כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Micropatterning והרכבת 3D microvessels
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
בשנת פלטפורמות במבחנה ללמוד בתאי האנדותל וביולוגיה וסקולרית מוגבלים במידה רבה לתרבות תא האנדותל 2D, לזרום תאים עם פולימר או מצעים מלוחים וזכוכית, מבחני היווצרות צינור מבוסס הידרוג'ל. מבחנים אלו, תוך אינפורמטיבי, לא לשחזר גיאומטרית לומן, מטריקס ראויה, קרבה רבה תאית, אשר ממלאת תפקידים מרכזיים ויסות תפקוד כלי דם. כתב יד זה מתאר שיטת הזרקה לייצר כלי Engineered בקטרים בסדר גודל של 100 מיקרומטר. Microvessels מיוצרים על ידי זריעת לתאי אנדותל ערוץ microfluidic מוטבע בתוך סוג יליד שאני קולגן הידרוג'ל. על ידי שילוב תאי parenchymal בתוך המטריצה קולגן לפני לתעל היווצרות, microenvironments רקמות הספציפי יכול להיות מודל ולומד. מודולציות נוסף של הרכב נכסים ומדיה הידרודינמית לאפשר בקרה של תפקוד כלי הדם מורכב במיקרו-סביבה של הרצוי.פלטפורמה זו מאפשרת לחקר גיוס תא perivascular, אינטראקציות האנדותל דם, תגובת זרימה, ואינטראקציות-כלי דם לרקמות. microvessels המהונדס מציע את היכולת לבודד את השפעת מרכיבים בודדים של נישת כלי דם ולשלוט הכימיים שלה בדיוק, מכאניות, ואת תכונות ביולוגיות ללמוד ביולוגיה וסקולרית בשתי בריאות ומחלות.
מבוא
על נימי הדם הזעירים בכל איבר עוזר להגדיר את microenvironment רקמות, לשמור על הומאוסטזיס רקמות לווסת דלקת, חדירות, פקקת, ו פירוק פיברין 1,2. האנדותל כלי הדם, בפרט, הוא ממשק בין זרימת הדם ואת הרקמה שמסביב ועל כן היא משחקת תפקיד קריטי בויסות וסקולרית ותפקוד איברים בתגובה לגירויים כגון כוחות הידרודינמית במחזור ציטוקינים והורמונים 3 - 5. הבנת יחסי הגומלין המפורט בין האנדותל, הדם, ואת המיקרו-סביבת הרקמה הסובבת חשובה לחקר ביולוגיה של כלי דם ואת התקדמות מחלה. עם זאת, התקדמות בחקר אינטראקציות אלה התעכבה בשל מוגבלות כלים במבחנה שאינו לשחזר במבנה כלי דם vivo ו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
Microfabrication 1. Patterned polydimethylsiloxane (PDMS) עם רשת עיצוב
- ייצור פרוסות סיליקון כדי ליצור תבנית שלילית של עיצוב הרשת
- צור דפוס רשת באמצעות כל תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). ודא כי הממד האלכסוני בין הכניסה והיציאה להתאים את המרחק בין מאגרי הכניסה ויציאה על מכשירי דיור שבשלבים הבאים (ראה 2.1.1).
הערה: העיצוב של התבנית עצמה היא בהתאם מותאם אישית על מטרות המחקר הספציפי של המשתמש (ראה איור 1 עבור דפוסים לד....
