איתור של טפסים השתנו ציטוזין שימוש אימונוהיסטוכימיה רגיש

Summary

כאן אנו מתארים שיטה אימונוכימית רגישה למיפוי ההתפלגות המרחבית של נגזרות חמצון 5mC המבוססת על שימוש בנוגדנים משניים מצומדים לפרוקסידאז והגברת אות טירמיד.

Abstract

מתילציה של בסיסי ציטוזין (5-מתילציטוזין, 5mC) המתרחשת בגנום של בעלי חוליות קשורה בדרך כלל להשתקת שעתוק. 5-הידרוקסילמתילציטוזין (5hmC), 5-פורמיל ציטוזין (5fC) ו-5-קרבוקסיל ציטוזין (5caC) הם בסיסי הציטוזין המותאמים שהתגלו לאחרונה המיוצרים על ידי חמצון אנזימטי של 5mC, שתפקידיהם הביולוגיים נותרו מעורפלים יחסית. מספר גישות החל מביוכימיות ועד לטכניקות מבוססות נוגדנים שימשו כדי לחקור את ההתפלגות הגנומית והתוכן העולמי של שינויים אלה במערכות ביולוגיות שונות. למרות שחלק מהגישות הללו יכולות להיות שימושיות להערכה כמותית של צורות מותאמות אלה של 5mC, רוב השיטות הללו אינן מספקות מידע מרחבי לגבי התפלגות שינויי ה-DNA הללו בסוגי תאים שונים, הנדרשים להבנה נכונה של תפקידיהם הפונקציונליים. כאן אנו מציגים שיטה רגישה ביותר לזיהוי אימונוכימי של הצורות המותאמות של ציטוזין. שיטה זו מאפשרת זיהוי משותף של סימנים אפיגנטיים אלה עם סמני שושלת חלבונים וניתן להשתמש בה כדי לחקור את הלוקליזציה הגרעינית שלהם, ובכך לתרום לפענוח תפקידיהם הביולוגיים הפוטנציאליים בהקשרים ניסיוניים שונים.

Introduction

מתילציה של בסיסי ציטוזין בדנ"א (5mC) מייצגת סימן אפיגנטיים גדול נמצא הגנום חוליות הקשורות תעתיק השתקת ^1. 5mC הוא שהוצג ומתוחזק על ידי methyltransferases DNA ^2-5, ו הוכח ממלאי תפקידים חשובים מספר תהליכים ביולוגיים כולל החתמה גנומית, איון כרומוזום X, התמיינות, ופיתוח ^{3, 6.} כתוצאה מכך, השיבוש 5mC דפוסי גנומי קשור במספר המחלות ^{7, 8-11.} למרות ההתקדמות בהבנת תפקיד 5mC בפיתוח ומחלות, הוא עדיין אינו ידוע בעיקר איך זה סימן מתבצע סר בפיתוח רקמות בוגרות. מספר מנגנונים האפשריים של demethylation DNA הוצעו לאחרונה כוללים מנגנוני demethylation אקטיביים ופסיביים ^{12, 13, 14, 15.} גילוי של תוצרי חמצון רציפי 5mC בתיווך enzym טרנסלוקציה עשר-אחת עשרes (tet1 / 2/3) כגון 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), ו -5 carboxylcytosine (5caC) ב איקריוטיים DNA ^{16, 17, 18, ​​19} הנחיה ספקולציות אם הם עשויים לשמש ביניים של תהליכים demethylation DNA או לפעול יציב סימני אפיגנטיים בזכות עצמם ^13. בעוד ההפגנה כי הרכיב של תיקון כריתת בסיס, הטימין-DNA glycosylase (TDG) יכול להיקשר ולהסיר הן 5fC ו 5caC מ- DNA ^{19, 20} מצביעה על תפקיד עבור נגזרי 5mC השונים בתוך demethylation DNA פעיל. ראיות אחרונות מראה כי 5fC / 5caC יכול לווסת את קצב נקודות processivity RNA II למעורבות הפוטנציאל של סימנים אלה בתקנה תעתיק ^29. בשל חשיבות ביולוגית הפוטנציאל הזה של טפסים חמצון של 5mC, מגוון של טכניקות המבוססות ביוכימיות נוגדן הועסק ללימוד הפצה הגנומי שלהם ותוכן העולמי ^{16, 19-24.}

