אור בתיווך גיבוש דפוסים של הידרוג עבור יישומי תרבית תאים

סיכום

אנו מתארים תהליך רציף להיווצרות בתיווך אור ודפוס ביוכימי לאחר מכן של מטריצות הידרוג'ל סינתטיות ליישומי תרבית תאים תלת מימדיים. מודגמת בנייה ושינוי של הידרוג'לים עם כימיה של פוטו-קליק תואם ציטו. בנוסף, מוצגות טכניקות קלות לכימות והתבוננות בדפוסים וקביעת כדאיות התאים בתוך הידרוג'לים אלה.

תקציר

כימיות לחץ נחקרו לשימוש ביישומים biomaterials רבים, כולל אספקת סמים, הנדסת רקמות, ו תרבית תאים. בפרט, תגובות לחץ אור בתיווך, כגון תגובות תיאול פנטן photoinitiated ו תיאול-yne, מקנות שליטה spatiotemporal על תכונות החומר ולאפשר בתכנון מערכות עם רמה גבוהה של שליטה רכוש המשתמש מופנית. ייצור ושינוי של חומרים ביולוגיים מבוסס הידרוג'ל באמצעות הדיוק המוענק על ידי אור הצדדי המוצע על ידי כימיות תיאול-X photoclick אלה של עניין גובר, במיוחד עבור התרבות של תאים בתוך מוגדר היטב, microenvironments biomimetic. כאן אנו מתארים שיטות photoencapsulation של תאים photopatterning הבאות של רמזים ביוכימיים בתוך מטריצות הידרוג'ל שימוש באבני בניין צדדי ומודולרית polymerized ידי תגובה photoclick תיאול פנטן. באופן ספציפי, גישה מוצגת על שיתוףnstructing הידרוג מן allyloxycarbonyl (Alloc) crosslinks פפטיד -functionalized ו moieties פפטיד תליון פולי פונקציונליות-תיאול (אתילן גליקול) (PEG) כי לפלמר במהירות בנוכחות photoinitiator acylphosphinate ליתיום ומינונים cytocompatible של אולטרה סגול באורך גל ארוך (UV) אור. טכניקות קלילות לדמיין photopatterning ולכמת את הריכוז של פפטידים הוסיף מתוארים. בנוסף, שיטות מבוססות על תאי encapsulating, אדם בתאי גזע mesenchymal במיוחד, וקביעת הכדאיות ופעילותם. בעוד היווצרות דפוסים הראשונית של הידרוג תיאול-alloc מוצגים כאן, טכניקות אלה ניתן ליישם באופן רחב למספר אור אחרים ומערכות חומר הנגרמות בעקבות רדיקלים (למשל, תיאול-norbornene, תיאול-acrylate) כדי לייצר מצעים בדוגמת.

מבוא

לחץ כימיות משמשים יותר ויותר העיצוב של חומרים עבור יישומים ביו רבים, כולל אספקת סמים, הנדסת רקמות, ותרבות מבוקר בתאים, בשל reactivities cytocompatible סלקטיבי, יעיל, ולעיתים קרובות שלהם. ^1-3 כימיות Photoclick לנצל אור להפעיל או ליזום תגובות (למשל, אזיד-אלקין, ⁴ תיאול פנטן, ⁵ ו tetrazole-אלקן ⁶⁾ הם בעלי עניין מיוחד עבור היווצרות או שינוי של חומרים ביולוגיים. שיעורי ראפיד בתנאים קלים ובקרתי מתי והיכן הם מתרחשים עם אור להפוך התגובות האלה היטב מתאימות לשליטת משתמש מופנה נכסים ביולוגיים בנוכחות של תאים. ^7,8 בפרט, כימי photoclick תיאול פנטן שמשו כדי ליצור חומרים ביולוגיים מבוססי הידרוג'ל עם תכונות מכניות חזקים ^5,9 ו אנקפסולציה של מגוון רחב של סוגי תאים, כולל, אך לאt מוגבלת, אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSCs), פיברובלסטים, chondrocytes, ותאי לבלב, עם הבטחה לתרבות משלוח התא. ^10,11 בהמשך, כימיות אלה שימשו במשך דפוסים מרחביים של רמזים ביוכימיים לחקות היבטים מרכזיים של microenvironments תא יליד להקל אינטראקציות תא-מטריקס מתאימים, לרבות הדבקה, גזירה, ופלישה. ^3,12

לבניית הידרוג פנטן תיאול עם אור, פפטידים המכילים cysteines (תיאול) נפוץ מגיבים עם פולימרים פונקציונליות עם acrylates או norbornenes ( 'פנטן') פילמור מהירה, photoinitiated בתנאים cytocompatible. ¹³ הרחבת ארגז הכלים הזה, ביקשנו להקים שיטות ליצירת הידרוג'ל עם אובניים בניין צדדי ונגיש חדש צריכים לעבור טיפול סינטטי מינימאלי או היו זמינים מסחריים כלפי השימוש הנרחב שלהם כמו מטריצות תאיות סינטטיות.14 באופן ספציפי, פפטידים שונו עם allyloxycarbonyl (Alloc) המוגנים lysines: אחד עבור תליון, קבוצות מחייב integrin כדי לקדם את הידבקות התא [K (alloc) GWGRGDS = Pep1Alloc] או שניים crosslinks שאינם מתכלים או תא מתכלה [K ( alloc) RGKGRKGK (alloc) G או KK (alloc) GGPQGIWGQGK (alloc) K = Pep2Alloc, בהתאמה]. עם רצפים אלה, תנאי הוקמו עבור התגובה המהירה (1-5 דקות) עם ארבע זרועות פולי תיאול-שונה (אתילן גליקול) (PEG4SH) באמצעות מינונים cytocompatible של אור UV באורכי גל ארוכים יותר (10 mW / cm ² ב 365 ננומטר) הליתיום photoinitiator פניל-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP). הידרוג וכתוצאה מכך היו יציב בתנאי תרבית תאים במשך שבועות. כדי לאפשר מונחה תא שפלת שיפוץ, פפטיד enzymatically-cleavable התאגד בתוך crosslinks ג'ל (כלומר, GPQGIWGQ), ¹⁵ ו תא עיקרי מודל, אדם בתאי גזע mesenchymal (hMSCs), לא חדלנו קיימא לאחר אנקפסולציה דוריןתרבות גרם בתוך מטריצות אלה. יתר על כן, פפטידים כבר בדוגמת מרחבית בתוך חומרים אלה, ואת hMSCs להישאר קיימא מבחינה מטבולית פעילה בתנאים photopatterning. רצפי פפטיד תליון חלופיים, לא מוצגים כאן (למשל, IKVAV, YIGSR, GFOGER, וכו '), גם עשוי להיות משולב בתוך מטריצות לחקור אינטראקציות תא נוספות עם microenvironment שמסביב. תוצאות אלו מבטיחות עבור היישום של חומרים אלו מבוססי הידרוג'ל עבור תרבית תאים תלת ממדי (3D) ואספקה ​​ללמוד אינטראקציות התא-מטריקס ישירות עבור מגוון רחב של סוגי תאים.

בזאת, שיטות photoencapsulate תאים ובהמשך רמזים ביוכימיים photopattern בתוך מערכת הידרוג'ל המוצע מוצגים (איור 1). טכניקות להתבונן ולכמת photopatterns אלה גם הם הפגינו: כידוע, i) השימוש כמותי ואיכותי של assay של אלמן לקבוע את modification של thiols חינם בתוך מצעים בדוגמת ii) את השימוש האיכותי המשלים של פפטידים ניאון (AF488Pep1Alloc) להתבונן דפוסים אלה בשלושה ממדים. יתר על כן, מבחני לקבוע כדאיות (חי / מת הכדאיות / cytotoxicity מכתים) ופעילות מטבולית (MTS; 3- (4,5-dimethylthiazol-2-י.ל.) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-tetrazolium) מוצג כך שמשתמשים יוכלו לקבוע את cytocompatibility תנאי photoencapsulation ו photopatterning עבור שורות תאים שונות בתוך מטריצות הידרוג'ל. בעוד הפרוטוקול מודגם עבור מערכת הידרוג'ל photoclick מבוסס אור קלילה, הטכניקות עשויות להיות מיושמות על מערכות הידרוג'ל רבות אחרות ביוזמת קיצונית עבור photoencapsulation ו photopatterning בנוכחות של תאים.

