הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

Micropatterning והרכבת 3D microvessels

11.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54457

⸱

9 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, University of Washington, 2Center for Cardiovascular Biology, Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, University of Washington

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כתב יד זה מציג שיטת הזרקה להנדס microvessels כי לשחזר מאפיינים פיסיולוגיים של האנדותל. תהליך microfluidic המבוסס יוצר רשתות כלי דם 3D פטנט עם תנאי tailorable, כגון זרימה, רכב הסלולר, גיאומטריה, והדרגות ביוכימיים. תהליך ייצור ודוגמאות של יישומים פוטנציאליים מתוארים.

תקציר

בשנת פלטפורמות במבחנה ללמוד בתאי האנדותל וביולוגיה וסקולרית מוגבלים במידה רבה לתרבות תא האנדותל 2D, לזרום תאים עם פולימר או מצעים מלוחים וזכוכית, מבחני היווצרות צינור מבוסס הידרוג'ל. מבחנים אלו, תוך אינפורמטיבי, לא לשחזר גיאומטרית לומן, מטריקס ראויה, קרבה רבה תאית, אשר ממלאת תפקידים מרכזיים ויסות תפקוד כלי דם. כתב יד זה מתאר שיטת הזרקה לייצר כלי Engineered בקטרים ​​בסדר גודל של 100 מיקרומטר. Microvessels מיוצרים על ידי זריעת לתאי אנדותל ערוץ microfluidic מוטבע בתוך סוג יליד שאני קולגן הידרוג'ל. על ידי שילוב תאי parenchymal בתוך המטריצה ​​קולגן לפני לתעל היווצרות, microenvironments רקמות הספציפי יכול להיות מודל ולומד. מודולציות נוסף של הרכב נכסים ומדיה הידרודינמית לאפשר בקרה של תפקוד כלי הדם מורכב במיקרו-סביבה של הרצוי.פלטפורמה זו מאפשרת לחקר גיוס תא perivascular, אינטראקציות האנדותל דם, תגובת זרימה, ואינטראקציות-כלי דם לרקמות. microvessels המהונדס מציע את היכולת לבודד את השפעת מרכיבים בודדים של נישת כלי דם ולשלוט הכימיים שלה בדיוק, מכאניות, ואת תכונות ביולוגיות ללמוד ביולוגיה וסקולרית בשתי בריאות ומחלות.

מבוא

על נימי הדם הזעירים בכל איבר עוזר להגדיר את microenvironment רקמות, לשמור על הומאוסטזיס רקמות לווסת דלקת, חדירות, פקקת, ו פירוק פיברין 1,2. האנדותל כלי הדם, בפרט, הוא ממשק בין זרימת הדם ואת הרקמה שמסביב ועל כן היא משחקת תפקיד קריטי בויסות וסקולרית ותפקוד איברים בתגובה לגירויים כגון כוחות הידרודינמית במחזור ציטוקינים והורמונים 3 - 5. הבנת יחסי הגומלין המפורט בין האנדותל, הדם, ואת המיקרו-סביבת הרקמה הסובבת חשובה לחקר ביולוגיה של כלי דם ואת התקדמות מחלה. עם זאת, התקדמות בחקר אינטראקציות אלה התעכבה בשל מוגבלות כלים במבחנה שאינו לשחזר במבנה כלי דם vivo ולתפקד 6,7. כתוצאה מכך, השדה והקידום טיפולי הסתמכו בכבדות על יקר הזמן-רב במודלים של בעלי חיים כי לעיתים קרובות אינם מצליחים לתרגם להצלחה בבני אדם 8 - 10. בעוד מודלים in vivo הם לא יסולא בפז בחקר מנגנוני המחלה ופונקציות וסקולרית, הם מורכבים ולעיתים קרובות חסרי שליטה מדויקת של הסלולר, ביוכימיים הפרט, רמזים biophysical.

כלי דם בכל הגוף הוא בעל מבנה היררכי בוגר בשיתוף עם מיטות נימי מרחיבה, מתן זלוף אופטימיזציה תחבורה מזין 11 בו זמנית. בתחילה, טפסים בכלי דם כמו מקלעת פרימיטיבית אשר מארגנת מחדש לרשת מסועפת באופן היררכי במהלך ההתפתחות מוקדמת 12,13. למרות שרבים מן האותות מעורבים בתהליכים אלה מובנים היטב 14 - 16, הוא נשאר חמקמק איך כגון דפוסים של כלי דם נקבעו 15. בתורו, משחזר את התהליך הזה במבחנה להנדס רשתות כלי דם מאורגנות יש דבוריםn קשה. פלטפורמות רבות הקיימות במבחנת מודל בכלי דם, כגון שתי תרבויות תא האנדותל ממדיות, חסרות מאפיינים חשובים כגון קרבה רבה תאית, שלוש גיאומטריה לומינל ממדי, זרימה, ואת מטריקס. מבחני היווצרות צינור ב הידרוג 3D (קולגן או הפיברין) 17 - 19 או הפלישה מבחני 20,21 שימשו ללמוד את תפקוד האנדותל ב -3 D ויחסי הגומלין שלהם עם 17,22 או תא רקמה וסקולרית אחרים סוגי 23. עם זאת, התאסף לומן מבחנים אלה חסרים גומלין, זרימת המודינמי, ו זלוף המתאים. יתר על כן, הנטייה לרגרסיה וסקולרית מבחני היווצרות צינור אלה 24 מונעת תרבות לטווח ארוכה והתבגרות המגבילה את מידת מחקרים פונקציונליים שניתן לבצע. לפיכך, יש צורך המתפתח להנדס במבחנת פלטפורמות של רשתות כלי דם שיכול מודל כראוי endothelial מאפיינים ומסוגלים התרבות לטווח ארוך.

