מאמר שיטה

בידוד של קומפלקסים RNA חלבון מאותו מקור מתאי שימוש Elution oligonucleotide מכוונת

DOI:

10.3791/54391

⸱

16 בינואר 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Veterinary & Biomedical Sciences, University of Minnesota, 2Department of Veterinary Biosciences, Ohio State University, 3School of Biotechnology, Gautam Buddha University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כתב יד זה מתאר גישה לבידוד RNPs קוגנטיים נבחרים הנוצרים בתאים אוקריוטיים באמצעות העשרה מכוונת אוליגונוקלאוטידים ספציפית. אנו מדגימים את הישימות של גישה זו על ידי בידוד RNP מקביל הקשור לאזור הרטרו-ויראלי 5' הלא מתורגם המורכב מ-DHX9/RNA הליקאז A.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקיקי ריבונוקלאופרוטאין מכוונים את הביוגנזה והוויסות שלאחר השעתוק של כל ה-mRNA באמצעות שילובים נפרדים של חלבונים קושרי RNA. הם מורכבים מרכיבי RNA תלויי מיקום, הפועלים על ציס ושילובים ייחודיים של חלבונים קושרי RNA. הגדרת ההרכב של RNP ספציפי חיונית להשגת הבנה בסיסית של ויסות גנים. הבידוד של RNP נבחר דומה למציאת מחט בערימת שחת. כאן, אנו מדגימים גישה לבידוד RNPs הקשורים באזור 5' הלא מתורגם של mRNA נבחר בתאים אסינכרוניים וטרנספטנטיים. RNP קוגנטי זה הוכח כהכרחי לתרגום של נגיפים נבחרים וגנים של תגובת עקה תאית.

פרוטוקול המשקעים המשותף המוכח של RNA-חלבון מתאים לניתוח במורד הזרם של רכיבי חלבון באמצעות אנליזות פרוטאומיות, אימונובלוטים או מבחני זיהוי ביוכימיים מתאימים. פרוטוקול ניסיוני זה מדגים כי הליקאז A של DHX9/RNA מועשר בקצה 5' של RNA רטרו-ויראלי קוגנטי ומספק מידע ראשוני לזיהוי הקשר שלו עם huR הקשור למתח תאי ו-mRNA קוגנטי junD.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלאחר תעתיק ביטוי גנים מוסדר בדיוק, החל שעתוק ה- DNA בגרעין. בשליטת RNA מחייב חלבונים (RBPs), biogenesis mRNA וחילוף החומרים להתרחש חלקיקים ribonucleoprotein מאוד דינמי (RNPs), אשר כלולות לנתק עם mRNA מבשר המצע במהלך ההתקדמות של RNA מטבוליזם 1-3. שינויים דינמיים רכיבי RNP להשפיע על הגורל שלאחר התעתיק של mRNA ולספק אבטחת איכות במהלך העיבוד של תמלילים עיקריים, הסחר ולוקליזציה הגרעין שלהם, פעילותם כתבניות mRNA לתרגום, ואת המחזור הסופי של mRNAs הבוגרת.

חלבונים רבים מיועדים RBPs מכוח תחומי חומצת אמינו המשומר שלהם, כוללים מוטיב הכרת רנ"א (RRM), תחום מחייב פעמים התקועות RNA (RBD), והוא משתרע של שאריות בסיסיות (למשל, ארגינין, ליזין, גליצין) 4. RBPs הם שגרתימבודד על ידי אסטרטגיות immunoprecipitation ו מוקרנים לזהות RNAs מאותו המקור שלהם. חלק RBPs שיתוף להסדיר-mRNAs מראש כי הם-קשורות מבחינה פונקציונלית, יועד regulons RNA 5-8. RBPs אלה, mRNAs מאותו המקור שלהם, ולפעמים RNA ללא קידוד, יוצרים RNPs קטליטי שמשתנה רכב; ייחודם נובע שילובים שונים של גורמים הקשורים, כמו גם לרצף הזמני, מיקום, ומשך האינטראקציות ביניהם 9.