פרוטוקול

1. הכנת חומרים עבור גיבוש הידרוג'ל

1. לסנתז תליון (Pep1Alloc, AF488Pep1Alloc) ופפטידים crosslinking (Pep2Alloc) בסינתזה פפטיד שלב מוצק רגיל (SPPS) טכניקות תיאול-פונקציונליות פולימר ידי הליך שלושה שלבים שינוי בקבוצה בסוף (PEG4SH). ^14,16 לחלופין, לרכוש PEG4SH (M _n ~ 20 kDA), Pep1Alloc, ו Pep2Alloc מסחרית.
2. לסנתז את photoinitiator (LAP) מהתגובה שני שלבים כמתואר להלן. ^14,17 בצע שלבים סינתזה (1.2.1-1.2.11) במנדף ולהשתמש זהירות בעת טיפול בכימיקלים (ללבוש כפפות מגן, ביגוד, משקפי) . LAP גם ניתן לרכוש מסחרי.
   1. כלי זכוכית כל יבש בתנור (> 2 שעות, 80 ° C).
   2. הוספת בר ומערבבים עד נאד ריק חד הצוואר מסביב לתחתית (100 מ"ל) ומכסים מחצה.
   3. אבטח את הבקבוק על גבי צלחת מגנטית ערבוב חם עם עמדת טבעת מהדק.
   4. אניnsert מחט (18 G) דרך מחצה ולהשאיר בקצה החיצוני פתוח לאטמוספרה. הכנס מחט שני מצורף קו גז אינרטי. פתח את קו גז אינרטי (למשל, ארגון או חנקן) ולטהר את הבקבוק למשך 10-15 דקות.
      הערה: המערכת תימחק באופן רציף בגז, ארגון או חנקן אינרטי, לאורך כל התגובה.
   5. העברת 1.5 גרם (~ 1.4 מ"ל) phenylphosphonite דימתיל (זהירות) אל הבקבוק, באמצעות מזרק עם מחט לחדור מבעד מחצה. הפעל את צלחת ומערבבים (במהירות בינונית) להיזהר כי התוכן לא להתיז על הצדדים של הבקבוק.
   6. להוסיף 1.6 גרם (~ 1.46 מ"ל) כלוריד 2,4,6-trimethylbenzoyl (זהירות) dropwise אל phenylphosphonite דימתיל המכיל הבקבוק, באמצעות מזרק עם מחט לנקב מחצה.
   7. מכסים את כלי התגובה ברדיד כדי להגן מפני אור ומערבבים במשך 18 שעות תחת ארגון או חנקן.
   8. למחרת, להעלות את הגובה של הבקבוק, למקם באמבט שמן על הבוחש,nd להנמיך את הבקבוק בזהירות לתוך אמבט שמנים. מחממים את האמבטיה ואת הבקבוק עד 50 ° C תוך שמירה בחישה מגנטית.
   9. ממיסים ליתיום ברומיד 3.05 גרם ב 50 מ"ל של 2-butanone. הרם את הבקבוק מתוך האמבטיה השמנה ומוסיף את פתרון ליתיום ברומיד אל הבקבוק מסביב לתחתית, הסרת מחץ בקצרה לשפוך לתוך הבקבוק.
      1. חותם את הבקבוק שוב עם מחצה (זהירות: מחצה עדיין תהיה מחט מובילים לקווי ארגון ומחט לפרוק), מנמיכים את הבקבוק בחזרה לתוך אמבט שמנים מחוממים, ולאפשר התגובה להמשיך במשך 10 דקות. משקע מוצק יהווה.
   10. אחרי 10 דקות, לכבות ארגון, להסיר את הבקבוק מאש, ולאפשר לתערובת לנוח במשך 4 שעות (מכוסה בנייר כסף כדי להגן מפני אור בתור יוזם רגיש לאור הופק. יש לשמור על מקום מחט אוורור.
   11. יוצקי מוצר אל משפך frit זכוכית או משפך מרופד בנייר מסנן מתאים. תסנין לשטוף 3 פעמים עם 50 מ"ל של 2-butanone לימיןסר כל ליתיום ברומיד unreacted.
   12. ניקוי (תחילה המעבדתיים ולאחר מכן ייבוש ואקום) ולנתח המוצר על ידי ¹ H NMR ברה ₂ O. פסגות אופייניות ב 1.8-1.9 (6H, ים), 2.1-2.2 (3H, ים), 6.7-6.8 (2H, ים), 7.3-7.4 (2H, מ '), 7.4-7.5 (1H, מ'), ו -7.5 -7.7 (2H, מ '). ^14,17
3. השתמש בגיליון האלקטרוני כדי לחשב את נפח וריכוז של כל פתרון המניות (PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, LAP) כי חייב להיות מוכן לבצע הידרוג'ל (טבלה 1). כדי להפוך ג'ל שאינה בדוגמת, להבטיח כי [SH] = [Alloc] כך שכל הקבוצות תגובתי נצרכות במהלך פילמור. אם photopatterning ג'לים מתוכנן, כולל סכום עודף של קבוצות פונקציונליות תיאול במהלך היווצרות קריש מבוסס על והרכב (למשל, 0.2-5 מ"מ, [SH]> [Alloc]) עבור תגובה מאוחרת עם Pep1Alloc.
   הערה: ג'לים צריך להכיל יותר מ -5 אחוזים במשקל (wt%) PEG4SH כדי להבטיח פילמור מהיר (תוך 5 דקות). עם זאת, WT התחתון% טווחים עשוי להיחקר אם היישום קורא הידרוג'ל עם moduli נמוכה יותר (למשל, <0.5 kPa); פילמור צריך להיבדק ומותאמים בהתאם למבנה הקומפוזיציה% wt נמוך אלה. באופן דומה, ריכוז Pep1Alloc עשוי להיות מותאם ליישומים שונים (למשל, 0.2-5 מ"מ) כפי שדווח בספרות עבור פפטידים פונקציונלי תיאול. ^18-21 ריכוז LAP מומלץ סביב 0.067% WT (2.2 מ"מ) או פחות, כפי שתואר, כמו ריכוזים גבוהים יותר יכולים להפחית כדאיות התא.
4. הכינו מלאי של פתרונות Pep1Alloc, Pep2Alloc, PEG4SH, ו LAP בתנאים סטריליים עבור תרבית תאים בהתבסס על חישובים בטבלה 1.
   1. לקבלת Pep1Alloc ו Pep2Alloc, בנפרד לשקול את המסה הכוללת של Pep1Alloc ו Pep2Alloc מן סינתזה פפטיד ו להתמוסס בופר פוספט סטרילית (PBS) המכיל 1% פניצילין / סטרפטומיצין (PS) ו -0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​fungizone (FZ). ריכוזים אופייניים של מגוון פתרונות מניות מוכן20-100 מ"ג / מ"ל ​​של הפפטיד. מערבבים המניות הללו כדי להשיג ג'לים עם moduli הסופי רלוונטי עבור יישומים רקמות רכות (מודולוס של יאנג ~ 0.5-5 kPa). ^22,23 Aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
   2. לקבלת PEG4SH, לשקול PEG4SH לתוך צינור microcentrifuge סטרילית מתמוססים PBS + PS + FZ. ריכוזים אופייניים של מגוון מניות פתרון זה 250-430 מ"ג / מ"ל ​​(20-30% PEG4SH לפי משקל).
   3. למחשבים, לשקול LAP לתוך צינור microcentrifuge סטרילית מתמוססים PBS + PS + FZ לריכוז סופי של 7.5 מ"ג / מ"ל.
      הערה: הכנת פתרונות מפתיעים של PEG4SH ו LAP מומלץ לכל אנקפסולציה או ניסוי ג'ל על מנת להבטיח פעמים פילמור עקביות.
5. הכן תבניות טיפ מזרק סטרילי לצורך גיבוש הידרוג.
   1. בזהירות לחתוך את טיפי הנחה של 1 מיליליטר מזרקים באמצעות סכין גילוח, ובהמשך להסיר את הבוכנות של קנה השערת המזרק.
   2. להטביע את פירי מזרק בוכנות באתנול 70% במשך 15 דק 'מקום ד במנדף תרבית תאים סטריליים להתייבש (30 דקות). אם טיפות עודפות של אתנול להישאר בתוך פיר מזרק, השתמש הבוכנה לדחוף אותם החוצה.
6. כן סטרילי זכוכית חלק תבניות לצורך הגיבוש הידרוג.
   1. משרי שקופיות זכוכית (בכפולות של 2) אטמי גומי (0.254 מ"מ עובי; 2 חתיכות קטנות משמשות shims, מלבן עם דסקיות מחורר, או צורת מסגרת מרובעת) באתנול 70% במשך 15 דקות, ומניחי מכסה מנוע תרבית תאים סטריליים לייבש.
   2. חצי מעייל של שקופיות המעוקרות עם ציפוי אנטי דבק לכל הכיוונים של היצרן כדי למנוע הידבקות של חלק העליון של ג'ל אל פני שטח השקופיות (למשל, אם יש 4 מגלשות, 2 מגלשות תהיינה מצופות אנטי דבק). אלה ישמשו בראש עובש שקופיות זכוכית.
7. כייל את המנורה לתבניות מזרק או זכוכית שקופית.
   הערה: בניסויים אלה, מנורת קשת כספית עם הרכבת מתאם מסנן חיצונית ו 365 מסנן חיצוני ננומטר הייתה בשימוש. מנורת אחריםים מייצרי עוצמות מתאימות של אור UV באורכי גל ארוך יותר ניתן להשתמש כפי שדווח על ידי אחר. ^24-27
   1. צרף עדשה collimating עד הסוף של ספר אור מלא נוזלי על מנת להבטיח יחסית אפילו עוצמת האור, מעבר לכל הדוגמאות. לפי הצורך, להתאים את המרחק של ספר אור מהדגימה (ים) כדי להשיג גודל נקודה כי יכסה דגימות של עניין.
   2. מניחים תבנית מזרק הקיצוץ בעל צינור microcentrifuge (להחזיק עובש מזרק במצב אנכי). החזק את רדיומטר בשיא קצה המזרק שבו הדגימות תתקיימנה ולהתאים תריס (% פתוח) כדי להשיג עוצמת אור של 10 mW / cm ² 365 ננומטר. רשום את ההגדרות המותאמות לשימוש מאוחר יותר.
   3. מניחים תבנית שקופיות זכוכית על גבי משטח סטרילי (למשל, החלק העליון של תיבת קצה פיפטה בתוך ארון בטיחות ביולוגית). החזק את גלאי הקרינה בשיא של עובש שקופיות זכוכית ולהתאים תריס (% פתוח) כדי להשיג עוצמת אור של 10 מ 'W / ² ס"מ על 365 ננומטר. רשום את ההגדרות המותאמות לשימוש מאוחר יותר.