מגוון של טכניקות הנדסה וסקולרית צמח במשך השנים ליישומים רפואיים להחליף או כלי מושפע מעקפים בחולים עם מחלת כלי דם. כלי בקוטר גדול מחומרים סינתטיים כגון terephthalate פוליאתילן (PET), ו polytetrafluoroethylene (ePTFE) נחלו הצלחה טיפולית ניכר עם patency לטווח ארוך (patency 95% בממוצע על פני 5 שנים) 25. למרות שתלי סינתטי קטן בקוטר (<6 מ"מ) בדרך כלל להתמודד עם סיבוכים כגון היפרפלזיה intimal ואת thrombopoiesis 26 - 28, רקמות מהונדסות שתלי בקוטר קטן עשה עם חומר ביולוגי יש התקדמות משמעותית 29,30. למרות התקדמות מסוג זה, כלי מהונדסים על microscale נותרו אתגר. כדי לעצב את microvasculature כראוי, יש צורך ליצור דפוסי רשת מורכבים עם הסוףחוזק מכני ficient כדי לשמור patency ועם רכב מטריקס המאפשר כאחד חלחול מזין עבור תאי parenchymal שיפוץ הסלולר.

פרוטוקול זה מציג רשת כלי perfusable מלאכותית רומן מחקה יליד in vivo הגדרה עם microenvironment מתכונן לשליטה 31 - 34. השיטה המתוארת יוצרת microvessels Engineered בקטרים ​​בסדר גודל של 100 מיקרומטר. microvessels המהונדס מיוצר על ידי מרוסס תאי אנדותל דרך ערוץ microfluidic שמוטבע בתוך הסוג רך אני קולגן הידרוג'ל. מערכת זו יש את היכולת ליצור רשתות בדוגמת עם מבנה לומינל פתוח, לשכפל אינטראקציות רבות תאיות, לווסת רכב תאי מטריקס, ולהחיל כוחות המודינמי רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

Microfabrication 1. Patterned polydimethylsiloxane (PDMS) עם רשת עיצוב

  1. ייצור פרוסות סיליקון כדי ליצור תבנית שלילית של עיצוב הרשת
    1. צור דפוס רשת באמצעות כל תוכנת תכנון בעזרת מחשב (CAD). ודא כי הממד האלכסוני בין הכניסה והיציאה להתאים את המרחק בין מאגרי הכניסה ויציאה על מכשירי דיור שבשלבים הבאים (ראה 2.1.1).
      הערה: העיצוב של התבנית עצמה היא בהתאם מותאם אישית על מטרות המחקר הספציפי של המשתמש (ראה איור 1 עבור דפוסים לדוגמה).
    2. צור מסכה של דפוס רשת באמצעות הדפסה ברזולוציה גבוהה או להזמין photomask כרום מן הספק מסחרי. פרוטוקול מפורט יותר של תהליך photolithography זמין במקום אחר 35.
    3. לניקוי פרוס סיליקון 8 "במשך 5 דקות ב 100 W עם טיפול פלזמת חמצן.
    4. יוצקים מספיק photoresist השלילי (SU-82,100 עובד היטב) על גבי פרוסות סיליקון כך להתנגד צורות מנה עם קוטר של 2.5 ס"מ. באמצעות coater ספין, ספין את פרוסות סיליקון ב 500 סל"ד עם 100 סל"ד / sec הרמפה ולשמור למשך 10 שניות. ואז הרמפה עד 1,600 סל"ד עם 300 סל"ד / sec ולשמור למשך 30 שניות. הערה: מהירות רמפה צריך להיות מותאם עבור כל תנאי מעבדה להניב עובי להתנגד של 150 מיקרומטר.
    5. Soft-אופים את פרוסות סיליקון ב 65 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות, הרמפה עד 95 מעלות צלזיוס עם 360 ° C / שעה, ולשמור במשך 45 דקות. לאט להתקרר לטמפרטורת החדר על פלטה חשמלית. חותם את דפוס כלי על גבי פרוסות סיליקון מצופה על ידי חשיפה לאור UV 365 ננומטר תחת photomask כרום, עם חשיפה משולשת כי המלצת היצרן (350 mJ / 2 ס"מ על עובי SU-8 של כ -150 מיקרומטר).
      הערה: מאז SU-8 הם שלילי להתנגד, באזורים החשופים (הכל מלבד עיצוב הדפוס) יהפכו בלתי מסיסים היזם בשלב 1.1.7.
    6. Hard-לאפות את רקיק חשוף ב 65מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ו רמפה עד 95 מעלות צלזיוס עם 360 ° C / שעה ולשמור במשך 25 דקות, ולאחר מכן לאפשר לו להתקרר לאט RT על הפלטה החשמלית.
    7. לטבול את פרוסות סיליקון ב מפתח SU-8 עבור 10 - 15 דקות כדי לשטוף שלא נחשפו להתנגד, ואז לנקות עם אלכוהול איזופרופיל ויבש תחת זרם חנקן דחוס. בדוק את התבנית תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח את SU-8 להתנגד היא ערובה גם אל רקיק (לחפש פילינג רצויות ובועות).
    8. מדוד את עובי של תכונות התבנית באמצעות profilometer פי הוראות היצרן 36. במהלך רכישת מדידה, להימנע אזורים של המבנה, כי הם חיוניים לתפקוד רשת (כלומר, כניסה וצינורות לשקע) בתור profilometer קשר מבוסס עלולים לסכן את השלמות המבנית של התכונות בדוגמת על פרוסות סיליקון. לחלופין, להשתמש בשיטה ללא מגע (כלומר, אופטי profilometer) כדי למנוע בעיה זו לחלוטין.
  2. Generation של תבניות Patterned ושטוח ליציקת קולגן
    הערה: ידית silanes בתוך במנדף כימי.
    1. מניחים את פרוסות ייבוש עם 100 μl של trichloro (3,3,3-trifluoropropyl) silane במשך שעה 2. כדי silanize פני השטח.
    2. עבר רקיק silanized לתוך 120 x 120 מ"מ צלחת פטרי רבועה. יוצקים אלסטומר PDMS מעורב בגז דה סוכן ריפוי (10: 1 w / פרופורציות) על פרוסות סיליקון להשיג 4 - 6 מ"מ עובי. יוצקי PDMS נוסף לתוך צלחת מרובע נפרדת 120 x 120 מ"מ פטרי ליצור תבניות שטוחות ללא דפוסים. Cure על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
    3. מוציאים מהתנור ולאפשר PDMS כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. באמצעות אזמל בזהירות לחתוך ריבוע סביב SU-8 ולאט לאט לקלף עובש PDMS מן רקיק. חתוך קצוות עד 30 מ"מ x 30 מ"מ. לתבניות שטוחות, לחתוך נרפא PDMS ללא דפוס טבוע לחתיכות מרובעות על 40 מ"מ x 40 מ"מ.