בהתחשב בכך שרוב tהוא החולייתנים איברים המורכבים של סוגי תאים שונים וכי חלוקת בסיסי ציטוזין שונה היא רקמות תאים מסוג מסוים ^{16-18, 20, 23, 25-27,} בקביעת הפריסה המרחבית של נגזרי 5mC חמצון ברקמות שונות הופך חשובת ניסיוני משימה הכרחית חשיפת התפקודים הביולוגיים שלהם. רוב הגישות מבוססות ביוכימיות נוגדן לא מספקים שום מידע מרחבים בדבר חלוקת הצורות השונות של 5mC ברקמות שונות-סוגי תאים. לעומת זאת, טכניקות המבוססות immunochemistry יכולות לספק כלי מהיר להערכת הפריסה המרחבית ולוקליזציה גרעין של 5mC ²⁸ והנגזרים המושחרים שלה ^20. כי הוא אמר, השפע נמוך מאוד המדווח של 5fC (20 בכל 10 ⁶ ציטוזין) ו 5caC (3 מכל 10 ⁶ ציטוזין) בגנום העכבר ¹⁸ מהווים אתגר משמעותי עבור immunochemistry הסטנדרטי.

כאן,אנו מתארים שיטת חיסון רגישה מאוד מספקות חזק וכן איתור מהיר של טופס חמצון של ציטוזין ברקמת המוח יונק. על ידי שילוב נוגדנים משני מצומדות peroxidase יחד עם צעד הגברת אות, שיטה זו עוקפת את האתגרים של גילוי הסכומים נמוכים מאוד של 5fC ו 5caC. בנוסף, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לשתף לזהות הצורות השונות של ציטוזין עם סמנים ספציפיים שושלת, המשלימה גישות אחרות ביעילות הבהרת התפקודים הביולוגיים של סימני אפיגנטיים אלה.

Protocol

כל הנהלים-מעורבים בעלי חיים בוצעו בהתאם לוועדה האתית של מאוניברסיטת נוטינגהם.

1. בחירת הכנת רקמות מתאימה Immunostaining

1. צור סעיף מוטבע פרפין של עוברי עכברים CD1 wild-type ורקמות במוח הבוגר כפי שתואר לעיל ^25. השתמש במקטעים רקמת המוח קבוע עם או 4% פורמלדהיד (FA) או 4% paraformaldehyde (PFA) עבור immunostaining השיטה ^25.
   הערה: שימוש סעיפי רקמות מוטבעות פרפין דורש דה-שעווה לפני תיוג נוגדן. מאז הטיפול עם 2 - 4 חומצה הידרוכלורית M (HCl) מועסקי פרוטוקול denaturing DNA אינו תואם אסטרטגיות יחזרו אנטיגן ביותר, אנו ממליצים על השימוש משני סעיפי cryo- או microtome לדו-זיהוי של נגזרי חמצון 5mC עם חלבון סמנים.

2. סעיפים רקמות Embedded Dewaxing פרפין < / P>

1. בארון בטיחות ריצה בכיתה שני, לשטוף את סעיפי רקמות מוטבעות פרפין בתוך צנצנת Coplin המלאה קסילן, 2 פעמים במשך 10 דקות כל אחד ב RT.
   הערה: חשוב להשתמש קסילן הטרי כמו הסרת פרפין שלמה יכולה להוביל דפוסי מכתים עקביים.
2. לאחר-שעוות דה, במהירות רעננותם סעיפי הרקמה ידי שטיפה רציפה 95, 75, ו אתנול 50% במשך 10 דקות כל אחד ב RT.