2. כינונה הידרוג'ל ו Photopatterning

1. הכנת הידרוג ללא בדוגמת.
   הערה: בשלב זה בפרוטוקול, אם הידרוג הוא לשמש ביישומי תרבית תאים, כל הצעדים הבאים צריכות להתבצע בתנאים סטריליים בתוך ארון או בשכונת סטרילי.
   1. מערבבים פתרונות המניות של PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, ו- PBS + PS + FZ פי החישוב גיליון אלקטרוני (ראה טבלה 1 למשל). פיפטה הפתרון מבשר ג'ל וכתוצאה במרץ כדי להבטיח אפילו ערבוב של הפתרון.
   2. כן הידרוג עבה מעוצב טיפי מזרק ידי pipetting 10-20 μl של הפתרון המבשר ג'ל (PEG / פפ / LAP / PBS) לתוך קצה מזרק סטרילי, לחתוך. הפוך ג'ל יחיד לכל מזרק, כ 0.5-1.5 מ"מ מבוסס עבה על נפח קוטר מזרק.
      הערה: כרכים גדולים עשויים להיחקר על בסיסגודל ג'ל הרצוי שבו גבולות עליונים יכולים להתקיים על בסיס מגבלות diffusional עבור Pep1Alloc במהלך photopatterning ו / או חומרים מזינים / שפכים / מתאי כמוס במהלך תרבית תאים.
   3. כן הידרוג דק בתוך תבניות זכוכית שקופיות על ידי נחת אטם הגומי (0.254 מ"מ עובי) מסביב לקצוות של שקופית הזכוכית הלא המצופית. הפתרון ג'ל מבשר פיפטה 5-10 μl (יחידים או מרובים 5-10 ג'לים μl יכולה להיעשות על ידי pipetting אחד או יותר נקודות של פתרון לשקופית אחת) לשקופית זכוכית הלא מצופה במקום להחליק זכוכית מצופה-דבק אנטי על גבי הפתרון ג'ל (ג'לים גדול, עד לגודל של שקופיות הזכוכית, עשוי להתבצע בהתאם ליישום הסופי). אבטח את שקופיות זכוכית עם קליפים קלסר קטן עד שהוא יתייצב.
   4. מקום תבניות תחת המנורה ולהגדיר את עוצמת המנורה (למשל,% תריס פתוח) כדי להשיג 10 mW / cm ² על פני שטח ג'ל לתבניות קצה מזרק או תבניות זכוכית שקופיות המבוססים על מדידות בשלב 1.7.2 ו1.7.3, בהתאמה.
   5. החל אור עבור 1 עד 5 דקות, כדי לאפשר פילמור מלא של ג'ל. השתמש זמן פילמור קצר עבור ג'לים עם תוכן PEG4SH גבוה (% 8 WT או יותר, 1 דקות) וארוך יותר עבור ג'לים עם תוכן PEG4SH נמוך (% wt 5-8, 3-5 דקות) כדי לייצר הידרוג polymerized מלא עם moduli בתוך בטווח של רקמות רכות (0.5-5 kPa).
   6. ג'לי מקום מתבניות קצה מזרק לתוך צלחת 48-היטב שאינם מטופלי סטרילי, שקופיות זכוכית המקום לתוך צלחת סטרילית.
   7. יש לשטוף 3 x 15 דקות עם תרבית תאים בינוני או מאגר מתאים (למשל, PBS + PS + FZ, מאגר התגובה של האלמן) מבוססת על ניסויים מתוכננים, כפי שיפורט להלן.
2. הכנת הידרוג Patterned.
   1. מערבבים פתרונות המניות של PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, ו- PBS + PS + FZ פי החישוב גיליון אלקטרוני, עוזב thiols חינם (0.2-5 מ"מ) עבור תגובה מאוחרת עם Pep1Alloc. פיפטה הפתרון המבשר במרץ כדי להבטיח אפילו ערבוב של הפתרון.
   2. כן הידרוג באש ובמים כפי שהותוו ב 2.1.2 צעדי 2.1.6.
      הערה: אל תניח ג'לים במדיום הגידול לפני photopatterning. Thiols חינם עשוי להיות נצרך על ידי מינים של מדיום הגידול (למשל, דיסולפיד היווצרות עם חלבונים המכילים תיאול) ולא יאפשר דפוסים של ג'ל ללא מדרגות עיבוד נוספות (למשל, ירידה של אג"ח דיסולפיד).
   3. הכינו פתרונות של Pep1Alloc (ריכוז סופי ~ 3-20 מ"ג / מ"ל) ו LAP 2.2 מ"מ.
   4. מכסים ג'לים מראש יצרו עם פתרון Pep1Alloc / LAP דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
   5. הסרת עודפי פתרון Pep1Alloc / LAP. אם ג'לים עוצבו בתוך קצה המזרק, להשתמש במרית להעביר את הג'לים בזהירות מהצלחת 48-היטב שבו הם דוגרים לשקופית זכוכית סטרילית עבור דפוסים.
   6. מניחים photomask עם התבנית הרצויה ישירות על גבי ג'ל יצוק שקופיות syringe- וזכוכית. ודא כי החלק המודפס של המסכה נוגע ג'ל עבור פת אופטימליתנאמנות ארן (כלומר, מסכה צריכה קוראים נכון ולהיות אמולסיה בצד למטה). דגימות מקום תחת המנורה מקרינות דקות 1 עם הגדרות מנורה המשמשות שקופיות זכוכית (שלב 1.7.3).
   7. לאחר דפוסים, במקום מזרק יצוק ג'לים לתוך צלחת מטופלי תרבות סטרילי, 48-היטב שאינן רקמות, וזכוכית במקום שקופיות יצוקות לים, כי הם דבקו שקופיות הזכוכית לתוך צלחת סטרילית.
   8. יש לשטוף 3 x 15 דקות עם תרבית תאים בינוני או מאגר מתאים (למשל, PBS + PS + FZ, מאגר התגובה של האלמן) מבוסס על ניסויים מתוכננים.