התקנים והשיכון 2.

  1. fabricatיון של למעלה וחלקי שיכון תחתיים
    1. לפברק דיור כלי שיט באמצעות פולי (methacrylate מתיל) (PMMA). כדי לפברק, להורות על החלקים מחנות מכונה סטנדרטית עם מבוקרת מחשב נומרית יכול כרסום (CNC). ראה איור 1 עבור סכמטי של חתיכות העליונות ותחתונות.
    2. לעצב את פיסת דיור העליון (1D איור) לכלול מ"מ 20 מ"מ x 20 גם על החלק התחתון של המכשיר עם עומק של 1 מ"מ, שתי יציאות הזרקת קולגן (4 בקטרים ​​מ"מ) בחלק העליון של המכשיר ממוקם בפינות הכיכר היטב, שני מאגרי כניסה ויציאה עם 6 בקטרי מ"מ, וארבעה חורי ברגים (3 מ"מ קוטר) בארבע הפינות של המכשיר.
      הערה: חורים נוספים נקדחים בשולי היצירה למטרות טיפול.
    3. לעצב את פיסת דיור התחתון (איור 1E) לכלול חור מרובע באמצע (מידות 15 מ"מ x 15 מ"מ) עם הסובבים 25 מ"מ x 25 מ"ממדף עם עומק של 0.25 מ"מ. מקדחה 4 חורי ברגים עם 4-40 חוט. ודא את חורי ברגים בתחתית וחתיכות עליונות תהיינה ליישר יחד במהלך שלבי הרכבה בעתיד.