Immunoprecipitation RNA (RIP) היא טכניקה רבת עוצמה כדי לבודד RNPs מתאי ולזהות תמלילי הקשורים באמצעות רצף ניתוח 10-13. מעבר מ מועמד הגנום כולו הקרנה אינה ריאלית באמצעות RIP בשילוב עם ניתוח microarray 14 או רצף תפוקה גבוהה (RNA-seq) 15. כמו כן, חלבונים-מזרז שיתוף יכולים להיות מזוהים על ידי ספקטרומטריית מסה, אם הם נמצאים בשפע מספיק להפרדת הנוגדן מזרז-שיתוף 16,17. כאן, אנחנו כתובת המתודולוגיה לבידוד רכיבי RNP של רנ"א מאותו מקור ספציפי מתא אדם תרבותי, אם כי הגישה היא עָשׂוּי לְהִשׁתָנוֹת עבור lysates המסיס של תאי צמח, פטריות, וירוסים, חיידקים. ניתוחים Downstream של החומר כוללים זיהוי המועמד ואימות על ידי immunoblot, ספקטרומטריית מסה, assay האנזימטית ביוכימיים, RT-qPCR, microarray, ו RNA-seq, כפי שמסוכם איור 1.

בהתחשב התפקיד הבסיסי של RNPs בשליטת ביטוי גנים ברמה שלאחר התעתיק, שינויים בביטוי של RBPs רכיב או נגישותן מאותו מקור RNAs יכול להיות מזיק עבור התא ומזוהה עם כמה סוגים של הפרעות, כולל מחלות נוירולוגיות 18. DHX9 / RNA helicase A (RHA) הוא הכרחי עבור התרגום של mRNAs שנבחרו ממוצא הסלולר retroviral 6. RNAs מאותו מקור אלה להפגין אלמנטים ציס-מתנהג מבנית הקשורה בתוך שלהם5 'UTR, אשר יועד אלמנט השליטה שלאחר תעתיק (PCE) 19. RHA-PCE שפעילות מתבקשת על תרגום הכובע תלוי היעיל של רטרווירוסים רבים, כולל HIV-1, ושל גני רגולטוריים צמיחה, כוללים ג'ונד 6,20,21. קודד על ידי גן חיוני (dhx9), RHA חיוני התפשטות תא ומטה בתקנה שלה מבטל כדאיויות תא 22. הניתוח המולקולרי של RHA-PCE RNPs הוא צעד חיוני כדי להבין מדוע פעילות RHA-PCE יש צורך לשלוט התפשטות תאים.

האפיון המדויק של רכיבי RNP RHA-PCE על מצב יציב או על הפרעות פיסיולוגיות של התא דורש להעשרת סלקטיבית לכידתו של RNPs RHA-PCE בשפע מספיק לניתוח במורד זרם. הנה, retroviral PCEgag RNA תויגה עם 6 עותקים של אתר הקישור RNA ציס-מתנהג לחלבון מעיל MS2 (CP) בתוך מסגרת קריאה פתוחה. החלבון מעיל MS2 היה Exoהשיתוף הביע genously עם RNA PCEgag ידי transfection פלסמיד כדי להקל על הרכבת RNP בתאים גדלו. RNPs המכיל חלבון מעיל MS2 עם RNA PCEgag מאותו מקור MS2-tagged היו immunoprecipitated מהתמצית התא שנתפסו על חרוזים מגנטיים (איור 2 א). כדי סלקטיבי ללכוד את רכיבי RNP המאוגדים PCE, את משותקת RNP הודגר עם oligonucleotide משלים רצפי דיסטלי PCE, ויוצרים היברידי RNA-DNA כי הוא המצע לפעילות RNase H. מאז PCE ממוקמת ב 'מסוף של 5' 5 באזור הלא מתורגם, את oligonucleotide היה משלים רצפי הרנ"א סמוך לאתר תחילת התרגום retroviral (קודון ההתחלה איסור פרסום). RNase H מחשוף בסמוך לנקודת התחלת איסור פרסום קודון שוחרר במתחם UTR '5 מן RNP המשותקת, אשר נאספה כמו eluent. לאחר מכן, המדגם הוערך על ידי RT-PCR כדי לאשר את לכידתו של PCEgag ועל ידי PAGE ו immunoblot SDS כדי לאשר את captuמחדש של חלבון מעיל MS2 היעד. אימות של חלבון מחייב PCE הקשורים RNA, DHX9 / RNA helicase A, בוצע אז.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
קומפוזיציות הצפה
לשטוף הצפה:
50 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 מ"מ NaCl
3 מ"מ MgCl2
נמוך מלח הצפה:
20 mM Tris-HCl, 7.5 pH
10 מ"מ NaCl
3 מ"מ MgCl2
2 מ"מ DTT
EDTA ללא קוקטייל מעכבי פרוטאז 1x
RNase מתוך 5 μl / מ"ל ​​(מעכב RNase)
Cytoplasmic הצפת תמוגה:
0.2 M סוכרוז
1.2% Triton X-100
NETN-150 לשטוף הצפה:
20 mM Tris-HCl, pH 7.4
150 מ"מNaCl
0.5% NP-40
3 מ"מ MgCl2
10% גליצרול
חיץ מחייב:
10 מ"מ HEPES pH 7.6
40 מ"מ KCl
3 מ"מ MgCl2
2 מ"מ DTT
גליצרול 5%