- צור דפוס רשת באמצעות כל תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). ודא כי הממד האלכסוני בין הכניסה והיציאה להתאים את המרחק בין מאגרי הכניסה ויציאה על מכשירי דיור שבשלבים הבאים (ראה 2.1.1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
פלטפורמת הכלים המהונדסת יוצרת microvasculature הפונקציונלי מוטבע בתוך סוג קולגן טבעי שאני מטריקס ומאפשרת שליטה צפופה של הקהילה הסלולר, biophysical ו ביוכימיים במבחנה. כדי לפברק microvessels מהונדסים, תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVECs) הם perfused דרך הרשת microfluidic-מוטבע קולגן איפה שהם מייחסים יוצרים לומן פטנט ו האנדותל ומחוברות. כמו באיור 1 א-ג, גיאומטרית הכלי ניתן שתוכננה במיוחד כדי לענות על שאלות לגבי קצב זרימה, tort.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Microvessels המהונדס מהווה מודל במבחנה שבה מאפיינים פיסיולוגיים כגון גיאומטריה לומינל, כוחות הידרודינמית, ואינטראקציות רבות תאיות קיימים מתכונן. סוג של פלטפורמה זו היא בעלת עוצמה בכך שהיא מציעה את היכולת לבנות מודל ללמוד את ההתנהגות אנדותל במגוון הקשרים בהם התנאים תרבות חוץ גופית ניתן להתאים לזה של המיקרו-סביבה המדובר. לדוגמה, מנגנוני נהיגה תהליכים אנדותל, כגון אנגיוגנזה, ידועים להתרחש באופן שונה באיברים שונים וב מצבים פתולוגיים שונים, כגון בריאות ומחלה 44.<.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
המחברים מבקשים להודות לין ומייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע ורפואה רגנרטיבית וכן מתקן Nanofabrication וושינגטון באוניברסיטת וושינגטון. הם גם מכירים את התמיכה הכספית של המכון הלאומי לבריאות מעניקה DP2DK102258 (כדי YZ), והכשרה מעניקה T32EB001650 (כדי SSK ו MAR) ו T32HL007312 (כדי MAR).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>ייצור רקיקים | |||
| AutoGlow פלזמה מערכת | AutoGlow | ||
| Headway Spin Coater Headway Research | , Inc | PWM32 ספין קוטר | |
| ABM Contact Aligner ABM | |||
| Alpha Step Profilometer | Tencor | Alpha Step 200 | |
| SU-8 מפתח | Microchem | Y020100 | |
| SU-8 Resist | Microchem | SU-8 2000 | |
| 8 אינץ' פרוסת סיליקון | Wafer World Inc. | ||
| מחולל דפוס מיקרו שולחני | היידלברג מכשירים | μ PG 101 | לדור של מסיכת פוטו |
| פלטה חמה | VWR | 97042-646 | |
| איספרופיל אלכוהול | אוונטור חומרי ביצועים | 9088 | |
| צלחות פטרי (120 x 120 מ"מ, מרובעות) | סיגמא-אולדריץ' | Z617679 | |
| טריכלורו (3,3,3-טריפלואורופרופיל) סילאן | סיגמא-אולדריץ' | MKBG3805V | |
| פולידימתילסילוקסן (PDMS) בסיס אלסטומר וחומר ריפוי | Dow Corning | Sylgard 184 | מעורבב ב 10: 1 (w/w) |
| מייבש ואקום | Sigma-Aldrich | Z119024-1EA | |
| תנור | VWR | 9120976 | |
| ייצור ותרבית מכשיר <חזק> < / חזק > | |||
| פולי (מתיל מתקרילט) (PMMA) | מטפל | ||
| קורונה | מוצרי אלקטרו-טכניק בע"מ | BD-20 | לטיפול בפלזמה של מכשירי PMMA ותבניות PDMS |
| הלחמה | Weller | WTCPS | |
| נירוסטה מסבך ראש בורג מכונה מחורץ | McMaster-Carr | 91785A096 | |
| סיכות דיבל נירוסטה | McMaster-Carr | פינצטה 93600A060 | |
| Miltex | 24-572 | ניתן להשתמש בכל פינצטה דומה | |
| מרית (מיקרו כף) | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 62410-01 | |