3. ייצור מכשיר כלי דם קטן

  1. הכנת חומרים
    1. לשטוף ו חיטוי שני סטים של פינצטה, מרית נירוסטה, מברג שטוח קטן, ברגי נירוסטה, וכמה סיכות מסמרת נירוסטה. עבור הייצור של הכלי, גם חיטוי תבניות PDMS micropatterned, PDMS ריבועים שטוחים, coverslips זכוכית (22 x 22 מ"מ), וחתיכות כותנה.
    2. לעקר את החלקים דיור PMMA באקונומיקה לפחות 1 שעה, ולאחר מכן לשטוף עם מים autoclaved בשכונה בתרבית רקמה פעמיים, ולאפשר לאוויר יבש במנות בתרבית רקמה סטרילית (150 מ"מ x 25 מ"מ).
  2. ציפוי - (GA PEI) Polyethyleneimine-glutaraldehyde סטרילי
    1. פנק בארות פנימיות של חתיכות PMMA יבשות מעוקרותעם פלזמה עבור כ 1 דקות. הוסף 1% Polyethyleneimine (PEI) על בארות פנימי (20 מ"מ מרובע היטב בחלק העליון ו -25 מ"מ מדף מרובע בחלק התחתון) של חתיכות PMMA במשך 10 דקות. לשטוף עם O סטרילי H 2 ולאפשר לו להתייבש בשכונה בתרבית רקמה.
      הערה: משך הזמן הנדרש לטיפול פלזמה הוא משתנה בהתאם למכשיר להשתמש - PEI צריך להפיץ מציין משטח הידרופילי בקלות. אם לא, טיפול פלזמה נוסף עשוי להיות נחוץ.
    2. החל 0.1 glutaraldehyde% (GA) על PEI מטופלים משטחים של חתיכות PMMA למשך 30 דקות. יש לשטוף פעמיים עם מים סטריליים ולאפשר לו להתייבש.
      הערה: שבשלבים הבאים, קולגן ידבק המשטח המצופה דרך crosslinking קולגן glutaraldehyde. זה עוזר לאבטח את הג'ל במקום בתוך המכשיר במהלך שלבי הרכבה בעתיד, ובמשך כל תקופת תרבות מכשיר.
  3. קולגן ג'ל הכנה
    1. לפברק כלי באמצעות 0.6% - 1% קולגןפתרונות. כדי להפוך 0.75% קולגן עבור ייצור כלי, לערבב סוג אני קולגן פתרון המניות (1.5% - מבודד עכברוש זנבות 37) עם נתרן הידרוקסידי (NaOH), 10x מוסף מדיה (M199), ומדיה תרבית תאים. שמור את כל הפתרונות על הקרח.
    2. לקבוע את עוצמת הקול של קולגן על ידי המשוואה הבאה, כאשר V ƒinal הוא הנפח הסופי של ג'ל הנדרש (בדרך כלל, 1 מיליליטר של קולגן לכל מכשיר מספיק), V קולגן המניות הוא הנפח של קולגן המניות צורכים, C מניות קולגן הוא הריכוז של קולגן המניות, קולגן ƒinal C הוא הריכוז הרצוי של הקולגן כלי השיט.
      figure-protocol-1
    3. השתמש מזרק 1 מ"ל להעביר נפח מתאים של קולגן המניות צינור חרוטי 30 מ"ל חדש. קבע את הכרכים של הנטרול NaOH (V NaOH), תוספת תקשורת M199 10x(V 10 X), ו תרבית תאים מדיה (V 1 X) כדלקמן ומערבבים בנפרד צינור חרוטי 15 מ"ל:
      figure-protocol-2
    4. מוסיפים את תערובת של חומרים כימיים נטרול (V 10 X, V NaOH, V 1 X) אל קולגן aliquoted, ולהשתמש מרית קטנה לערבב בעדינות את הפתרון עד ג'ל הומוגנית מתקבל. הימנע החדרת בועות על ידי ערבוב לאט ובעדינות.
    5. כדי לשלב תאים לתוך המטריצה ​​בריכוז הרצוי (למשל, 0.5 - 20 מיליון תאים / מ"ל), להוסיף את התאים הפתרון קולגן לאחר הוא מעורבב עם חומרים כימיים נטרול, את האש וממשיכים לטגן עד שהתאים מופצים בצורה הומוגנית.
    6. כאשר תאים מתווספים, להתאים את עוצמת הקול של תקשורת תרבית תאים כדי להכיל את הנפח הנוסף, כפי שנקבע על ידי המשוואה הבאה, שבה תא V <תת /> הוא נפח נדרש השעית התא, צפיפות תאי ƒinal C היא הצפיפות הרצויה של תאים בתוך הכלי, צפיפות תאי השעית C היא צפיפות תאי פתרון המניות.
      figure-protocol-3
  4. הזרקת קולגן - Piece למעלה
    1. מניחים את התבנית PDMS micropatterned בצלחת מ"מ 100 מ"מ x 20. פלזמה לנקות עובש PDMS דקות 1.
    2. יישר את פיסת PMMA העליונה על גבי עובש PDMS כך המאגרים המרובעים על העובש הם ישירות תחת מאגרי הכניסה ויציאה (ראה 1D איור - קווים מקווקווים). מניחים את סיכות מסמרת נירוסטה לתוך הכניסה והיציאה חורים המאגר על פיסת PMMA העליון כדי לשמור על גישה ברורה מהמאגרים לדפוס.
    3. השתמש מזרק 1 מ"ל כדי לחלץ ~ 0.5 - 0.6 מ"ל קולגן. ודא כי אין בועות להישאר בתוך המזרק.
    4. לחץ כלפי מטה lightly עם פינצטה על הדיור העליון לאפשר יצירת קשר סומק בין היצירה העליונה עובש PDMS. להזריק קולגן לאט דרך יציאת זריקה על פיסת PMMA העליונה. בדוק כי קולגן ממלא את תחום 20 מ"מ x 20 מ"מ מעל המרקם ואינו לדלוף החוצה.
    5. סגור את המנה ללא דוחף את הסיכות המסמרות ולאפשר ג'ל בתוך 37 ° C חממה עבור 30 דקות.
  5. הזרקת קולגן - Piece התחתית
    1. מניחים coverslip זכוכית 22 x 22 מ"מ במרכז היצירה התחתונה. השתמש מזרק 1 מ"ל לוותר ~ 0.25 מ"ל קולגן באופן שווה על גבי שקופיות הזכוכית. הורד בעדינות את PDMS מרובע שטוח על קולגן, הבטחת PDMS הוא שטוח נגד PMMA ואין בועות לכודים. אפשר הג'ל על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  6. עצרת תקן
    1. לאחר gelation, להוסיף מספיק PBS ברחבי חתיכת PDMS שטוח על פיסת התחתון להקיף את PDMS (כ 1 מ"ל). להשתמש בפינצטה כדי להסיר כל דוארקולגן xcess מסביב לקצוות, ולאט לאט לקלף את פיסת PDMS. הוסף עוד PBS על גבי קולגן לשמור על הידרציה.
    2. כדי להכין את הפיסה העליונה, להשתמש בפינצטה כדי להרים את פיסת PMMA העליונה והפוך אותה כך עובש PDMS הוא על העליונה. הוסף כמה טיפות של PBS לממשק, ולאחר מכן במהירות ובתקיפות להסיר את התבנית PDMS מן היצירה PMMA העליון.