קיבוע 3. Permeabilization של Cryo- וסעיפים Microtome

1. תקן את סעיפי רקמות rehydrated ידי הצבה או קרים כקרח PFA 4% או 4% FA במשך 15 דקות ב RT.
2. הסר מקבע עודף על ידי שטיפה את הסעיפים PBS (חיץ מלוחים פוספט) במשך 5 דקות ב RT.
3. Permeabilize בסעיפים רקמות על ידי הצבת בתוך צנצנת Coplin מלא PBX (0.5% Triton X-100 ב PBS) במשך 30 דקות ב RT. הסר PBX עודף ידי שטיפת חלקים בקרוב PBT (0.01% Tween 20 ב PBS).

jove_title "> 4. Immunostaining עבור נגזרים Oxi-5mC

1. מניחים את חתכי permeabilized ב 2 N HCl למשך 60 דקות ב RT עבור depurination של ה- DNA.
   הערה: למרות ריכוזים גבוהים יותר של HCl (למשל, 4 N) להוביל על denaturing DNA יעיל יותר, הם אינם תואמים עבור שיתוף זיהוי של oxi-MCS עם DAPI.
2. מניחים את הסעיפים 10 mM Tris-HCl (pH 8.5) במשך 30 דקות ב RT לנטרל את HCl. לחלופין, לשטוף את הסעיפים שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד PBS. דגירת מקטעי PBT במשך 5 דקות ב RT.
3. מוציאים בזהירות את הנוזל מן האזור שסביב קטע רקמה בלי לתת קטע רקמה להתייבש לחלוטין בכל שלב על ידי רועדת את השקופית בעדינות. השתמש בעט מחסום הידרופובי להקיף את החלק בלי לגעת הסעיף.
   הערה: עט מחסום הידרופובי מקטין את היקף הנוגדן נדרש להכתים את הרקמות יכול להרשות מקטעים מרובים כדי להיות מוכתמים בידולנוגדני t באותו השקופיות.
4. דגירה סעיפים 100 μl של פתרון לחסימת (אלבומין בסרום שור 10% ב PBS) במשך שעה 1 ב RT בתא לח.
   הערה: הדילוג על שלב זה לא משפיע על יעילות עבודת מכתים בסיסי ציטוזין השונה.
5. דגירת סעיפי הרקמה ב 100 μl של דילול 1: 5,000 של אנטי-5hmC חד שבטי עכבר דילול 1: 1,000 של נוגדנים ראשוניים אנטי 5caC הארנב polyclonal בחסימת פתרון עבור שעה 1 ב RT בתא לח. לחלופין, לבצע את הדגירה לילה בשעה 4 ° C במידת הצורך.
   הערה: ייתכן שחלקים מהעובד ללא נוגדנים ראשוניים יכולים לשמש שולטת מתאימה שלילית עבור ההליך המכתים. 12.5 ימים לפרסם חלקים במוח העוברי murine coitum המועשר 5caC, 5fC ו 5hmC ²⁰ יכול לשמש כביקורת חיובית.
6. סור נוגדנים עודפים ידי שטיפת החלקים בתוך צנצנת Coplin המלאה PBT שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב Copצנצנת לין ב RT.
   הערה: הגדלת נפח פתרונות כביסה יכולה להפחית מכתים רקע.
7. הסרת עודפי PBT, ואם יש צורך, להקיף את החלקים שוב עם עט מחסום הידרופובי כמו PBT מכילים חומר ניקוי שיכול להחליש את מחסום הידרופובי.
8. הפוך דילול 1: 400 של נוגדן HRP-מצומדות נגד ארנב עיזים דילול 1: 400 של החמור אנטי עכבר נוגדנים 555 מצומדות בחסימת פתרון.
9. דגירת סעיפי הרקמה ב 100 μl של תערובת נוגדנים משני משלב 4.9 עבור שעה 1 ב RT בתא לח.
10. שטפו את החלקים רקמות בתוך צנצנת Coplin מלא שלוש פעמים PBT במשך 5 דקות כל אחד ב RT.
11. מניח את סעיפי רקמות 100 μl של דילול 1: 200 של tyramide למאגר הגברת אות tyramide עבור 2 דקות ב RT.
12. מיד, להסיר פתרון tyramide עודף על ידי שטיפת שקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות כל אחד ב PBT.
13. carefully להסיר PBT עודף ומיד לכסות את החלקים עם ירידה של הרכבה בינונית (ראה חומרים רשימה).
14. בעדינות להניח coverslip על סעיפי רקמות ומייד לאטום את coverslip עם לק.
15. אחסן את סעיפי הרקמות ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שעות לפני בדיקה מיקרוסקופית. בדוק תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 405, 488 ו / או 555 ננומטר (10 - 40X גדלה).

