Method Article

התרמת סתימה שכפול לאתרים ספציפיים ב E. coli באמצעות מערכת מפעיל פלורסנט מדכא

DOI:

10.3791/54434

⸱

August 21st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן מערכת המשתמשת בבלוק חלבון in vivo ספציפי לאתר, הפיך כדי לעכב ולמוטט מזלגות שכפול ב-Escherichia coli. הקמת בלוק השכפול מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ואלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז ניטרלי-ניטרלי משמשת להדמיית חומרי ביניים לשכפול.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מכשולים המצויים על גבי ה- DNA, כוללים חלבונים בחוזקה נכנס ונגעים שונים, יכולים לעכב את ההתקדמות קשה של השכפול של התא. ההשתהות של replisome יכולה להוביל את ניתוק מן כרומוזום, או באופן חלקי או בשלמותו, מובילה לקריסה של המזלג שכפול. ההתאוששות מקריסה זו היא הכרח עבור התא שכפול כרומוזומליות מלא במדויק ולאחר מכן לחלק. לכן, כאשר הקריסה מתרחשת, התא התפתח מנגנונים מגוונים המתרחשים לשחזר את מזלג DNA ולאפשר שכפול להסתיים עם איכות גבוהה. בעבר, מסלולי תיקון שכפול אלה בחיידקים נחקרו באמצעות נזק UV, אשר יש לו את החיסרון של לא להיות מקומי לאתר ידוע. כתב יד זה מתאר מערכת ניצול מערכת מפעיל הקרינה מדכא (FROS) כדי ליצור בלוק חלבון מסוים באתר שיכולים לגרום השתהות וקריסה של שכפול FOrks ב coli Escherichia. פרט הפרוטוקולים כיצד מצב של שכפול ניתן דמיינו תאים בודדים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ביניים DNA שכפול יכול להיות מנותח על ידי ג'ל אלקטרופורזה agarose 2-ממדי. מוטציות טמפרטורה רגישות של רכיבי replisome (למשל DnaBts) יכולות להיות משולבות לתוך המערכת כדי לגרום לקריסה סינכרוני של המזלגות שכפול. יתר על כן, את התפקידים של חלבונים רקומבינציה helicases כי הם מעורבים בתהליכים אלה ניתן ללמוד באמצעות knockouts הגנטי בתוך מערכת זו.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך שכפול ה- DNA, replisome פונה מכשולים על DNA הפוגע בהתנהלותה. נזק לדנ"א כולל נגעים ופערים כמו גם מבנים סוטה יכול למנוע replisome מ שתמשיך 1. לאחרונה, זה כבר נמצא כי חלבונים מאוגדים ה- DNA הם המקור הנפוץ ביותר של מניעה שכפול התקדמות מזלג 2. הידע של אירועים בעקבות המפגש של replisome עם בלוק nucleoprotein הוגבל בעבר על ידי חוסר היכולת לגרום בלוק כזה כרומוזום של תא חי בבאתר ידוע. ניתוח במבחנה שיפרה את ההבנה שלנו של התנהגות קינטית של replisome פעיל כאשר הוא פוגש סתימה nucleoprotein 3, כמו גם את הפרטים מכניסטית של replisome עצמו 4,5. הבנה נוכחית של התיקון של שכפול נעשית בדרך כ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. חסימת שכפול עם FROS

  1. התרמת הסתימה שהכפולה
    1. לדלל תרבות לילה טריה של E. coli זן נושאת מערך TETO ו pKM1 18 עד OD 600nm = 0.01 בתווך מורכבים לדלל (0.1% tryptone, 0.05% תמצית שמרים, 0.1% NaCl, 0.17 M KH 2 4 PO, 0.72 ח"כ 2 HPO 4) עם אנטיביוטיקה כנדרש לבחירה.
      הערה: אל תוסיף טטרציקלין לבחירה כפי שהוא אינו תואם עם מערכת זו. הפוך את עוצמת הקול של התרבות שווה ערך ל -10 מ"ל ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FROS הוא בלוק nucleoprotein מושרה, אתר ספציפי המאפשר ביניים שכפולים להיות דמיינו בתאי חי 12,18. עיצוב ניסיוני כללי על דגימת תאים מתואר באיור 1. העיתוי של דגימת וריאציות רקע גנטי לעשות זה מערכה צדדית ללימוד התיקון של גוש כזה. סכמטית ממחישה עד כמה מוטציות רגישות טמפרטורה, כגון dnaB ts ו dnaC ts שנוצלו בעבר 18, יכולות להיות מנוצלות במערכת זו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במהלך שכפול הכרומוזומים, מנגנון השכפול יתקל במכשולים שונים המונעים את התקדמותו. כדי להבטיח שכל הכרומוזום ממקור יחיד ישוכפל, לחיידקים יש מסלולים רבים לתיקון ה-DNA המאפשרים טעינה מחדש שלה-Replisome 20,21. נגעים, שברים חד-גדיליים, שברים דו-גדיליים וחלבונים הקשורים היטב ל-DNA עשויים להיות מטופלים כל אחד באמצעות מסלול ייעודי, אם כי סביר להניח שתהיה חפיפה משמעותית במסלולים אלה. המכשול הנפוץ ביותר לרפליזומים בתאים חיים הוא בלוק נוקלאופרוטאין2. עם זאת, שני קשיים ארוכי שנים בחקר ההתנגשות של רפליזום עם חסימת .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האוסטרלית [DP11010246].