    3. הוצא בעדינות סיכות מסמרת נירוסטה מהצד השני של דיור PMMA באמצעות זוג אחר של פינצטה. להוסיף עוד כמה טיפות של PBS על קולגן micropatterned. תהפוך את פיסת PMMA העליונה מעל כך קולגן יפנה כלפי מטה ומניח 4 ברגים לתוך החורים בפינה.
    4. בעדינות להניח את הפיסה העליונה על גבי הפיסה התחתונה, ליישר את הברגים עם החורים בפינה על הפיסה התחתונה. אל תאפשר את שני החלקים להחליק אחד נגד השני. השתמש במברג כדי להדק את הברגים באמצעות מגע עדין. אל תהדק.
    5. לשאוב PBS סביב משטחי PMMA ומקום pi קטןECE כותנה תחת קצה אחד של המכשיר. בעזרת פיפטה, להסיר כל PBS מהמאגרים ולהחליף עם תקשורת תרבית תאים. אפשר להתקן ג'ל יחד באינקובטור 37 ° C במשך שעה לפחות 1.
  7. תא מתזמן
    1. תאי אנדותל הטבור וריד האדם תרבות (HUVECs) בתקשורת צמיחה אנדותל ב 37 ° C (CO 2, O 2) כדי confluency 38. במידת האפשר, השתמש בין קטעים 4 ו -7.
    2. Trypsinize לתאי אנדותל על ידי שטיפת בקבוק תרבות עם 6 מ"ל של PBS ולאחר מכן להוסיף 2 מ"ל של טריפסין 0.05% ב 37 מעלות צלזיוס כדי לנתק את התאים. השאר את תאי טריפסין עד שרוב הידבקויות מוקד יש מנותקת והתאים מעוגלים כלפי מעלה (זה בדרך כלל לוקח בערך 2 - 3 דקות). עצור את התגובה טריפסין על ידי הוספת 4 מ"ל של התקשורת צמיחה אנדותל המכילה סרום שור העובר (FBS). לשטוף את הבקבוק עם זמן התקשורת השונה בכדי להבטיח את התאים מנותקים מהבקבוק ולאסוףצינור חרוטים.
    3. ספירת התאים באמצעות hemocytometer ו resuspend אותם בצפיפות של 10 מיליון תאים לכל מיליליטר. הסר את כל תרבית תאי התקשורת ממאגרי הכניסה ויציאה. בעזרת קצה טעינת ג'ל 200 μl, להוסיף 10 μl של השעית תא אל מרכז מאגר המפרצון. התאים צריכים להתחיל לזרום אל תוך הרשת מיד מעיל הרשת.
    4. הוסף 200 μl מדיה באופן שווה לבני שני המאגרים ולתת תאים לצרף ולהפיץ ברשת לפחות שעה 1.
  8. תרבות התקן
    1. תרבות המכשיר עם זרימת מונע הכבידה דרך הרשת על ידי הוספת 200 μl של התקשורת בתרבות התא אל המאגר כניסת 50 μl למאגר לשקע. באמצעות שיטה זו של התרבות, להחליף התקשורת כל 12 שעות כדי לשמור על כדאיות האנדותל.
      הערה: אם תנאי תרבות זרימה רציפה רצויים (כדי לשמור על מתח גזירה מתמיד, לאסוף מדיה במוצא, וכו ') א SYRמשאבת אינגה ניתן להשתמש במקום התרבות המונעת הכבידה.
    2. אפשר תאי אנדותל זורעים לפחות 24 השעות כדי לצרף ולייצב לפני יישום זרימה רציפה. לפני התקנת זרימה רציפה, לשמור על המכשירים עם תנאי זרימה מנע הכבידו.
      הערה: תנאי מדיה עבור זרימה שימושית להשתנות מתרבות מונעות הכבידו. התוספת של הרחבת פלזמה, כגון dextran, לתקשורת מייצבת את microvessels המהונדס ומונעת קריסה וסקולרית במהלך זלוף מתמשכת 39.
    3. כדי להפוך את התקשורת עבור התקנת זרימה רציפה, לפזר 3.5% Dextran (70 KDA) בתקשורת צמיחה אנדותל לתרבות כלי אופטימלית. באמצעות טכניקה סטרילית, למלא 10 מ"ל מזרקים עם תקשורת צמיחה אנדותל עם 3.5% Dextran.
    4. הכן צלחת תרבות סטרילי עבור זרימה ידי המסת חורים בקיר בצד של צלחת פטרי באמצעות מלחם.
    5. צרף 12 "צינורות סיליקון (1/32" ID) כדי צימוד מנעול Luer (נקבה, 1/16 "ID), ו- 1 /16 "ישר צינור אל צינור המחבר עם 1" קטע של צינורות בצד השני. הכנס "מחט קהה 20G (מנותקת רכזת המחט) אל הקצה החופשי של 1" 1/4 המגזר. כמו כן להכין 3 "קטע של צינור המחובר לצינור אל צינור 90 ° מרפק מחבר משותף (כדי להיות מצויד בכניסת הדיור). בשלבים הבאים, הצינורות כבר יהיו מושחל דרך הצלחת המוכנה ומצורפים 3 "קטע דרך המחט 20 G. צינורות Outlet צריכים לשקף צינורות יניקה, עם קצה חופשי במקום צימוד מנעול Luer. חיטוי בכל המגזרי לפני השימוש.
    6. מפרסם כניסת autoclaved ו לשקע צינורות דרך חורים בצלחת המוכנה. צרף 3 "מגזרים למחטים פנימיות 20 G. צרף את צימוד lock Luer מזרק התקשורת המלאה ו perfuse תקשורת דרך הצינורות באמצעות משאבת המזרק להגדיר בקצב זרימה גבוה. ודא שאין בועות בצינור או מחברים, כמו אלה יקשה זרימת לכלי השיט.
    7. הכנס את גonnector משותף לתוך כניסת דיור. הגדר את משאבת מזרק לשיעור הזרימה הרצויה ולהתחיל זלוף.
      הערה: זה יכול להיות מותאם בהתאם גיאומטרית כלי תנאי ניסוי מדגיש גזירה מיושמת. עבור ערוץ בקוטר 100 מיקרומטר, בקצב זרימה של 3 μl / min עובד היטב.
    8. אם תרצה, לאסוף perfusate עם צינורות לשקע מוכן מוכנס לתוך צינור 5 מ"ל פוליסטירן סטרילי סביב התחתון המכיל 500 μl של התקשורת.
      הערה: כמות קטנה של מדיה מתווספת צינור האיסוף כדי למנוע היווצרות בועה שיכולה לחסום זרימה.
    9. בהתאם קצב הזרימה, את המזרק ייתכן שיהיה צורך ומילא לאחר 24 עד 36 שעות. הדבר נעשה על ידי הסרת מחבר מכניסת הדיור, החלפת המזרק, ומאפשר תקשורת perfuse בקצב זרימה גבוהה במשך כמה דקות. רצף זה מבטיח כי בועות אינן הציגו את הצינורות. אפס את המשאבה לשיעור הזרימה הרצויה לתרבות, להוסיף את המחבר לתוך כניסת דיור,לחזור אל האינקובטור.