טבלה 2: קומפוזיציות הצפה.

1. הכנת התאים ואת מטריקס הזיקה

  1. תרבות קו תא מעניין-מפגש קטן (80%) בצלחת 10 סנטימטרים. השתמש 10 ס"מ צלחות עבור immunoprecipitations עצמאית (IP) של חלבון מעיל FLAG-מתויג NLS-MS2. בצעו את IP באמצעות נסיובי לתג FLAG-epitope. היא הביעה את הפלסמיד חלבון מעיל MS2-tagged FLAG, transfect תאים 24-48 שעות מראש של הקציר 20.
    הערה: RNP מסוים עשוי להיות מועשרת גרעיני או בציטופלסמהlysates ic או הכנה ביוכימית-מופרדים, כגון שברים של שיפוע סוכרוז. מומלץ לקצור את lysate מתאי הלא transfected במקביל להנהיג פקד שלילי נוסף.
  2. העברת 60 μl לכל IP של slurry חרוז מגנטי חלבון G לצינור 1.7 מ"ל microcentrifuge.
  3. מניחים את הצינור על מדף אבן שואבת צינורות microcentrifuge להפריד את החרוזים מן פתרון אחסון.
  4. הסר את פתרון האחסון על ידי בקפידה ציור אותו עם micropipette.
  5. הסר את הצינור ממדף המגנט.
  6. לשטוף לאזן את החרוזים עם 600 μl (10 פעמים את נפח בשימוש של חרוזים) של חיץ לשטוף 1x (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 3 מ"מ MgCl 2; ו -150 מ"מ NaCl) וסיבוב הקצה מעל לקצה עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
  7. מניחים את הצינור על מתלה מגנט ולהסיר למאגר לשטוף.
  8. הוסף 10 כרכים (600 μl) של חיץ 1x לשטוף נוגדן FLAG immunoprecipitating אל pr equilibratedחרוזים מגנטיים otein G (בהתאם לסכום המומלץ על ידי היצרן עבור immunoprecipitation) וסוף-יתר בסוף הסיבוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות כדי להטות את הנוגדן immunoprecipitating. השתמש IgG isotype המקביל כביקורת שלילית נוגדן מתאים.
  9. מניחים את הצינור על מתלה מגנט לאסוף את החרוזים ולהסיר את supernatant.
  10. הסר את הצינור ממדף המגנט ולשטוף את חרוזי מצומדות נוגדן עם 10 כרכים (600 μl) של חיץ וסיבוב לשטוף 1x עבור 3 דקות בטמפרטורת חדר. חזור על פעולה זו פעמיים.
  11. מניחים את הצינור על מתלה מגנט ולהסיר למאגר לשטוף.