חזותי 3. כימות Photopatterning

1. Assay של אלמן כדי לזהות ולכמת חינם thiols ב הידרוג Photopatterned.
   1. הכן חיץ התגובה של אלמן, הפתרון עובד ציסטאין, תקינה מגיב אלמן כמתואר להלן.
      1. עבור חיץ התגובה של אלמן, לפזר dibasic פוספט נתרן 2.4 גרם (Na ₂ HPO4) ו 74.4 מ"ג חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 200 מ"ל dIH ₂ O (0.1 M Na _{2 4} HPO, 1 mM EDTA). התאם את ה- pH 7.5-8 עם פתרונות של נתרן הידרוקסידי (NaOH) או חומצה זרחתית (H ₃ PO _4).
      2. לקבלת פתרון ציסטאין עבודה, לפזר ציסטאין 5.27 מ"ג ב 15 מ"ל חיץ התגובה (2 ציסטאין מ"מ).
      3. עבור התקני ציסטאין, לדלל פתרון ציסטאין עובד חיץ תגובה לריכוז סופי של 2, 1.5, 1.25, 1, 0.75, 0.5, 0.25, ו -0 ציסטאין מ"מ.
      4. לקבלת מגיב של אלמן, לפזר מגיב 4 מ"ג אלמן במאגר התגובה 1 מ"ל. Sonicate לפזר המגיב של האלמן לחלוטין.
   2. לכמת את ריכוז thiols חינם ג'ל עם assay של אלמן (איור 2).
      הערה: 'רזה' 5 הידרוג μl, יצוק בין שקופיות זכוכית, מתוארים ההליך שלהלן והמליץ ​​לאפשר דיפוזיה מהירה של t מגיב אלמןדרך עינית ג'ל (כלומר, התוכנית לוקחת מגיב זמן רב יותר לנטרל באמצעות ג'ל סמיך).
      1. לקבוע את עוצמת הקול ג'ל נפוחות ג'לים 'דק' 5 μl _(S V) בהתבסס על נפח נפיחות יחס, ש
         1. הפוך שלוש ג'לים 'עבה' 20 μl באמצעות תבניות מזרק. ג'לי מקום חיץ התגובה של האלמן למשך 24 שעות ולאחר מכן לשקול (מסת נפוחות שיווי משקל, M _S). Lyophilize הג'לים ובהמשך לשקול (מסה יבשה, _D M).
         2. באמצעות ההמונים נמדד עבור ג'ל סמיך, לחשב את נפח נפיחות יחס ²⁸ על ידי Q = 1 + ρ _פולימר / ρ _ממס (M _S / M _D -1) שבו _פולימר ρ = 1.07 גר '/ ס"מ ³ עבור PEG, ²⁹ ρ _ממס = 1.0 g / cm ³ עבור PBS / H ₂ O.
         3. לחשב את המסה היבשה התיאורטית של ג'ל לשמש Assay של האלמן (כאן, 5 μl 'הדק' ג'לים בדרך כלל uSED), על ידי סיכום המוני רכיבים בודדים PEG4SH, Pep1Alloc, ו Pep2Alloc (M _D = M + M _{PEG4SH Pep1Alloc} + M _Pep2Alloc). לדוגמה, ג'ל 5 μl המכיל 10% WT PEG4SH מכיל 0.000535 גרם PEG כ כפי שחושב על ידי M _PEG4SH = 0.005 ס"מ ³ x 1.07 גרם / ס"מ ³ x 0.10. ההמונים Pep1Alloc ו Pep2Alloc ניתן לחשב באופן דומה המבוסס על% wt בתמיסה (עיין בגיליון האלקטרוני עבור ערכים), בהנחה ρ ≈ 1.0 גר '/ ס"מ ³ עבור תמיסות מימיות אלה.
            הערה: ג'לים גם עשוי להיות מיובש ומשקלו במקום חישוב המסה היבשה התיאורטית. עם זאת, זה יכול להיות מאתגר למדוד את המסה היבשה עקבי של הג'לים μl הדקים, 5.
         4. בהתבסס על מסה יבשה חזה הערך ש נקבע מן ג'לים 'עבה', לחשב את המסה נפוח חזה M _S עבור ג'ל 'רזה' (משוואה בשלב 3.1.2.1.1). נניח כי ρ ≈ 1.0 גר '/ ס"מ ^{3, אז _S V ≈ M _S. השתמש _S V מחושב זה כדי לבצע assay של כמותי אלמן.
            הערה: השיטה הנ"ל מומלצת לקבוע V _של ג'לי נפוח כמו ג'לים 'הדק' 5 μl שקשה להעביר לשקילה.}
      2. טופס הידרוג דק דפוסים כמפורט בסעיף 2.2 (5 נפח μl). באופן ספציפי, לעשות ג'לים עם thiols חינם עודף 'דפוס' מחצית דגימות אלה עם Pep1Alloc באמצעות coverslip ברורה להציף לחשוף את הג'ל כולו עם אור (למשל, 6 ג'לים הכולל עם תיאול עודף: 3 ללא שינוי בלתי'patterned 'ו 3' בדוגמת ').
         הערה: עבור assay זה, 'בדוגמת' ג'לים המבול נחשף לאור ללא photomask. שיטה זו משמשת כדי לקבוע את המספר הכולל של thiols חינם נצרך במדגם ג'ל כולו וכדי להדגים כיצד ביעילות חינם thiols עשוי להיות שונה עם פפטיד. ממידע זה,מספר thiols חינם צורכים במהלך patterning עם photomask ניתן לחזות מבוסס על עובי ג'ל דפוס באזור (אזורים נחשף לאור).
      3. מקום 'בדוגמת' והלא-'patterned 'ג'לים בבארות של צלחת 48-היטב ולשטוף 3 x 15 דקות עם חיץ התגובה של אלמן כדי לאפשר דיפוזיה של מינים unreacted מתוך הג'ל ושיווי משקל נפיחות להתרחש.
      4. הוסף חוצץ התגובה של אלמן נוסף כדי הג'לים השטופים כך החיץ עם תגובה _של V שהיא מכפלה של 20 μl. לדוגמה, אם ה- _S V החזוי 15 μl, להוסיף למאגר התגובה 5 μl (20 μl), ואם _S V החזוי 30 μl, להוסיף 10 חיץ התגובה μl (40 μl).
      5. פיפטה בסטנדרטי ציסטאין לתוך בארות בודדות (לא המכיל ג'ל) של צלחת 96-גם בכפולות של 20 μl בהתאם לכמות בשימוש בשלב הקודם (כלומר, אם השלב הקודם היה V _S + b תגובה נוספתuffer = 40 μl, להוסיף 40 μl של תקן זה לבארות ריקות בודדות).
      6. לדלל מגיב אלמן חיץ התגובה (בכפולות של 180 התגובה μl חיץ + 3.6 μl מגיב אלמן; למשל, 183.6 במשך 20 μl או 367.2 μl 40 μl בשלב 3.1.2.5).
      7. הוסף מגיב מדולל האלמן כדי בארות המכילות תקני דגימות. במשך 20 דגימות μl, להוסיף 183.6 μl פתרון זה טוב. כמות כפולה זו של המגיב של מדולל האלמן עבור 40 דגימות μl (או בהיקף מבוססת בהתאם על גודל המדגם).
      8. דגירה או למקם על שייקר במשך שעה 1 ו 30 דקות (בטמפרטורת החדר) או עד שמתקבל צבע של הפתרון תואם את הצבע של ג'ל על ידי בדיקה ויזואלית כדי להבטיח דיפוזיה מספקת של dianion 2-ניטרו-5-thiobenzoate צהוב (TNB ^2-), אשר מופק על התגובה של מגיב של אלמן עם thiols חינם, מן הג'ל.
      9. קח 100 μl של פתרון ממדגמים ו- standards ומקום לתוך הבארות של צלחת 96-היטב.
      10. קראו ספיגה ב 405 ננומטר על קורא צלחת.
      11. כדי לעבד את הנתונים, העלילה עקומת סטנדרט (דגימות משלב 3.1.1.3) (ספיגת לעומת ריכוז) ולהשתלב פונקציה ליניארית. באמצעות הפונקציה ליניארית, הריכוז thiols חינם בפתרון 'המדולל ג'ל' (ג'ל + חיץ תגובה) ניתן לחשב על בסיס קריאות ספיגה. לבסוף, תוך לקיחה בחשבון את "דילול" עם חיץ התגובה, לקבוע את הריכוז תיאול חינם בג'לים ללא חיץ התגובה. (למשל, אם 15 ג'ל μl היה מדולל עם חיץ התגובה 5 μl, להכפיל 20/15).
   3. ויזואליזציה של photopatterns עם ריאגנט של אלמן (איור 3 א).
      1. משרים הידרוג דק עם הדפס Pep1Alloc במאגר התגובה של אלמן עבור שעה 1.
      2. הסר חוצץ תגובה עודפת ידי מנגב בעדינות מסביב לקצוות של הידרוג'ל עם רקמה.
      3. מגיב של פיפטה אלמן ישירות על פני השטח של הג'ל. מייד תמונה על מיקרוסקופ אור 10X או סטראו עם מצלמת צבע.
         הערה: ג'לים חייב להיות צלם מייד כי דפוסים להדמיה יתפוגגו בתוך 5 דקות כמו TNB הצהוב ^2- יון היוצר על ידי מחשוף של המגיב של האלמן על תגובה עם thiols באזור שאינו בדוגמת מפזרת ברחבי ג'ל. אזורים ללא בדוגמת להופיע קלוש צהוב לעין בלתי מזוינת; עבור רזולוציה טובה יותר דפוסים קטנים, הגדלה (למשל, שימוש במיקרוסקופ) נדרשת.
2. ויזואליזציה של Photopatterns עם פפטידים פלורסנט (איור 3B).
   1. להמחשה של דפוסים עם רזולוציה גבוהה יותר או בשלושה ממדים, photopattern Pep1Alloc AF488-שונה (או הפפטיד ניאון דומה) כדי הג'לים בשלב 2.2.
   2. תמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. מיקרוסקופ confocal ניתן להשתמש כאן לקחת z-stתמונות ack של הג'ל כך התבנית ניתן שנצפתה X, y-, ו-מטוסים z.
      הערה: עם קרינה, ג'לים חייב להיות מוגן מפני אור על מנת להבטיח את היציבות של fluorophore AF488 ואת הקרינה מרבית. ג'לים לא צריך להיות צלם מייד מאז הפפטיד הניאון הוא יציב למדי אם מוגן מפני אור (חנות במכל עטוף בנייר כסף על 4 מעלות צלזיוס).