ניתוח Device 4.

  1. ניתוח חדיר
    1. השתמש 40 kDa FITC-dextran לדמיין את החדירות של כלי באתרו. מניח את דיור הכלי על מיקרוסקופ confocal ולהתמקד במישור הכלי. הוסף 5 מיקרומטר 40 kDa FITC-dextran אל מפרצון ותמונה בהגדלה 4X, 25 זמן חשיפה msec, ו 1 מסגרת לכל שניות למשך 10 דקות.
    2. לנתח הסדרה תמונה עם קוד ניתוח להעריך את החדירות של Dextran ברחבי בדפנות כלי הדם לתוך קולגן (מיקרומטר / sec) בהתבסס על מודל בהוצאת נג et. al. 31.
  2. ניתוח הדמיה Immunostaining & Confocal
    1. כדי לתקן כלי, perfuse עם פורמלדהיד 3.7% דרך הכניסה במשך 20 דקות ולשטוף ידי מרוססת PBS שלוש פעמים (20 דקות לכל לשטוף). בלוק נוגדן ספציפי מחייב עם 2% אלבומין בסרום שור (BSA) ו -0.5% Triton X-100 PErfused דרך הרשת עבור שעה 1. Perfuse פתרונות נוגדן ראשוני לילה ב 4 מעלות צלזיוס, לשטוף שלוש פעמים עם PBS. Perfuse פתרונות נוגדנים משני 1 - 2 שעות, ולשטוף שוב עם PBS באותו אופן.
    2. קח תמונות immunofluorescence של microvessels באתרו באמצעות מיקרוסקופ confocal עם z-צעד של 1 מיקרומטר. הדמיית את microvessels בהגדלה של 4X, 10X, או 20X.
      הערה: גדלה של 4X תספק מידע מבנה הרשת הגלובלי, בעוד תמונות מוגדלות 10X ו 20X תספקנה פרטים סלולריים כמו התארכות, היווצרות צומת, וכו.
    3. נתח את ערימות התמונה באמצעות ImageJ עם תחזיות Z (תמונה / ערימות / Z-פרויקט), חתכים (תמונה / ערימות / אורתוגונלית נוף), ו 3D שחזורים (תמונה / ערימות / 3D הפרויקט).
  3. הדמית מיקרוסקופ אלקטרוני סורק
    1. לקבלת ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים, לתקן באתרו על ידי מרוססת חצי כוח הסול של Karnovskyution (2% paraformaldehyde / 2.5% glutaraldehyde חיץ 0.2 M cacodylate) לילה. לפרק את כלי ובזהירות להפריד בין שני החלקים. חתוך בקצוות לטבול מלא בפתרון מקבע במשך כמה ימים.
    2. לטבול את החלק העליון העבה של כלי השיט ב glutaraldehyde 25% למשך 20 דקות ולשטוף שלוש פעמים עם PBS (2 דקות כל אחד). מייבשים ב שוטף אתנול סדרתי של 50%, 70%, 85% (2 דקות כל אחד) ושני שוטף באתנול 100% (5 דקות כל אחד).
    3. הכן את המדגם עבור ניתוח עם התייבשות נוספת על ידי ייבוש לנקודה קריטית בעקבות פרוטוקול של היצרן 40. גמגום מעיל הספינה עם-פלדיום זהב (7 ננומטר) ולנתח תחת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק עם מתח מאיץ של 5 קילו וולט, במקום גודל 3.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פלטפורמת הכלים המהונדסת יוצרת microvasculature הפונקציונלי מוטבע בתוך סוג קולגן טבעי שאני מטריקס ומאפשרת שליטה צפופה של הקהילה הסלולר, biophysical ו ביוכימיים במבחנה. כדי לפברק microvessels מהונדסים, תאי אנדותל וריד אדם הטבור (HUVECs) הם perfused דרך הרשת microfluidic-מוטבע קולגן איפה שהם מייחסים יוצרים לומן פטנט ו האנדותל ומחוברות. כמו באיור 1 א-ג, גיאומטרית הכלי ניתן שתוכננה במיוחד כדי לענות על שאלות לגבי קצב זרימה, tort...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Microvessels המהונדס מהווה מודל במבחנה שבה מאפיינים פיסיולוגיים כגון גיאומטריה לומינל, כוחות הידרודינמית, ואינטראקציות רבות תאיות קיימים מתכונן. סוג של פלטפורמה זו היא בעלת עוצמה בכך שהיא מציעה את היכולת לבנות מודל ללמוד את ההתנהגות אנדותל במגוון הקשרים בהם התנאים תרבות חוץ גופית ניתן להתאים לזה של המיקרו-סביבה המדובר. לדוגמה, מנגנוני נהיגה תהליכים אנדותל, כגון אנגיוגנזה, ידועים להתרחש באופן שונה באיברים שונים וב מצבים פתולוגיים שונים, כגון בריאות ומחלה 44.<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