2. קציר RNPs

הערה: הכן את RNPs בזמן הדגירה לאחר שלב 1.8.

  1. הסר בינוני תרבות מן התאים על ידי שאיפה לשטוף את התאים פעמיים עם 1-5 מ"ל של בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS). השתמש מגרד תא כדי לסלק רטוב,תאים חסידים לפני לאוסף על ידי צנטריפוגה ב 226 XG במשך 4 דקות ב 4 ° C.
  2. להוסיף 375 μl של קר כקרח, חיץ מלח נמוכה (20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 3 מ"מ MgCl 2; 10 מ"מ NaCl; 2 מ"מ DTT; קוקטייל פרוטאז-מעכב 1x, EDTA ללא; ו -5 μl / מ"ל RNase מונע) אל התא הגלול ולאפשר נפיחות ידי הצבתו על קרח במשך 5 דקות.
    הערה: חייט בהיקף של חיץ מלח נמוך פי לגודל התא הגלול. עבור 1.2 x 10 6 תאים מצלחת 10 סנטימטרים, 375 μl של חיץ מספיק.
  3. כדי לאסוף את lysate תא cytoplasmic, להוסיף 125 μl של חיץ תמוגה קרים כקרח (0.2 M סוכרוז / 1.2% Triton X-100), ולאחר מכן לבצע 10 משיכות עם homogenizer Dounce כי היה מראש צונן בתוך דלי קרח.
    הערה: כדי לאסוף את תמצית התא הכולל, חיץ תמוגה תקן ריפה מומלץ solubilizing nucleoplasm / הכרומטין.
  4. ספין microfuge במהירות שיא (16,000 XG) במשך 1 דקות; זו תנקה את supernatant של פסולתגרעיני nd.
  5. מעבירים את supernatant לצינור microcentrifuge 1.7 מ"ל חדש כי כבר על הקרח. קביעת ריכוז החלבון הכולל על ידי תקן, שיטה מועדפת ומעבדה, כגון ברדפורד Assay 23. שמורת aliquot של 10% לפחות לניתוח כתם מערבי, כדי לשמש פקד קלט. השתמש lysate תא שנקטפו מיד immunoprecipitation או לאחסן אותו ב -80 מעלות צלזיוס למשך ניתוח עתידי.
    הערה: מניסיוננו, דגימות אלה ניתן לאחסן ולהשתמש בהם כמה חודשים מאוחר יותר לניתוח immunoprecipitation ללא פשרה של שלמות.

3. Immunoprecipitation

  1. מוסיפים את העוצמה הרצויה של lysate התא שנקטפו, מבוסס על ריכוז החלבון נקבע בשלב 2.5, את החרוזים נוגדן מצומדות היעד. באמצעות חיץ לשטוף 1x, ולהביא את הנפח הכולל עד 600 μl ולסובב-סוף סוף-על במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
    הערה: פרק זמן זה מספיק כדי ליצורבידוד חזק של מתחמי RNP גבוהה זיקה תוך מזעור הלא ספציפי מחייב. לדלל מקורות RNP חלופיים, כגון שברים של שיפוע סוכרוז, לפחות 1: 1 עם חיץ לשטוף 1x, ולאחר מכן לדגור אותם עם מתחמי חרוז-נוגדן בעבר סיים, כאמור לעיל.
  2. לאחר 90 דקות של דגירה, במקום צינור IP על המדף מגנט לאסוף את החרוזים. שומרים לעצמנו את supernatant כמו זרימה דרך.
    הערה: זה זרימת דרך הראשונה היא מדגם מלא חשוב למדוד יעילות IP. ב assay immunoblot יספק אינדיקציה היעילה IP, כמו גם את הספציפיות של האינטראקציות הנחקרות. מומלץ לשמור supernatant זה לניתוח במורד הזרם.
  3. שטפו את החרוזים RNP הנכנס, מצומדות נוגדן עם 10 כרכים (600 μl) של חיץ לשטוף קר כקרח NETN-150 (20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 מ"מ NaCl; 3 מ"מ MgCl 2; 0.5% NP40; ו 10% גליצרול) תחת סיבוב עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלב 3 פעמים.
    הערה: מאגר זה נבדל למאגר תמוגה וביעילות מפחית עמותות חלשות או שאינן ספציפיות.
  4. בעקבות לשטוף האחרון, resuspend מתחמי RNP משותקת 60 μl של חיץ מחייב 1x קרים כקרח (10 HEPES מ"מ, pH 7.6, 40 KCl מ"מ; 3 מ"מ MgCl 2; 5% גליצרול; ו -2 מ"מ DTT) ובמילואים 10% של חרוזים המורכבים המשותקים עבור כתם מערבי ו -20% עבור בידוד RNA.