Encapsulation Cell 4. הידרוג ו Photopatterning

1. איסוף הכנת תאים אנקפסולציה.
   1. לאחר תהליכי תרבית תאים יונקים סטרילי רגילים, trypsinize ולאסוף תאים בעלי עניין מצלחות. להרוות את טריפסין עם מדיום הגידול לאחר ניתוק מתרחשת (למשל, עבור בקבוק T-75, 5 מ"ל טריפסין, להרוות עם 5 מ"ל בינוני, לשטוף צלחת עם 5 מ"ל בינוני למשך 15 מ"ל סה"כ).
      הערה: פעמים trypsinization יכול להשתנות בין סוגי תאים אבל מתרחשות בדרך כלל בין 5 ל -15 דקות. detachmen תא החלופיסוכני t (למשל, Versene) ניתן להשתמש כדי לאסוף תאים אם ירצו בכך.
   2. ספירת תאים (מינימום של 100 או לכל פרוטוקול של היצרן) מן aliquots של השעיה התא trypsinized באמצעות hemocytometer או מכשיר ספירת תאים אחרים תוך צנטריפוגה ההשעיה תא בתפזורת (90-110 XG, 5 דק '). Re- להשעות תא גלולה לאחר צנטריפוגה ב בהיקף מינימלי של PBS או מדיום הגידול מחדש לספור אם ההשעיה תא trypsinized הראשונית לדלל מדי.
   3. Re- להשעות תאים בנפח מינימלי של PBS מנות aliquot עבור כל תנאי ג'ל לתוך צינורות microcentrifuge כך יהיו 5,000 תאים / μl כאשר מעורבב עם פתרון ג'ל (לפני פילמור).
      הערה: aliquots תא טיפוסי מכיל 300,000-500,000 תאים הם מספיק כדי להפוך 60-100 μl של השעיה ג'ל / תא אשר ניתן להשתמש בהם במשך 3-5 x 20 ג'לים μl עם 5,000 תאים / μl. צפיפות תא גבוהה או נמוכה ניתן להשתמש אנקפסולציה, בהתאם לכמות של תאי תאיםלעומת מגע תא-מטריקס הרצוי, בהתאמה, צריך להיקבע עבור כל יישום.
   4. צנטריפוגה התא / aliquots PBS (90-110 XG, 5 דק ').
   5. בזהירות לשאוב PBS מן התא גלולה בצינור microcentrifuge ממש לפני אנקפסולציה.
      הערה: אם תאים רגישים גזירת כוחות, צעד צנטריפוגה השני עשוי להתבטל על ידי ספירה (למשל, hemocytometer) ובהמשך aliquotting השעית תא trypsinized (טריפסין + מדיה + תאים) לחלקים דרושים עבור כל תנאי ג'ל. aliquots אלה centrifuged פעם (90-110 XG, 5 דק ') ואת טריפסין + מדיה הוא aspirated משם, משאיר גלולה התא אנקפסולציה.
2. תאים Encapsulating ב הידרוג בדוגמת ללא.
   1. מיד לאחר aspirating PBS, להשעות תאים pelleted ב PEG4SH, Pep2Alloc, Pep1Alloc, LAP, ו- PBS + PS + FZ כפי שחושב בגיליון האלקטרוני לריכוז סופי של 5,000 תאים / μl.
   2. עובש לפלמר הידרוג כמו described בצעדים 2.1.2 כדי 2.1.6.
      הערה: כאשר encapsulating תאים בתוך תבניות זכוכית שקופיות, יש להקפיד בעת ההסרה שלאחר פילמור השקופיות העליונה כדי למנוע מריח את הג'ל, אשר עלול לגרום מוות של תאים. כדי לעזור עם הסרת הג'ל מהתבנית, תבניות שקופיות יוטלו ב PBS סטרילי או מדיום הגידול לאחר פילמור להרטיב את אטם הידרוג'ל, מה שהופך אותו קל יותר להסיר את השקופית העליונה. שיטה למנוע גזירה זו לגמרי היא באמצעות שימוש בתבניות מזרק.
   3. ג'לים לשטוף 3 x 10 דקות במדיום גידול להסיר מיני unreacted ו LAP העודף.
   4. דגירה ג'לים במדיום הגידול על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד לנקודת זמן מסוימת הרצוי לניתוח נוסף. לחדש בינונית כל 48 שעות או כפי שנקבע עבור היישום (לדוגמה, מרווח האכלה אופייני לסוג תא מסוים ובינוניים).
3. Encapsulating תאים Photopatterning ב נוכחות של תאים.
   1. מיד לאחר aspirating PBS,להשעות תאים pelleted ב PEG4SH, Pep2Alloc, LAP, ו- PBS + PS + FZ כפי שחושב בגיליון האלקטרוני לריכוז סופי של 5,000 תאים / μl. השאר ריכוז מתאים של thiols חינם (למשל, 2 מ"מ) עבור תגובה מאוחרת עם Pep1Alloc.
   2. עובש, לפלמר, ו הידרוג דפוס כמתואר בשלבים 2.2.2 ל 2.2.8.
   3. ג'לים לשטוף 3 x 10 דקות במדיום הגידול לאחר patterning להסיר מינים unreacted ו LAP עודף.
   4. דגירה ג'לים במדיום הגידול על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד לנקודת זמן מסוימת הרצוי לניתוח נוסף. לחדש בינוני כל 48 שעות או כפי שנקבע עבור היישום.

5. קביעת הפעילות הכדאית מטבוליות של תאי Encapsulated

1. בצע Live / Dead Cytotoxicity Assay לקביעת כדאיות התא Encapsulated (איור 4 א).
   1. הסר בינוני צמיחה מן ג'ל ולשטוף 3 x 15 דקות עם PBS כדי לאפשר דיפוזיה של המדיום gאלס.
   2. פתרונות assay cytotoxicity חיים / מת הפשרה (ethidium homodimer-1 ו- AM calcein).
   3. הוסף 2 μl של homodimer-1 ethidium 2 מ"מ ו 0.5 μl של פתרונות AM 4 מ"מ calcein עד 1 מ"ל סטרילי PBS. וורטקס כדי להבטיח ערבוב מלא.
   4. הוספת 300 פתרון מכתים μl לכל ג'ל עובש מזרק צלחות 48-היטב, או מספיק כדי לכסות את פני השטח של ג'ל בשקופית זכוכית בצלחת סטרילית, דגירה במשך 45 דקות.
   5. הסר פתרון מכתים עודף ולשטוף להסיר עודפי צבע מן ג'לים (3 x 15 דקות עם PBS).
   6. תמונה על מיקרוסקופ confocal (תמונות Z- מחסנית) או על מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית עם יכולת Z- מחסנית 10X ו 488/525 ננומטר Ex / Em. לכמת את מספר תאי קיימא על ידי הקרנת Z- הערימות וספירת המספר (ירוק בכל גוף תא) חיים ומתים (גרעינים אדומים) תאים עם תוכנת הדמיה.
2. בצע assay פעילות מטבולית לקבוע פעילות התא-אנקפסולציה פוסט (figuמחדש 4B).
   1. 24 שעות לפני assay, תאים כמוסים להאכיל עם מדיום גידול טרי.
      הערה: הוסף בינוני עד כמה בארות נוספות (לא מכיל ג'ל או ג'ל ללא תאים) כשליטה (קריאות ברקע).
   2. בנקודת הזמן של עניין, להפשיר פתרון מגיב MTS.
      הערה: כדי לקבוע את פעילות חילוף חומרים לאורך זמן, נקודה ראשונית זמן (12-24 שעות שלאחר אנקפסולציה) מומלצת כהפניה להשוואה לנקודות מאוחר יותר זמן.
   3. הוסף מגיב MTS היטב כל (20 μl לכל 100 מדיום הגידול μl).
   4. דגירה דגימות עבור 1-4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2, לפי הוראות היצרן.
      הערה: פעמי דגירה צריכות להספיק עבור תאים להפחית MTS ולאפשר דיפוזיה של מוצר formazan מתוך הג'ל. כתוצאה מכך, ג'לים עבה כגון ג'לים קצה מזרק עשוי לדרוש פעמי דגירה ארוכות יותר (~ 4 שעות) להפחתת ודיפוזיה מספיק MTS.
   5. פיפטה 100 μl מופחת MTS / בינונילתוך בארות נקיות של ספיגת צלחת ולהקליט 96-גם ב 490 ננומטר על קורא צלחת.
   6. הפחת את ספיגת רקע בארות ללא תאים ערכי ספיגת מדגם ליצור ערכים ספיגת baselined.