Results

כדי לקבוע את חלוקת 5hmC בסעיפים רקמות המוח, ביצענו איתור שיתוף של שינוי אפיגנטיים זה עם סמן נוירונים שלאחר mitotic, NeuN, העסקת נוגדנים מסחרי אנטי 5hmC כי אינטראקציה ספציפית עם סימן זה, אך לא עם צורות אחרות של שינוי ציטוזין ^{20, 25.} ניתוח immunohistochemical של הפצות 5hmC ו 5caC במוח הבוגר גילה כי בעוד 5hmC מכתים בולט שיתוף לוקליזציה עם תאים חיוביים NeuN, ותאי גלייה NeuN שלילי להחזיק רמות נמוכות יותר של גנומית 5hmC (איור 1) ^20.

הראינו לאחרונה כי ט תלוי חמצון 5mC הוא פעיל במהלך מפרט שושלת של תאי גזע עצביים (NSCs) ^20. למרות היותו בלתי מורגש immunochemically ב NSCs, 5fC ו 5caC להפגין immunostaining בולט בשלבים מוקדמים של בידול NSCs לקראת עצבי nd שושלות גליה. שני סימנים אלה זמניים לצבור במקביל מראה של הסמנים של עצבי מוקדם והבחנת גליה ^20. כדי לקבוע את חלוקת 5caC להבדיל NSCs בצענו מכתים שיתוף של הסימן הזה עם GFAP סמן גליה על התרבויות הקבועות של NSCs ב 3 ימים של אינדוקציה של בידול גליה. בניגוד NSCs או האסטרוציטים בוגרים (מידע לא מוצג), צפינו אות 5caC חזקה שיעור גבוה היחסי של תאי מבטאי GFAP בתרבויות אלה (איור 2) ^20.

איור 1. Co-immunostaining של 5hmC (ירוק) עם NeuN (אדום) ברקמות למבוגרים המוח counterstained עם DAPI (כחול). ערוצי הפרט ואת תצוגה ממוזגת מוצגים. ברי סולם הם 25 מיקרומטר.blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. Co-immunostaining של 5caC עם GFAP בתרבות של המל"ל ב יום 3 של גליה בידול. ערוצי פרט ואת התצוגה הממוזגת מוצגים. ברי סולם הם 20 מיקרומטר. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

למרות השפע הנמוך דיווח נגזר חמצון 5mC, 5fC ו 5caC ברקמות כמה יציג מגבלות משמעותיות עבור פרוטוקול immunochemistry רגיל, השילוב של נוגדנים משני מצומדות peroxidase אפשר זיהוי של שינויי ציטוזין אלה ברקמות קבועות ותאים (איור 2) . עם זאת, זמן הדגירה האופטימלי עם פתרון tyramide צריך להיות מותאם באופן ניסיוני עבור כל אצווה פרט של tyramide ערכת הגברת אות שבו קשר ליניארי בין עוצמת אות ומשך הגברת אות מבוססת tyramide הוא ציין, לפרטי רא אלמיידה et al. 2012 ²⁶ . בנוסף, יחס אות / רקע ניתן לשפר באופן משמעותי על ידי ביצוע השוטף בצנצנת Coplin כדי לאפשר הסרה יעילה של נוגדנים עודפים. לאחר דגירה עם פתרון tyramide, חשוב מיד כדי לעצור את התגובה על ידי שטיפה בתמיסת PBT דמכתים רקע ecrease. זה קריטי לא לאפשר סעיפים לייבש בכל נקודה במהלך ההליך.

היעילות של depurination DNA ניתן לשפר על ידי ביצוע התגובה depurination על 37 מעלות צלזיוס. בעת שימוש 4 N HCl במקום 2 N משפר מכתים הצורות השונות של 5mC באמצעות 4 N HCl עבור depurination DNA לא ירשתי מכתים שיתוף עם DAPI, כפי שהוא מקיים אינטראקציה בלעדי עם DNA גדילים כפול.