| מברג | ניתן להשתמש בכל מברג עם ראש שטוח, | ||
| כיסויי זכוכית חיטוי (22 x 22 מ"מ) | פישר סיינטיפיק | 12-542B | |
| אקונומיקה | קלורוקס | 4460030966 | |
| צלחות פטרי (150 x 25 מ"מ) | צלחות פטרי 430599 | ||
| (100 x 20 מ"מ) | קורנינג | 2909 | |
| כותנה, חתוכה לחתיכות | חיטוי | ||
| (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | מדלל ל-1% במים בדרגת תרבית תאים |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G6257 | מדלל עד 0.1% במים |
| בדרגת תרבית תאיםסטרילי H2O | חיטוי DI H2O | ||
| קולגן מסוג I, מומס ב-0.1% חומצה | מבודד מזנבות חולדות כמתואר ב-Rajan et. al. 2006 (ref #37) | ||
| 1 מ"ל מזרק | BD | 309659 | |
| 10 מ"ל מזרק | BD | 309604 | |
| 15 מ"ל צינורות חרוטיים | קורנינג | 352097 | |
| צינורות חרוטיים 30 מ"ל | Corning | 352098 | |
| M199 10x Media | Life Technologies | 11825-015 | |
| 1 N NaOH (סטרילי) | Sigma-Aldrich | 415413 | לדלל ל-1 N במים בדרגת תרבית |
| תאים HUVECs | לונזה | ||
| CC-3124 | |||
| טריפסין | קורנינג | 25-052-CI | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | Thermofisher Scientific | 10082147 | |
| דקסטרן מ- Leuconostoc spp. (70 kDa) | Sigma-Aldrich | 31390 | |
| פוספט חוצץ מלח (PBS) | קורנינג | 21-031-CV | |
| המוציטומטר | Hausser Scientific Co. | 3200 | |
| טיפים לטעינת ג'ל | VWR | 37001-152 | |
| 18 G מחט מילוי קהה | BD | 305180 | |
| 20 גרם נירוסטה מחט חלוקה | מקמאסטר-קאר | 75165A123 | |
| טיגון 1/32 אינץ' ID, 3/32 אינץ' OD צינורות סיליקון | Cole-Parmer | EW-95702-00 | |
| 1/16 אינץ' צימוד צינור לצינור | McMaster-Carr | 5116K165 | |
| 90° מחברי מרפק, צינור לצינור | McMaster-Carr | 5121K901 | |
| צימוד נעילת לואר (נקבה, 1/16 אינץ' ID) | McMaster-Carr | 51525K211 | |
| מלקחיים מפלסטיק, עם אחיזת לסת | שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 72971 | |
| משאבת מזרק כפולה | מכשיר הרווארד | 70-4505 | |
| 5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול | פישר סיינטיפיק | 14-959-2A | |
| <חזק>ניתוח מכשירים | |||
| פורמלדהיד | סיגמא-אולדריץ' | F8775 | |
| סרום בקר אלבומין | סיגמא-אולדריץ' | A8806-5G | |
| טריטון X-100 | סיגמא-אולדריץ' | T-9284 | |
| ארנב אנטי-hCD31 | Abcam | ab32457 | 1:25 דילול עבודה |
| FITC מצומד אנטי-פון ווילברנד פקטור נוגדן | Abcam | ab8822 | 1:100 דילול עבודה |
| עיזים נגד ארנב 568 נוגדן משני | Thermofisher Scientific | A-11011 | 1:100 דילול עבודה |
| Hoescht | Thermofisher Scientific | H1399 | מושעה ב-DMSO |
| נתרן קקודילאט | סיגמא-אולדריץ' | C0250 | לייצור 0.2 מ' מאגר קקודילאט |
| אתנול | VWR International | BDH1164-4LP | |
| 40 kDa מצומד FITC דקסטרן | סיגמא-אולדריץ' | FD40S | |
| <ריאגנטים חזקים>נוספים לתרבית | |||
| CHIR-99021 | Selleck Chem | S2924 | מעכב GSK-3 מולקולה קטנה |
| רקומביננטי אנושי VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| רקומביננטי אנושי bFGF | Peprotech | AF-100-18B |
מקורות
- Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
- van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