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
TryptoneSigma-Aldrich16922רכיב מדיית גידול
נתרן כלורידVWR27810.364רכיב מדיית גידול
תמצית שמריםסיגמא-אולדריץ'92144רכיב מדיית גידול
אשלגן פוספט מונו-בסיסיSigma-AldrichP9791רכיב מדיית גדילה; רכיב מאגר אשלגן
אשלגן פוספט דו-בסיסיSigma-AldrichP3786רכיב מדיית גדילה; רכיב מאגר אשלגן
L-ArabinoseSigma-AldrichA3256לאינדוקציה של ייצור TetR-YFP
Anhydrotetracycline hydrochlorideSigma-Aldrich37919שחרור בלואק שכפול
Axioskop 2 מיקרוסקופ פלואורסצנטיZeiss452310הדמיה של תאים
eYFP סט מסנניםChroma Technology41028הדמיה של
מצלמת YFP CCDHamamatsuOrca-AGהדמיה של תאים
MetaMorph  תוכנה (התקנים מולקולריים)SDR Scientific31282גרסה 7.8.0.0 המשמשת בהכנת כתב יד זה
AgaroseBiolineBIO-41025לתקעי אגרוז ואלקטרופורזה ג'ל
דוחה מים מזכוכית מקורית (Rain-X)AutobarnDIO1470לייצור תקעי אגרוז
TRISVWRVWRC103157PTE, רכיב
מאגר TBEחומצה אתילן דיאמין-טראצטיתAjax FinechemAJA1800.5 M EDTA תמיסת מלח דיסודיום מותאמת ל-pH 8.0 עם NaOH.
נתרן אזידסיגמא-אולדריץ'S2002חומר בקטריוסטטי
חומצה הידרוכלוריתסיגמא-אולדריץ'258148TE
נתרן דאוקסיכולטסיגמא-אולדריץ'D6750רכיב חיץ ליזה של תאים
N-Lauroylsarcosine מלח נתרן (סרקוזיל)Sigma-AldrichL5125ליזיס תאים ורכיב חיץ ESP
Rnase ASigma-AldrichR6513רכיב מאגר ליזה של תאים
LysozymeAmresco6300רכיב מאגר ליזה של תאים
Proteinase KAmrescoAM0706ESP רכיב מאגר
תת-תא דגם 192Cell BioRad1704507מערכת אלקטרופורזה
UV transilluminator 2000BioRad1708110הדמיה של DNA
ניתן להשתמש גם ב-Ethidium BromideBioRad1610433 הדמיה של DNA
חומצה בוריתVWRPROL20185.360רכיב TBE
Hybond-XL ניילון MemrbaneAmershamRPN203SZeta-Probe Memrbane (BioRad 1620159)
נייר כרומטוגרפיה 3 מ"מ Whatman GEHealthcare Life Sciences3030690Southern Blotting
HL-2000 HybrilinkerUVP95-0031-01/02קישור צולב של DNA והכלאה
חומצה דאוקסיריבונוקלאית מזרע סלמוןSigma-Aldrich31149רכיב חיץ הכלאה
נתרן הידרוקסידSigma-AldrichS5881רכיב חיץ דנטורציה
טריסודיום ציטראט דיהידראטVWRPROL27833.363מאגר העברה
נתרן דודציל סולפט (SDS)Amresco227Wash Buffer
רכיב אלבומין בסרום בקרSigma-AldrichA7906רכיב מאגר היברידיזציה
פריימרים אקראיים של HexamerBiolineBIO-38028
Klenow FragmentNew England BioLabsM0212L
dNTP SetBiolineBIO-39025
Adenosine 5'-triphosphate-< sup>32P-ATPPerkinElmerBLU502A
אחסון זרחן מסךGE Healthcare Life SciencesGEHE28-9564-76BAS-IP MS 3543 E רב תכליתי תקן 35 ס"מ x 43 ס"מ מסך
טייפון FLA 7000GE Healthcare מדעי החיים28-9558-09הדמיה של כתם
בקבוק הכלאהUVP07-0194-0235 מ"מ x 300 מ"מ
רכיב חיץ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mirkin, E. V., Mirkin, S. M. Replication fork stalling at natural impediments. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (1), 13-35 (2007).
  2. Gupta, M. K., et al. Protein-DNA complexes are the primary sources of replication fork pausing in Escherichia coli. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Repressor Operator SystemSite Specific Replication BlockageEscherichia coli Replication ForkFluorescence Microscopy VisualizationTwo Dimensional Gel ElectrophoresisTemperature Sensitive MutantsGenetic Knockout AnalysisDNA Replication IntermediatesAgarose Plug PreparationSouthern Hybridization Detection

Related Articles