4. Elution

  1. התאם את העוצמת הנותרת עד 100 μl עם חיץ מחייב 1x קר כקרח לחמם את הצינור ב 70 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
  2. כדי לבודד מתחמי RNA חלבון מאותו מקור, להוסיף oligonucleotide DNA ~ 30-NT כי הוא משלים את הגבול 3 'רצף של RNA של עניין דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר עם נדנדה עדין (100 ננומטר של oligonucleotide מספיקה).
    הערה: oligonucleotide הוא antisense אל שאריות נוקלאוטיד סמוך התרגום להתחיל באתר של לבנות PCE משמש examplדואר בפרוטוקול זה. השלמת רצף מתאימה מסופקת על ידי תוכן GC ~ 40%. לעצב את מולקולת אנטיסנס קצר הכלאה יעילה באזור משלים המינימום של רנ"א היעד.
  3. להוסיף 5-10 יחידות של RNase H כדי צינור דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1 לדבוק רנ"א של RNA: היברידית DNA. מעבירים את supernatant לצינור 1.7 מ"ל microcentrifuge סטרילית; מדגם זה מכיל מתחמי RNP בשבי של עניין.
    הערה: בהתאם הנגישות של רנ"א מאותו המקור, שתיים או יותר סבבי טיפול RNase H עשויים להיות שימושיים כדי להגדיל את שפע המדגם עבור הניתוחים במורד הזרם.
  4. השתמש 20% של eluate בתוך כתם המערבי עבור חלבונים הקשורים ידוע ו -20% של eluate עבור בידוד RNA ואחריו RT qPCR. 60% הנותרים יכולים לשמש עבור ספקטרומטריית מסה או לזהות מרכיבי חלבון.
  5. במקביל, לייחד aliquot של lysate התא השמור בידוד RNA וניתוח RT-PCR. asse זהssment מספק אינדיקציה להעשרת RNA בתוך קומפלקס RNP.
    הערה: יש להשתמש בתכשיר החלבון המבודד כתם מלא מערבי כדי לוודא כי מחשוף RNase H היה יעיל בשחרור RNP ממתחם immunuoprecipitated.

5. חלבון אלקטרופורזה ומערב ניתוח כתם

  1. כ נושא 10-20% מכלל המדגם כדי SDS-PAGE וניתוח immunoblot פי פרוטוקול מעבדה סטנדרטי.
    הערה: שלב זה משמש כדי לאמת IP יעיל וספציפי לפני ניתוח RNA במורד זרם. זה יכול לשמש גם כדי להעריך את רכב החלבון של מתחם RNP מבודד.

אוסף 6. של RNA immunoprecipitated

הערה: בידוד RNA יכול להיעשות על ידי שיטת Trizol או בעקבות הפרוטוקול המתואר.