המחברים מבקשים להודות לין ומייק גארווי הדמיה מעבדה במכון תאי גזע ורפואה רגנרטיבית וכן מתקן Nanofabrication וושינגטון באוניברסיטת וושינגטון. הם גם מכירים את התמיכה הכספית של המכון הלאומי לבריאות מעניקה DP2DK102258 (כדי YZ), והכשרה מעניקה T32EB001650 (כדי SSK ו MAR) ו T32HL007312 (כדי MAR).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>ייצור רקיקים
AutoGlow פלזמה מערכתAutoGlow
Headway Spin Coater Headway Research, Inc PWM32 ספין קוטר 
ABM Contact Aligner ABM
Alpha Step ProfilometerTencorAlpha Step 200
SU-8 מפתחMicrochemY020100
SU-8 ResistMicrochemSU-8 2000
8 אינץ' פרוסת סיליקוןWafer World Inc.
מחולל דפוס מיקרו שולחניהיידלברג מכשיריםμ PG 101לדור של מסיכת פוטו
פלטה חמהVWR97042-646
איספרופיל אלכוהולאוונטור חומרי ביצועים9088
צלחות פטרי (120 x 120 מ"מ, מרובעות)סיגמא-אולדריץ'Z617679
טריכלורו (3,3,3-טריפלואורופרופיל) סילאןסיגמא-אולדריץ'MKBG3805V
פולידימתילסילוקסן (PDMS) בסיס אלסטומר וחומר ריפויDow CorningSylgard 184מעורבב ב 10: 1 (w/w)
מייבש ואקוםSigma-AldrichZ119024-1EA
תנורVWR9120976
ייצור ותרבית מכשיר <חזק> < / חזק >
פולי (מתיל מתקרילט) (PMMA)מטפל
קורונהמוצרי אלקטרו-טכניק בע"מBD-20לטיפול בפלזמה של מכשירי PMMA ותבניות PDMS
הלחמהWeller WTCPS
נירוסטה מסבך ראש בורג מכונה מחורץMcMaster-Carr 91785A096
סיכות דיבל נירוסטהMcMaster-Carr פינצטה 93600A060
 Miltex24-572ניתן להשתמש בכל פינצטה דומה
מרית (מיקרו כף)שירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית62410-01
מברגניתן להשתמש בכל מברג עם ראש שטוח,
כיסויי זכוכית חיטוי (22 x 22 מ"מ)פישר סיינטיפיק12-542B
אקונומיקהקלורוקס4460030966
צלחות פטרי (150 x 25 מ"מ)צלחות פטרי 430599
(100 x 20 מ"מ)קורנינג2909
כותנה, חתוכה לחתיכותחיטוי
(PEI)Sigma-AldrichP3143מדלל ל-1% במים בדרגת תרבית תאים
GlutaraldehydeSigma-AldrichG6257מדלל עד 0.1% במים
בדרגת תרבית תאיםסטרילי H2Oחיטוי DI H2O
קולגן מסוג I, מומס ב-0.1% חומצהמבודד מזנבות חולדות כמתואר ב-Rajan et. al. 2006 (ref #37)
1 מ"ל מזרקBD309659
10 מ"ל מזרקBD309604
15 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג352097
צינורות חרוטיים 30 מ"לCorning352098
M199 10x Media Life Technologies11825-015
1 N NaOH (סטרילי)Sigma-Aldrich415413לדלל ל-1 N במים בדרגת תרבית
תאים HUVECsלונזה
CC-3124
טריפסיןקורנינג25-052-CI
סרום בקר עוברי (FBS)Thermofisher Scientific10082147
דקסטרן מ- Leuconostoc spp. (70  kDa)Sigma-Aldrich31390
פוספט חוצץ מלח (PBS)קורנינג21-031-CV
המוציטומטרHausser Scientific Co.3200
טיפים לטעינת ג'לVWR37001-152
18 G מחט מילוי קההBD 305180
20 גרם נירוסטה מחט חלוקהמקמאסטר-קאר75165A123
טיגון 1/32 אינץ' ID, 3/32 אינץ' OD צינורות סיליקוןCole-ParmerEW-95702-00
1/16 אינץ' צימוד צינור לצינורMcMaster-Carr5116K165
90° מחברי מרפק, צינור לצינורMcMaster-Carr5121K901
צימוד נעילת לואר (נקבה, 1/16 אינץ' ID)McMaster-Carr51525K211
מלקחיים מפלסטיק, עם אחיזת לסתשירותי מיקרוסקופיה אלקטרונית72971
משאבת מזרק כפולהמכשיר הרווארד70-4505
5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגולפישר סיינטיפיק14-959-2A
<חזק>ניתוח מכשירים
פורמלדהידסיגמא-אולדריץ'F8775
סרום בקר אלבומיןסיגמא-אולדריץ'A8806-5G
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ'T-9284
ארנב אנטי-hCD31Abcamab324571:25 דילול עבודה
FITC מצומד אנטי-פון ווילברנד פקטור נוגדןAbcamab88221:100 דילול עבודה
עיזים נגד ארנב 568 נוגדן משניThermofisher ScientificA-110111:100 דילול עבודה
HoeschtThermofisher ScientificH1399מושעה ב-DMSO
נתרן קקודילאט סיגמא-אולדריץ'C0250לייצור 0.2 מ' מאגר קקודילאט
אתנולVWR InternationalBDH1164-4LP
40 kDa מצומד FITC דקסטרןסיגמא-אולדריץ'FD40S 
<ריאגנטים חזקים>נוספים לתרבית 
CHIR-99021Selleck ChemS2924מעכב GSK-3 מולקולה קטנה
רקומביננטי אנושי VEGFPeprotech100-20
רקומביננטי אנושי bFGFPeprotechAF-100-18B
פרספקס מכשיר כף יד ברזל קורנינג של 1 ס"מ x 3 ס"מ פוליאתילנימין אצטית מצע גידול אנדותל לונזה