תוצאות

ההגדרה וקביעת נוהל photoencapsulate תאים ולאחר מכן ג'לים photopattern המכיל תאים כמוס מתואר באיור 1, ודוגמה להכנת פתרונות המניות לגבש ג'ל 10% WT מסופק בלוח 1. שימוש בטבלה 1, בסך של מונומרים (PEG4SH , Pep2Alloc, ± Pep1Alloc) ו photoinitiator (LAP) נדרש לפלמר הידרוג מחושבת. בהתבסס על חישובים אלו, פתרונות המניות של PEG4SH, Pep1Alloc, Pep2Alloc, ו LAP ערוכים מעורבב עם ובלי Pep1Alloc להרכיב photopatterning ג'לים, בהתאמה (איור 1 א). כתוצאה מכך, התאים נאספים צלחות, נספרות centrifuged בכמויות מתאימות אנקפסולציה (איור 1B). גלולת התא מחדש תלויה פתרון יוצרי ג'ל (פפטיד / פולימר / LAP PBS), ותא / תערובות מונומר מועברות mol זכוכית או המזרקds. תאים כמוסים בתוך הידרוג על פי בקשה של אור (1-5 דקות של 10 mW / cm ² 365 ננומטר) (תרשים 1C). לקבלת photopatterning (איור 1D), ג'לים ספוגה Pep1Alloc ו LAP למשך 30 דקות עד 1 שעה ו -30 דקות, מה שמאפשר דיפוזיה של פפטיד ויוזם לתוך המטריצה polymerized. ג'ל פפטיד-לאדן אלה מכוסים photomasks עם דפוסי הרצוי נחשף למנה שנייה של אור (1 דקות) כדי להטות את הפפטידים אל thiols חינם בתוך המטריצה. רצועות תליון מקושרות קוולנטית רק הג'ל באזורים נחשפו לאור, בהנחיית אינטראקציות התא-מטריקס מתאימים מחקו תכונות מכאניות ביוכימיים מפתח של microenvironment תא הילידים כלפי חיטוט על תפקוד תא גורל במבחנה.

assay של האלמן מספק שיטה קלילה וזולה לכמת שינוי ג'ל התאגדות פפטיד בתוך photopatteמצעי rned. בדוגמת וג'ל הלא בדוגמת (כלומר, ג'לים עם או ללא שינוי פפטיד) הם מושרים-פילמור פוסט חיץ התגובה של אלמן. בא, סטנדרטי ציסטאין הג'לים טבולים חיץ ממוקמים צלחות 48-היטב וטופחו עם ריאגנט של האלמן (איור 2 א, מהשמאל). לאחר 1 שעה ו -30 דקות, aliquots של דגימות ממוקמים בארות בודדות של צלחת 96-היטב, ואת הספיגה נרשמה ב 405 ננומטר. עקומת כיול (איור 2 א, מימין) מן הסטנדרטים ציסטאין הוא זמם (ספיגת לעומת ריכוז, התאמה ליניארית), ואת כמות thiols חינם ג'ל עשוי להיקבע על בסיס גורם לדילול שלהם. ריכוזים תיאול חינם אלה תנאי פילמור photopatterning שונים של ג'ל 10% WT מוצגים באיור 2B. ג'לים polymerized עבור 1 או 5 דקות בלי Pep1Alloc (הסורגים הכחולים, אני = 1 דקות ו- II = 5 דקות) יש ריכוזים תיאול חינם דומה מבחינה סטטיסטית, המציין tכובע תגובה מהירה מתרחשת gelation תושלם בתוך דקות 1 (שני זנב מבחן t, p> 0.05). לפיכך, חשיפה נוספת לאור (2-5 דקות) לא לגרום המרה נוספת של קבוצות פונקציונליות. ג'לים polymerized דקות 1 ללא Pep1Alloc היו ספוגים Pep1Alloc (3 מ"ג / מ"ל) ו LAP (2.2 מ"מ) במשך 30 ו -90 דקות (הפסים הירוקים, II = 30 דקות ו- IV = 90 דקות) נחשף למנה שנייה של אור 1 דקות. הקיטון thiols חינם (60-80% ביחס למצב 1 דק ') מצביע על שינוי יעיל של ג'ל עם רמזים תליון בתנאים אלה. אם שינוי גבוה הוא רצוי, ריכוזיים מוגבר פתרון Pep1Alloc יכול לשמש נגישות של Pep1Alloc כדי thiols חופשית יותר לדלל פתרונות פפטיד עלולים להגביל מרה; למשל, מצאנו כי בריכוזים של עד 20 מ"ג / מ"ל ​​Pep1Alloc לייצר> המרה 90% thiols חינם.

באופן ייחודי, דפוסי פפטידים מתווספים הידרוג'ל רשאילהיות צלם במהירות עם ריאגנט של האלמן (איור 3 א, מתחת לגיל 5 דקות). עם זאת, ויזואליזציה של התבנית הוא אבד לאורך זמן (יותר מ -5 דקות) בשל דיפוזיה של dianion TNB ^2- הצהוב דרך ג'ל. כדי לשפר את רזולוציית הדמיה ולבחון דפוסי בשלושה ממדים (X, y-, ו- Z-מטוסים), ובנוכחות של תאים, בנוסף פפטיד ניאון (AF488Pep1Alloc) עשוי להיות מנוצל. באיור 3 ב X, y- ו- Z-תחזיות של ערימות התמונה נלקחה עם מיקרוסקופ confocal נראים לעין, הוכחת דפוס ברזולוציה (בסולם מיקרומטר).

כ (94 ± 2)% ו (94 ± 1)% של hMSCs הכמוסה בתוך ג'ל מתכלה (Pep2Alloc = GPQG ↓ WGQ) להישאר קיימא (גופי תא ירוקים) 1 ו -6 ימים לאחר אנקפסולציה, בהתאמה, עם כמה תאים מתים (גרעינים אדומים ציין) (איור 4 א). יתר על כן, hMSC מתפשטת הוא ציין ב -6 ימים לאחר אנקפסולציה ( רונג> איור 4 א, הבלעה), המציין כי תאים יכולים לשפץ וליצור אינטראקציה עם אלה מטריצות MMP-מתכלה שונים עם rgds מחייב integrin. מבחני פעילות מטבולית שבוצעו על תאים כמוסים ג'ל שאינו מתכלה (Pep2Alloc = RGKGRK) 1 ו -3 ימים לאחר אנקפסולציה (איור 4 ב) לספק מדד שני של כדאיויות תא להוכיח כי תאים נשארים פעילים על תנאי photoencapsulation ו photopatterning השונים נבדקים עם assay של האלמן (איור 2 ב). בפרט, אין הבדל משמעותי בפעילות המטבולית בין 30 דקות ו -90 דקות incubations עם Pep1Alloc + LAP (תנאי III ו- IV) ואת אנקפסולציה הראשונית (אני התנאים ו- II), המציין כי ההליך הוא מתאים עבור יישומים של photopatterning ב נוכחות של תאים במארז (שני זנב מבחן t, p> 0.05).

