברים אסירי תודה על תמיכתו ועצתו של ניקולאוס גריגוריף. אנו מודים לאנה לאבלנד, אקסל ברילוט, צ'ן שו ומייק ריגני על דיונים מועילים והדרכה EM. עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע, פרס מס' 1157892. מתקן ברנדייס EM נתמך על ידי מענק P01 GM62580 של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
S. cerevisiae TAP מתויג זןOpen BiosystemsYSC1177זהו זן השמרים העיקרי המשמש לפיתוח פרוטוקול TAP. הרקע שלו הוא S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ 1, leu2&Δ 0, met15&דלתא; 0, ura3Δ 0, SNU71::TAP::HIS3MX6
מטחנת קפהMrCoffee IDS77משמש להמוציטומטר ליזיס תאים
, Bright LineHausser Scientific3120משמש להערכת ליזיס תאים
JA 9.100 צנטריפוגה רוטור  בקמן קולטר בע"ממשמש לקצירת תאי השמרים
רוטור צנטריפוגה בזווית קבועה JA 20Beckman Coulter, Inc.משמש לניקוי תמצית התא מחומר סלולרי לא מסיס
Ti 60 רוטור צנטריפוגה בזווית קבועהBeckman Coulter, Inc.משמש לניקוי נוסף של תמצית התאים המסיסים
ThermomixerEppendorfR5355שייקר מבוקר טמפרטורה
מערכת ג'ל NovexThermo Fisher Scientific 
שרף IgGGE Healthcare17-0969-01Sepharose 6
שרף קלמודוליןAgilent Technologies, Inc.214303
קוקטייל מעכב פרוטאזסיגמא אולדריץ'589297מיני cOmplete טבליות נטולות EDTA
קוקטייל מעכב פרוטאז, טבליות גדולותטבליות סיגמא אולדריץ'5892953cOmplete ללא EDTA
פנילמתאן סולפוניל פלואוריד (PMSF)מומס באיזופרופנול
2 מ"ל עמודת ביו-ספיןביו-ראד מעבדות בע"מ7326008משמש לאריזה ושטיפה של שרף קלמודולין
10 מ"ל עמודת פולי-הכנהBio-Rad Laboratories, Inc.7311550משמש לאריזה ושטיפה של שרף
IgG ג'ל מקורי PAGE Bis-TrisTechnologiesBN1002Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% ג'לים פוליאקרילאמיד טרומיים
חלבון NativeMark ThermoFisher ScientificLC0725תקן חלבון לא מוכתם המשמש לתקן PAGE מקורי. עומס 7.5 μ l לג'ל מוכתם בכסף ו-5 μ l לג'ל מוכתם SYPRO Ruby
Precast SDS PAGE Bis-Tris gelsLife TechnologiesNP0321Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% ג'לים פוליאקרילאמיד טרומיים 
תקן חלבון PageRulerThermo Fisher Scientific26614תקן חלבון לא מוכתם המשמש למערב ספיגה
SDS מאגר ריצהLife TechnologiesNP00011x NuPAGE MOPS SDS מאגר
נוגדן TAPThermo Fisher ScientificCAB1001נוגדן ראשוני נגד תג CBP
נוגדן משניThermo Fisher Scientific31341עיזים אנטי-ארנב אלקליין פוספטאז מצומד
BCIP/NBTתרמו פישר סיינטיפיק340425-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-פוספט/ניטרו כחול טטרזוליום 
יחידות דיאליזהThermo Fisher Scientific88401Slide-A-Lyzer מיני יחידות דיאליזה
יחידות סינון צנטריפוגליות, 100kDa MWCOEMD MilliporeUFC5100008Amicon Ultra-0.5 יחידת מסנן צנטריפוגלי עם Ultracel-100 ממברנה
חרוזי ספיגת חומר ניקויBio-Rad Laboratories, Inc.1523920ביו-חרוז SM-2 סופגים
SYBR Green IIThermo Fisher ScientificS-7564צבע פלואורסצנטי לצביעה של חומצות גרעין, בעת זיהוי עם SYPRO Ruby, השתמש באורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 532 ננומטר
SYPRO Rubyבדיקות מולקולריותS-12000צבע פלואורסצנטי לצביעת חלבון, בעת זיהוי עם SYBR Green II, השתמש באורך גל עירור של 457 ננומטר ואורך גל פליטה של 670 ננומטר
רשתות נחושתמיקרוסקופיה אלקטרוניתG400-CP
. זרימה מהירה שרף Affinity, טבליות מיני Life תקן מדעי

מקורות

  1. Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
  2. Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
  3. Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
  4. Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
  5. Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
  6. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  7. Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
  8. Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
  9. Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
  10. Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
  11. Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
  12. Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
  13. Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
  14. Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
  15. Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
  16. Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
  17. Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NativeIgG SepharoseTEVSDS PAGE
טיהור של מכלולי Native לחקר מבני בשיטת תג טנדם זיקה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.