  1. Resuspend חצי מכלל המדגם ב 750 μl של מגיב thiocyanate guanidinium חומצה לדגור בחדר temperature במשך 5 דקות לפני חילוץ RNA מן מתחמי PCE-RNP בשבי.
  2. הוסף 200 μl של כלורופורם אל הצינור, לנער במרץ ל -10 שניות, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות.
  3. לאחר צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 15 דקות ב 4 ° C, לאסוף את השלב המימי לתוך צינור מחדש ולהוסיף נפח שווה של isopropanol. מערבבים היטב דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות לפחות. הוסף 1 μl של כחול גליקול למדגם ולאחסן אותו ב -20 ° C במקפיא במשך ממטרים או עיבוד יעילים במועד עתידי.
  4. צנטריפוגה הצינור ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 °. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant כדי לא להפריע גלולה RNA; השימוש טיפ micropipette p-200 מומלץ כדי להקל על התהליך.
  5. הוסף 500 μl של אתנול 75% על צינור אחד, מערבולת, ו צנטריפוגות צינורות ב XG 16,000 במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות לאסוף וזורקים supernatant כמו בשלב 6.4. אוויר-לייבש את הגלולה במשך 2-3 דקות ו resuspend ב 100 μl של RNase ללא מים.
    הערה: אין להאריך את זמן האוויר-מתייבש גלולה על מנת למנוע בעיה עם resuspension.
  6. החל 100 μl של מדגם RNA לעמודה לנקות RNA. לעבד אותו באמצעות הפרוטוקול של היצרן. Elute רנ"א 30 μl של מים ולאחסן RNase ללא ב -80 ° C עד 3 חודשים.
    הערה: RNA בודד זו מתאימה לניתוח במורד הזרם על ידי RT-PCR בזמן אמת (qPCR), microarray, וסדר RNA. בהתאם השפע של RNP ואת היעילות שבה RNP עניין מבודד, אותו lysate עלול להיות כפוף להם שניים או יותר סיבובים של IP כדי ליצור RNA מספיק רלוונטי עבור הניתוחים במורד הזרם.

7. RNA שעתוק לאחור והגברה של cDNA על ידי PCR

  1. נושא רנ"א המבודד להפוך שעתוק על ידי פריימר אקראי עם transcriptase הפוך באיכות גבוהה (RT), על פי manufaההוראות של cturer.
  2. כדי להגביר את RNA של עניין, לעצב פריימר antisense גן ספציפי בתוך רצף מחשוף H RNase. השתמש כמויות דומות של מולקולת אנטיסנס קצר, פריימר אקראי, או פריימר אוליגו-DT (ראה לוח חומרים).
    הערה: פריימר אוליגו-DT ו mRNA-adenylated פולי לספק תגובות בקרה חיוביות עבור תגובות RT-PCR.
  3. שמור 5% של תגובת RT (1 μl) עבור preparative qPCR נעשתה בד בבד עם IP lysate שלילי מלא דגימות DNA חיובי שליטה להגדיר את החיתוך לייצר עקומת סטנדרט. אם הערך CT של qPCR preparative הוא מעבר לטווח של עקומת סטנדרט, לדלל את התגובה RT ב ברציפות 1: 5 דילולים וחזור על שלב 7.2.
    הערה: עבור רצף RNA וטכניקת ספקטרומטריית מסה, עיין קובץ השיטה המשלים. אנא לחץ כאן to לקבלת קובץ שיטת משלים זה. (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.)

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תוצאות RIP לפני מזוהה RNAs איסור פרסום retroviral נבחרים RNAs הסלולר כי שיתוף המשקע עם DHX9 / RHA, כולל HIV-1 6, ג'ונד 6 וחור (פריץ ובוריס-לאוורי, לא פורסם). 5 retroviral 'UTR הודגמה לשתף המשקע עם DHX9 / RHA בגרעין לשתף לבודד בציטופלסמה על polyribosomes. זה מוגדר באופן ייחודי כמו אלמנט השליטה שלאחר תעתיק -acting cis (PCE) 6. כדי לבודד PCEgag מתחמי ribonucleoprotein RNA-RHA (RNPs) נוצר בתאים מתרבים, ביצענו F...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בידוד RNP ואסטרטגית זיהוי RNA מאותו המקור המתואר כאן הוא אמצעי סלקטיבית של חוקרת אינטראקצית RNA חלבון ספציפית לגילוי חלבוני מועמד שיתוף ויסות RNP ספציפי בתאים.