2fig1.jpg "/>
איור 1:. ההתקנה עבור encapsulating תאים בתוך הידרוג ובהמשך photopatterning עם קיו ביוכימיים (א) מלאי של פתרונות macromers ו photoinitiator ערוכים ומעורבים (PEG4SH = עמוד השדרה, Pep2Alloc = crosslink, Pep1Alloc = תליון מחצית דבק (rgds), LAP = photoinitiator ). (ב) תאים נאספים אנקפסולציה. (ג) תאים מעורבבים עם פתרונות macromer בלי או עם פפטידים קושרי integrin (PEG4SH / Pep2Alloc / LAP או PEG4SH / Pep2Alloc / Pep1Alloc / LAP, בהתאמה) והם במארז בחשיפה לאור. ג'לי (D) המכיל קבוצות תיאול עודפות במהלך היווצרות קריש (כאן, PEG4SH / Pep2Alloc / LAP, הקים עם 2 מ"מ תיאול העודף) ניתן בדוגמת עם רמזים ביוכימיים ידי התוספת הבאה של פפטידים פונקציונליים עם קבוצת alloc יחידה (Pep1Alloc, למשל, rgds, IKVAV, וכו ') כדי לקדם את הידבקות התאבתוך אזורים ספציפיים של הג'ל. הנה, דפוסים של ג'ל עם rgds fluorescently שכותרתו מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2:. התקנת assay של כמותי האלמן ותוצאות להעריך שינוי של הידרוג בדוגמת (א) ג'לי וסטנדרטי ציסטאין מודגרת צלחות 48-היטב עם ריאגנט של האלמן. עקומת סטנדרט לינארית זממה כדי לקבוע ריכוז ציסטאין בדגימות ג'ל. (ב) thiols חינם עודף משולבים בתוך הידרוג במהלך היווצרות קריש ותאכל על דפוסים עם פפטיד-alloc תליון (אני = פילמור דק 1; השנייה = פילמור דק '5; III = הדגירה 30 דקות עם Pep1Alloc; IV = wi הדגירה 90 דקות Pep1Alloc ה; הן III ו- IV polymerized עם הדפס אור 1 דקות). הנתונים המוצגים להמחיש את הממוצע (n = 3) במוטות השגיאה מראה את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3:. Assay ותמונות ניאון של אלמן לדמיין הידרוג photopatterned (א) מגיב אלמן ניתן להשתמש כדי לזהות דפוסים במהירות (קווי) ב x ו- y-מטוסים (צהוב = באזור unpatterned, בר סולם = 1 מ"מ). (ב) פפטידים פלורסנט ניתן להשתמש להתבונן דפוסי ה- X, y-, ו- Z-מטוסים (ירוק = אזור בדוגמת; 200 מיקרומטר סרגל קנה מידה; 10X אובייקטיבי מי טבילה; Ex / Em 488/525 ננומטר).large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

. איור 4: כדאיות ואת הפעילות המטבולית של תאים בתוך הידרוג photopatterned הלא מתכלה (א) דוגמא confocal Z- מחסנית (Z- הקרנה; 10X אובייקטיבי מי טבילה) של קיימא (ירוק; Ex / Em 488/525 ננומטר) ומת hMSCs (אדום; Ex / Em 543/580 ננומטר) כמוס בתוך הידרוג 24 hr-אנקפסולציה פוסט (סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר). תאים להתפשט בתוך הידרוג אלה 6 ימים לאחר אנקפסולציה (תמונת השיבוץ, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). (ב) תאים הם מטבולית פעילה 1 ו -3 ימים (כהות וקורות אור, בהתאמה) פוסט-אנקפסולציה עבור פילמור השונה (אני = 1 דקות פילמור; שנייה = 5 פילמור דק ') ותנאי דפוסים (III = 30 דקות הדגרה עם Pep1Alloc ; IV = 90 דקות incubation עם Pep1Alloc; הן polymerized עם הדפס אור 1 דקות). הנתונים המוצגים להמחיש את הממוצע (n = 3) במוטות השגיאה מראה את סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

טבלת 1: התקנת דוגמא לחישוב כרכים של פתרונות מניות להכנת הידרוג תאים בתוך הגיליון האלקטרוני מודגשים כחולים עולים פרמטרים המוגדר על ידי משתמש;. הכמויות האחרות מחושבות על בסיס ההגדרות אלה. הכרכים הסופיים לכל פתרון מניות לבצע ג'ל מודגש כתומים. התאים הלבנים מכילים נוסחאות המשמשות לחישוב כרכים הסופי מבוסס על פרמטרים המוגדרים על ידי המשתמש. שים לב לריכוז של LAP 2.2 מ"מ שווה 0.067% WT.

דיון

הנוהל המובא כאן מדגים טכניקות photoencapsulate תאים בתוך הידרוג נוצר על ידי הכימיה לחץ תיאול פנטן ובהמשך photopattern בג'לים עם רמזים ביוכימיים. השימוש באור בתחילה להקים הידרוג מאפשר ערבוב הומוגני השעיה של התאים בתוך פתרון הפולימר לפני פילמור. פילמור ראפיד "מנעולים" ג'ל בצורת העובש המוגדר מתמצת מושעת תאים בתוך הרשת הידרוג'ל. ג'לים גם יכול להיות יצוק לתוך צורות שונות ומשונות (למשל, שקופיות זכוכית או טיפי מזרק) בהתאם ליישום הסופי הרצוי. לדוגמא, תאים כמוסים לתרבות 3D ב הידרוג מצורפת שקופיות זכוכית הם שימושיים במיוחד עבור יישומי הדמיה כמו הנחתת אור מוגבלת בתוך מדגם דק. תבניות מזרק ניתן להשתמש אנקפסולציה מהירה של תאים, המאפשר מספר רב יותר של דגימות כדי להיות מוכנות בתוך זמן קצר (לעומת זכוכית שקופיתים), שניתן להשתמש בהם עבור ניסויים הדורשים כמויות גדולות של תאים כגון cytometry זרימה או qPCR. בהמשך לכך, ג'לי האלה אז יכולים להיות בדוגמת עם רמזי ביוכימיים כדי לעורר תגובות הסלולר רצויות כגון בידול או פלישה. ^30,31

מבחני כדאיות ופעילות מטבולית לציין את הישרדותם של תאים עבור מערכת התנאים החומריים דפוסים שהוצגו. שים לב הפעילות המטבולית היה במעקב עד היום 3 ג'ל שאינו מתכלה (crosslink פפטיד RGKGRK) כדי להעריך את ההשפעות הראשוניות של תנאי פילמור דפוסים על תפקוד התא. בנוסף, assay שלמות הממברנה (חי / מת הכדאיות / cytotoxicity מכתים) של hMSCs ב 1 ו 6 ימים לאחר אנקפסולציה ג'ל ניסח עם crosslink פפטיד מתכלה (GPQGIWGQ) תומך כי התאים נשארים קיימא ולהפיץ 1 שבוע בתרבות. הכדאיות של שורות תאים נוספות דווחה תנאי photopatterning ³² דומים לאלההשתמשו פה ניתן להעריך עבור מערכת הידרוג'ל תיאר באמצעות מכתים חי / מת מבחני הפעילות המטבולית. בעוד שלא הבחנו בעיות עם כדאיות התא באמצעות מערכת חומרים זה ונהלים קשורים (4.2 ו -4.3), כמה סוגי תאים עשויים להיות רגישים רדיקלים חופשיים ו / או חשיפה לאור. במקרה זה, משתמשים עשויים לשקול שימוש במערכות חומרים שאינם photoinitiated, כגון אלקין יזיד, ¹² FXIII, ³¹ או דילס אלדר מבוסס כימיות היווצרות הידרוג'ל. ³³

טכניקות קלילות כדי לזהות ולכמת דפוסים של רמזים ביוכימיים בתוך ג'ל גם מוצגים (3.1 ו -3.2). Assay של האלמן הוא מעניין בעיקר משום ריאגנטים זמינים מסחריים ללא מדרגות עיבוד סינטטי נוספות או ריאגנטים יקרים יותר (למשל, פפטיד שכותרתו fluorescently) נדרשות. ניתן להשתמש assay של אלמן כדי לברר איזה שינוי של thiols חינם בדיוק עם רמזים ביוכימיים תחת differeNT photopatterning תנאי, כמו גם כדי להמחיש דפוסים במהירות. לכימות התאגדות פפטיד, ריכוז הקבוצה הפונקציונלי תיאול לפני ואחרי דפוסים, כאמצעי כמותית התאגדות פפטיד, נבחן ישירות עם assay של האלמן. בעוד סוג של כימות זה יכול להיעשות עם פפטידים שכותרתו fluorescently, ³⁴ כימותים מבוססי הדמיה דורשים יותר זמן רב צעדי טיפול וניתוח (למשל, סינתזה של פפטיד fluorescently שכותרתו ויצירת עקומת כיול להתייחס קרינת ריכוז הפפטיד באמצעות ניתוח תמונה). עבור התאגדות פפטיד הדמיה, מגיב אלמן ניתן ליישם ישירות דגימות ומיד דמיינו. בעוד מוגבל x ו- y-מטוסים להדמית דפוס, הטכניקה יכולה לשמש כשיטה פשוטה, שגרה כדי לקבוע אם מטריצות המכילות קבוצות תיאול חינם כבר בדוגמת. חשוב לציין כי assay של האלמן אינו גcytocompatible onsidered, זאת תוך ניתן להשתמש בו כדי לצפות ולכמת photopatterns, זה לא יכול להיעשות בנוכחות של תאים. הדמית דפוסים בשלושה ממדים בנוכחות תאים, הנטייה של פפטידים ניאון בתוך מטריצות הידרוג'ל נשארה בגישה רבה עצמה בשימוש נרחבת. החלטה של ​​דפוסי ניתן להעריכם ה- X, y-, וכן במיקרוסקופ confocal-מטוסים z משתמש, והשיטה היא cytocompatible כך תאים בתוך אזורים בדוגמת או אזורים שאינם בדוגמת ניתן לזהות. יחדיו, טכניקות assay מבוססי הדמיה של אלמן הם כלים משלימים לחוקרים להעריך הן מבחינה כמותית והן מבחינה איכותית photopatterning של רמזים ביוכימיים בתוך המערכת חומרים.