למרות טכניקה זו יכולה לספק הערכה וכמותיות חזקה של צורות השונות של בסיסי ציטוזין שם לזיהוי, זה לא יכול לשמש לצורך הערכת הרמות המוחלטות של 5mC או נגזר החמצון שלה. לכן, אנו ממליצים על שימוש משלימים אחרים אבל כמותית מתקרב ^{16, 19 -24.} מאז גילויו של נגזרי חמצון 5mC הגנומים יונקים, מספר גישות פותחו ללמוד התפקידים הביולוגיים שלהם ^{16, 19-24.} אמנם אלה approaצ 'ס יכול להיות בעל ערך בקביעת הרמות המוחלטות של נגזרי חמצון 5mC, הם אינם מספקים מידע לגבי הפריסה המרחבית שלהם ^{20, 26.} יש לנו בהצלחה השתמשו בשיטה המתוארת כאן כדי למפות את ההתפלגות ולוקליזציה המרחבי של נגזרי חמצון 5mC בסוגי תאים שונים של המוח המתפתח ומבוגר ²⁰

מדגים הפריסה המרחבית שלהם ^20, טכניקה זו יכולה להיות מכרעת להבנת השלכות הביולוגיות ועל הגורל נגזר חמצון של 5mC בהקשרים ביולוגיים שונים בם נגזרים שונים אלה של 5mC ניתן לאתר כולל בידול, פיתוח ומחלות הסלולר. בנוסף, השיטה אנו מתארים כאן יכולה לתת הערכות כמותית למחצה של נגזרי החמצון של 5mC ברקמות שונות על ידי בחינה של קינטיקה של תגובת peroxidase (אשר עומדת ביחס לעוצמת המכתים) בזמני דגירה שונים עם tyramiדה ^26.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
צנצנת קופלין	Cole-Parmer	UY-48585-30	זכוכית עשויה
קסילן			השתמש רק בארון בטיחות Class II
מאגר פוספט מלח (PBS)	Fisher Scientific	12821680	pH 7.5, מסונן לפני השימוש
4% פרפורמלדהיד (PFA)	Sigma Aldrich	P6148	לאחר הכנתו ניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C במכסים למספר חודשים
4% פורמלדהיד  (נ"א)	Sigma Aldrich	F8775	לאחר הכנתו ניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C במרכאות במשך מספר חודשים
אתנול, נטול מים, דנטורציה, דרגה היסטולוגית	סיגמא אולדריץ'	64-17-5	95, 75, 50% ב- PBS
0.01% Tween 20 ב- PBS	Sigma Aldrich	P9416	PBT
0.5% Triton X-100 ב- PBS	Sigma Aldrich	X100	PBX
2 N HCl	Sigma Aldrich	71826	זהירות רעילה במיוחד
100 מ"מ Tris-HCl	Promega	H5121	pH מותאם ל 8.5
עט מחסום הידרופובי	Abcam	ab2601	לאימונוהיסטוכימיה
תא לחות שקופיות	מעבדה מכשיר מדעי	197-BL
נוגדן עכבר anti-5mC	דיאגנוד	C15200081	נוגדן ראשוני חד שבטי
אנטי 5hmC נוגדן	פעיל מוטיב	פעיל 39791	ארנב פוליקלונלי נוגדן ראשוני
נגד 5caC נוגדן	פעיל מוטיב	61225	ארנב פוליקלונלי נוגדן ראשוני
מצומד נגד ארנב נוגדן שני	Dako	K1497
555-congjuated עז נוגדן נגד עכברים	בדיקות מולקולריות	A-11005	נוגדן משני
10% BSA	Sigma Aldrich	A9418	תמיסת חסימה
22 x 32 מ"מ החלקות כיסוי זכוכית	BDH	406/0188/24
מערכת הגברת אותות טירמיד	Perkin Elmer	NEL741001KT	ניתן להשתמש בנוגדנים משניים מצומדים אחרים של פלואורוכום לזיהוי משותף של oxi-5mC
מדיום הרכבה עם DAPI	Vector Labs	H-1200
לק
עוף פוליקלונלי אנטי-GFAP נוגדן פוליקלונלי	Thermo Scientific	PA5-18598	1:400 דילול
אנטי-NeuN עכבר נוגדן חד שבטי	Merck milipore	MAB377B	1:400 דילול