היתרון של שימוש מכוון oligonucleotide מחשוף RNase H לבודד RNPs הוא היכולת ללכוד במיוחד לנתח את ציס-מתנהג RNP אלמנט RNA מעל RNPs הטרוגנית הכבול במורד לאלמנט RNA ציס-בפועל של עניין. בגלל השפע של רנ"א מאותו מקור בתוך RNP נתונה הנו חלק מינורי של RNPs שנאס...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים תמיכה בהכרת תודה על ידי NIH P50GM103297, P30CA100730 ומקיף סרטן P01CA16058.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

2

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חלבון Dynabeads AInvitrogen10002D
Dynabeads חלבון GInvitrogen10004D
נוגדן נגד FLAGSigmaF3165
נוגדן נגד FLAGSigmaF7425
נוגדן נגד RHAVaxronPA-001
TRizol LSמגיב טכנולוגייתחיים10296-028
RNase HAmbionAM2292
ChloroformFisher ScientificBP1145-1
IsopropanolFisher ScientificBP26184
RNaeasy clean-up columnQiagen74204
Omniscript reverse transcriptaseQiagen205113
RNase OutInvitrogen10777-019
קוקטייל מעכב פרוטאזRoche5056489001
Triton X-100SigmaX100
NP-40Sigma98379
GlycerolFisher Scientific17904
פריימרים הקסמרים אקראייםInvitrogenN8080127
Oligo-dT פריימריםInvitrogen
AM5730G פריימרים PCRIDTפריימרים ספציפיים לגן עבור   הגברת PCR
אוליגונוקלאוטיד עבור RNase H מחשוף בתיווךIDTפריימר אנטי-חושי ל-RNA מטרה
TrypsinGibco Life technology25300-054
DMEM מדיום תרבית רקמותGibco Life טכנולוגיה11965-092
סרום בקר עובריטכנולוגיית Gibco Life10082-147
Tris baseFisher ScientificBP152-5
נתרן כלוריפישר סיינטיפיקS642-212
מגנזיום כלורידפישר סיינטיפיקBP214
DTTפישר סיינטיפיקR0862
סוכרוזפישר סיינטיפיקBP220-212
ממברנת ניטרוצלולוזהBio-Rad1620112
מעמד מגנטיצינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מ"ל המחזיק
מכסה מנועלתרבית רקמות מן החי
חממתלתרבית רקמות מן החי
מכשירהפרדת דגימת חלבון
מנגנוןחלבון העברת דגימת חלבון
מוכן לשימוש ג'ל חלבון (4-15%)הפרדת דגימת חלבון
צנטריפוגהלשולחן גלולה במורד הדגימה
מסובבמערבב את הדגימה מקצה לקצה
מערבולתמערבב את הדגימות
למינרי CO ג'ל חלבון העברת עליונה השולחן