Photoclick, או באופן רחב יותר photoinitiated, כימיות ליצירת ושינוי של הידרוג בנוכחות של תאים הן רבות. הדפוס, אנקפסולציה, וטכניקות דפוסים המוצגות כאן הן לא הגוited למערכת המהותית שפורטה ועשוי לחול על כימיות מבוססות אור חלופיים, כגון אלקין תיאול, ³⁵ יזידו-אלקין, ⁴ ו כימי תיאול פנטן אחר (למשל, תיאול-norbornene), ^10,13 וכן עם photoinitiators שונים, כגון Irgacure 2959, Eosin Y ולאחר camphorquinone. לתשומת לבך, משתמשים ייתכן שיהיה צורך להתאים את פרמטרי הליך (למשל, פעמי דגירה, פעמים פילמור, צפיפות תאים) על מנת להבטיח כי תנאים להישאר cytocompatible למערכות אחרות אלה. מאחר שתהליך דפוסים דורש דיפוזיה של פפטיד שונה-alloc (ים) לתוך הידרוג'ל (2.2.3-2.2.5), תהליך זה עשוי להוכיח שימושי ביותר עבור תוספת של moieties מחייב integrin (למשל, פפטידים או חלבונים תאי מטריקס שברים) אל הידרוג'ל, שם קובץ מצורף של ליגנד לרשת נדרש עבור הדור של כוחות מתיחה על ידי הפעלת תא integrin המלא. ³⁶ הערה עבור ביומולקולות כי רשאילהיות פעיל באופן דומה בתמיסה או על חוסר תנועה (למשל, גורמים או ציטוקינים צמיחה), תוצאות דפוסי צעד הדגירה של דיפוזיה מחצית (~ 1 שעה) לתוך הידרוג'ל יכול להוביל איתות אירועי convolute. שיטות אחרות הוקמו עבור חוסר תנועה גורם גדילה או קיבוע מקומי עבור הדפוסים שלהם. ^37-39 בנוסף, ברזולוצית דפוס מוכתבת על ידי השליטה על חשיפה לאור. הנה, photomasks לאפשר יצירת דפוסים דרך עומק ג'ל ובסופו של x ו- y-מטוסים; עם זאת, שליטה במרחב רבה יותר על דפוסים של רמזים ביוכימיים בתוך ג'ל ניתן להשיג עם שיטות חלופיות של הקרנה כגון השימוש של מיקרוסקופ confocal שני פוטונים כדי ליצור דפוסים ה- X, y-, ומטוסי z-. ^34,40 לבסוף, חשוב לציין כי בעוד מערכת החומר מנוצלת בתוך הליך זה היא שונה רק בתחילה עם רמזים ביוכימיים, כימי photoclick מאונכות יכולות לשמש כדי לאפשר אלטרנטיבימנות בנכסים מטריקס לאורך זמן. ¹² ההליך ואת טכניקות שהוצגו כאן להוסיף גיוון הגישות קיימות ליצירת מטריצות סינטטיות עם מוגדר היטב spatiotemporally שבשליטת נכסים. בפרט, הזמינות המסחרית של ריאגנטים חומרים המשמשים בתוך הליך זה תהיה שימושית למגוון רחב של חוקרים המעוניינים השימוש בביו-חומרים מבוססי הידרוג'ל עבור יישומי תרבית תאים מבוקרים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
פפטידים מותאמים אישית	ספקים	----	פפטידים שונים עשויים להיות מסונתזים גם באמצעות טכניקות SPPS סטנדרטיות עם חומרים מספקים כולל ChemImpex ו-ChemPep.
PEG Thiol בעל 4 זרועות, MW 20k	JenKem ארה"ב	4ARM-SH	רשום תחת PEG הומו-פונקציונלי רב זרועות. PEG4SH עשוי גם להיות מסונתז כפי שהוזכר קודם לכן.
ליתיום פניל-2,4,6-טרימתיל-בנזויל פוספינאט	קולורדו פוטופולימר פתרונות	Li-TPO
דימתיל פנילפוספוניט	סיגמא אולדריץ'	149470	אזהרה, גורם לכוויות עור חמורות ולנזק לעיניים. ללבוש כפפות מגן, ביגוד והגנה על העיניים.
2,4,6-טרימתיל-בנזואיל כלוריד	סיגמא אולדריץ'	682519	זהירות, גורם לכוויות חמורות בעור ולנזק לעיניים. ללבוש כפפות מגן, ביגוד והגנה על העיניים.
בקבוק ליתיום ברומיד	סיגמא אולדריץ'	213225
2-בוטנון	סיגמא אולדריץ'	360473
, תחתון עגול, 100  מ"ל	Chemglass	CG-1506-05
80 מ"ל משפך מסנן, בוכנר, בינוני	פריט Chemglass	CG-1402-L-02	ניתן להשתמש בנייר סינון בתוך משפך זכוכית רגיל במידת הצורך.
מוטות ערבוב מגנטיים	ספקים שונים	----
ערבוב מגנטי ופלטה חמה	ספקים שונים	----
מסיר ואקום	ספקים שונים	----
תחמוצת דאוטריום	אקרוס אורגני	16630
פוספט של דולקו מאגר מלח	ThermoFisher Scientific	14190-250
פניצילין סטרפטומיצין	ThermoFisher Scientific	15070-063
Fungizone	ThermoFisher Scientific	15290-018
Trypsin-EDTA (0.5%), ללא פנול אדום	ThermoFisher Scientific	15400-054	בחר מדיום וטריפסין מתאימים בהתאם לסוג התא.
צינורות מיקרוצנטריפוגה	ספקים שונים	----	גדלים של 1.5 או 2 מ"ל, סטריליים.
מזרק BD עם קצות החלקה (לואר) (ללא מחט)	פישר סיינטיפיק	14-823-16H	מספר המוצר הרשום כאן הוא עבור מזרק 1 מ"ל (16H), ניתן להשיג גדלים שונים (14-823-XX).
Fisherfinest פרימיום שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילה	פישר סיינטיפיק	12-544-1
גומי סיליקון בטוהר גבוה, עובי 0.010 אינץ', גיליון 6 אינץ' x 8 אינץ', 55A דורומטר (אטם)	McMaster Carr	87315K62
אתנול, 200 הוכחה	Decon Labs	2701
RainX, מקורי	של אמזון	800002243	ניתן לרכוש מספקים אחרים.
Sigmacote	Sigma Aldrich	SL2
Photomasks	Advance Reproductions Corporation	----	Photomask Division, ניתן להדפיס עיצובים שונים כרצונך.
DTNB; המגיב של אלמן; 5,5-dithio-bis (2-חומצה ניטרובנזואית)	ThermoFisher Scientific	PI-22582
נתרן פוספט דו-בסיסי	Sigma Aldrich	S5136
Ethylenediaminetetraacetic חומצה	Sigma Aldrich	E6758
נתרן הידרוקסיד, כדורים/מוסמך ACS	Fisher Scientific	S318
חומצה אורתופוספורית	אלפא Aesar	33266
ציסטאין הידרוכלוריד מונוהידראט	סיגמא אולדריץ'	C7880
LIVE / DEAD כדאיות / ערכת ציטוטוקסיות, לתאי יונקים	ThermoFisher Scientific	L-3224
CellTiter 96 מימי תמיסה אחת מבחן	Promega	G3582
צנטריפוגה	ספקים שונים	----	מסוגל למהירויות של 90-110 x גרם.
Multiwell Plate Reader	ספקים שונים	----	מסוגל לקרוא ספיגה ב-405 ננומטר בצלחת של 96 בארות.
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי	ספקים שונים	----	לדמיין דפוסי פפטידים ותאים בתוך הידרוג'לים.
Omnicure Exfo Series 2000	Excelitas Technologies	----	ניתן להשתמש במערכות אור חלופיות לפילמור הידרוג'לים.
Zeiss Zen Lite Software	Zeiss	----	זמין ב-zeiss.com; תואם לתמונות שצולמו במיקרוסקופים של Zeiss
ImageJ	NIH		זמין ב-imagej.nih.gov; ישים לניתוח תמונות כללי