מקורות

  1. Rubanyi, G. M. The role of endothelium in cardiovascular homeostasis and diseases. J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, Suppl 4 37-44 (1993).
  2. van Hinsbergh, V. W. The endothelium: vascular control of haemostasis. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 95 (2), 198-201 (2001).
  3. Chiu, J. -J., Chien, S. Effects of Disturbed Flow on Vascular Endothelium: Pathophysiological Basis and Clinical Perspectives. Physiol. Rev. 91, 327-387 (2011).
  4. Qi, Y., Jiang, J., et al. PDGF-BB and TGB-b1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 1908-1913 (2011).
  5. Sozzani, S., Del Prete, A., Bonecchi, R., Locati, M. Chemokines as effector and target molecules in vascular biology. Cardiovasc. Res. 107 (3), 364-372 (2015).
  6. Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From 3D cell culture to organs-on-chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  7. Staton, C. a, Reed, M. W. R., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int. J. Exp. Pathol. 90, 195-221 (2009).
  8. Greek, R., Menache, A. Systematic Reviews of Animal Models: Methodology versus Epistemology. Int. J. Med. Sci. 10, 206-221 (2013).
  9. Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies. PLoS Med. van der Worp, H. B., Howells, D. W., et al. 7 (3), e1000245(2010).
  10. Leong, X. -F., Ng, C. -Y., Jaarin, K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis. Biomed Res. Int. 2015, 528757(2015).
  11. Pries, A. R., Secomb, T. W. Making Microvascular Networks Work: Angiogenesis, Remodeling, and Pruning. Physiology. 29, 446-455 (2014).
  12. D'Amore, P. Mechanisms Of Angiogenesis. Annu. Rev. Physiol. 49, 453-464 (1987).
  13. Geudens, I., Gerhardt, H. Coordinating cell behaviour during blood vessel formation. Development. 138, 4569-4583 (2011).
  14. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. The development of the vascular system: a historical overview. Methods Mol. Biol. 1214, 1-14 (2015).
  15. Ribatti, D., Nico, B., Crivellato, E. Morphological and molecular aspects of physiological vascular morphogenesis. Angiogenesis. 12 (2), 101-111 (2009).
  16. Bautch, V. L. VEGF-directed blood vessel patterning: From cells to organism. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2 (9), 1-12 (2012).
  17. Stratman, A. N., Schwindt, A. E., Malotte, K. M., Davis, G. E. Endothelial-derived PDGF-BB and HB-EGF coordinately regulate pericyte recruitment during vasculogenic tube assembly and stabilization. Blood. 116, 4720-4730 (2010).
  18. Bach, T. L., Barsigian, C., et al. VE-Cadherin mediates endothelial cell capillary tube formation in fibrin and collagen gels. Exp. Cell Res. 238 (238), 324-334 (1998).
  19. Kubow, K. E., Conrad, S. K., Horwitz, aR. Matrix microarchitecture and myosin II determine adhesion in 3D matrices. Curr. Biol. 23 (17), 1607-1619 (2013).
  20. Potapova, I. A., Gaudette, G. R., et al. Mesenchymal Stem Cells Support Migration, Extracellular Matrix Invasion, Proliferation, and Survival of Endothelial Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  21. Bayless, K. J., Davis, G. E. Sphingosine-1-phosphate markedly induces matrix metalloproteinase and integrin-dependent human endothelial cell invasion and lumen formation in three-dimensional collagen and fibrin matrices. Biochem. Biophys. Res. Commun. 312 (4), 903-913 (2003).
  22. Hellström, M., Gerhardt, H., et al. Lack of pericytes leads to endothelial hyperplasia and abnormal vascular morphogenesis. J. Cell Biol. 152 (3), 543-553 (2001).
  23. Tulloch, N. L., Muskheli, V., et al. Growth of Engineered Human Myocardium With Mechanical Loading and Vascular Coculture. Circ. Res. 109, 47-59 (2011).
  24. Davis, G. E., Saunders, W. B. Molecular balance of capillary tube formation versus regression in wound repair: role of matrix metalloproteinases and their inhibitors. J. Investig. dermatology Symp. 11 (1), 44-56 (2006).
  25. Kannan, R. Y., Salacinski, H. J., Butler, P. E., Hamilton, G., Seifalian, A. M. Current status of prosthetic bypass grafts: a review. J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. 74, 570-581 (2005).
  26. Nerem, R. M., Seliktar, D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 3 (1), 225-243 (2001).
  27. Melchiorri, A. J., Hibino, N., Fisher, J. P. Strategies and techniques to enhance the in situ endothelialization of small-diameter biodegradable polymeric vascular grafts. Tissue Eng. Part B. Rev. 19 (4), 292-307 (2013).
  28. Abbott, W. M., Callow, A., Moore, W., Rutherford, R., Veith, F., Weinberg, S. Evaluation and performance standards for arterial prostheses. J. Vasc. Surg. 17 (4), 746-756 (1993).
  29. Niklason, L. E. Functional Arteries Grown in Vitro. Science. 284 (5413), 489-493 (1999).
  30. Niklason, L., Counter, C. Blood vessels engineered from human cells - Authors' reply. Lancet. 366 (9489), 892-893 (2005).
  31. Zheng, Y., Chen, J., et al. In vitro microvessels for the study of angiogenesis and thrombosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 9342-9347 (2012).
  32. Zheng, Y., Chen, J., Lòpez, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat. Commun. 6, 7858(2015).
  33. Ligresti, G., Nagao, R. J., et al. A Novel Three-Dimensional Human Peritubular Microvascular System. J. Am. Soc. Nephrol. 27, (2015).
  34. Roberts, M. A., Tran, D., et al. Stromal cells in dense collagen promote cardiomyocyte and microvascular patterning in engineered human heart tissue. Tissue Eng. Part A. , (2016).
  35. Qin, D., Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft lithography for micro- and nanoscale patterning. Nat. Protoc. 5 (3), 491-502 (2010).
  36. Alpha-Step 200 Manual. Tencor Instruments. , (1989).
  37. Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat. Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2006).
  38. Baudin, B., Bruneel, A., Bosselut, N., Vaubourdolle, M. A protocol for isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells. Nat. Protoc. 2 (3), 481-485 (2007).
  39. Leung, A. D., Wong, K. H. K., Tien, J. Plasma expanders stabilize human microvessels in microfluidic scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. - Part A. 100 (7), 1815-1822 (2012).
  40. Tousimis SAMDRI-780 Critical Point Drying Apparatus. Tousimis Research Corporation. , (1987).
  41. Palpant, N. J., Pabon, L., et al. Inhibition of β-catenin signaling respecifies anterior-like endothelium into beating human cardiomyocytes. Development. 142 (18), 3198-3209 (2015).
  42. Gimbrone, M. a, Topper, J. N., Nagel, T., Anderson, K. R., Garcia-Cardena, G. Endothelial Dysfunction, Hemodynamic Forces, and Atherogenesis. Thromb. Haemost. 82, 722-726 (1999).
  43. Wu, M. H., Ustinova, E., Granger, H. J. Integrin binding to fibronectin and vitronectin maintains the barrier function of isolated porcine coronary venules. J. Physiol. 532 (3), 785-791 (2001).
  44. Ribatti, D., Nico, B., Vacca, A., Roncali, L., Dammacco, F. Endothelial cell heterogeneity and organ specificity. J. Hematother. Stem Cell Res. 11, 81-90 (2002).
  45. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philos. Ethics. Humanit. Med. 4, 2(2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מיקרוכלי דם מהונדסיםייצור מיקרוכלי דםהידרוג'ל קולגןזריעת תאי אנדותלהזרקה לעובניתהרכבת תבנית PDMSמודל ביולוגיה וסקולריתגיוס תאים פרי-וסקולרייםאינטראקציה בין דם לאנדותלמחקר תגובה לזרימה
Micropatterning והרכבת 3D microvessels
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.