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bandziulis, R. J., Swanson, M. S., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins as developmental regulators. Genes Dev. 3 (4), 431-437 (1989).
  2. Hogan, D. J., Riordan, D. P., Gerber, A. P., Herschlag, D., Brown, P. O. Diverse RNA-binding proteins interact with functionally related sets of RNAs, suggesting an extensive regulatory system. PLoS Biol. 6 (10), e255(2008).
  3. Glisovic, T., Bachorik, J. L., Yong, J., Dreyfuss, G. RNA-binding proteins and post-transcriptional gene regulation. FEBS Lett. 582 (14), 1977-1986 (2008).
  4. Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. RNA-binding proteins: modular design for efficient function. Nat.Rev.Mol.Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).
  5. Cochrane, A. W., McNally, M. T., Mouland, A. J. The retrovirus RNA trafficking granule: from birth to maturity. Retrovirology. 3, 18(2006).
  6. Hartman, T. R., Qian, S., Bolinger, C., Fernandez, S., Schoenberg, D. R., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A is necessary for translation of selected messenger RNAs. Nat.Struct.Mol.Biol. 13 (6), 509-516 (2006).
  7. Pullmann, R., et al. Analysis of turnover and translation regulatory RNA-binding protein expression through binding to cognate mRNAs. Mol.Cell.Biol. 27 (18), 6265-6278 (2007).
  8. Keene, J. D. RNA regulons: coordination of post-transcriptional events. Nat.Rev.Genet. 8 (7), 533-543 (2007).
  9. Moore, M. J. From birth to death: the complex lives of eukaryotic mRNAs. Science. 309 (5740), 1514-1518 (2005).
  10. Hassan, M. Q., Gordon, J. A., Lian, J. B., van Wijnen, A. J., Stein, J. L., Stein, G. S. Ribonucleoprotein immunoprecipitation (RNP-IP): a direct in vivo analysis of microRNA-targets. J.Cell.Biochem. 110 (4), 817-822 (2010).
  11. Selth, L. A., Close, P., Svejstrup, J. Q. Studying RNA-protein interactions in vivo by RNA immunoprecipitation. Methods Mol.Biol. 791, 253-264 (2011).
  12. Singh, D., Boeras, I., Singh, G., Boris-Lawrie, K. Isolation of Cognate Cellular and Viral Ribonucleoprotein Complexes of HIV-1 RNA Applicable to Proteomic Discovery and Molecular Investigations. Methods Mol.Biol. 1354, 133-146 (2016).
  13. Stake, M., et al. HIV-1 and two avian retroviral 5' untranslated regions bind orthologous human and chicken RNA binding proteins. Virology. 486, 307-320 (2015).
  14. Sung, F. L., et al. Genome-wide expression analysis using microarray identified complex signaling pathways modulated by hypoxia in nasopharyngeal carcinoma. Cancer Lett. 253 (1), 74-88 (2007).
  15. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat.Rev.Genet. 10 (1), 57-63 (2009).
  16. Michlewski, G., Caceres, J. F. RNase-assisted RNA chromatography. RNA. 16 (8), 1673-1678 (2010).
  17. Tacheny, A., Dieu, M., Arnould, T., Renard, P. Mass spectrometry-based identification of proteins interacting with nucleic acids. J. Proteomics. 94, 89-109 (2013).
  18. Duan, R., Sharma, S., Xia, Q., Garber, K., Jin, P. Towards understanding RNA-mediated neurological disorders. J.Genet.Genomics. 41 (9), 473-484 (2014).
  19. Butsch, M., Hull, S., Wang, Y., Roberts, T. M., Boris-Lawrie, K. The 5' RNA terminus of spleen necrosis virus contains a novel posttranscriptional control element that facilitates human immunodeficiency virus Rev/RRE-independent Gag production. J. Virol. 73 (6), 4847-4855 (1999).
  20. Bolinger, C., et al. RNA helicase A interacts with divergent lymphotropic retroviruses and promotes translation of human T-cell leukemia virus type 1. Nucleic Acids Res. 35 (8), 2629-2642 (2007).
  21. Bolinger, C., Sharma, A., Singh, D., Yu, L., Boris-Lawrie, K. RNA helicase A modulates translation of HIV-1 and infectivity of progeny virions. Nucleic Acids Res. 38 (5), 1686-1696 (2010).
  22. Lee, T., et al. Suppression of the DHX9 helicase induces premature senescence in human diploid fibroblasts in a p53-dependent manner. J.Biol.Chem. 289 (33), 22798-22814 (2014).
  23. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem. 72, 248-254 (1976).
  24. Glenn, G. Preparation of protein samples for mass spectrometry and N-terminal sequencing. Methods Enzymol. 536, 27-44 (2014).
  25. Keene, J. D., Komisarow, J. M., Friedersdorf, M. B. RIP-Chip: the isolation and identification of mRNAs, microRNAs and protein components of ribonucleoprotein complexes from cell extracts. Nat.Protoc. 1 (1), 302-307 (2006).
  26. Ranji, A., Shkriabai, N., Kvaratskhelia, M., Musier-Forsyth, K., Boris-Lawrie, K. Features of double-stranded RNA-binding domains of RNA helicase A are necessary for selective recognition and translation of complex mRNAs. J.Biol.Chem. 286 (7), 5328-5337 (2011).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNARNPFLAGRNase HRNAWestern BlotRT PCR

מאמרים קשורים