לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

סיכום

פרוטוקול זה מראה כיצד לבצע מיקרו-הזרקה ציטופלזמית בזיגוטות של חיות משק. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לספק כל פתרון לעובר של תא אחד, כגון כלי עריכת גנום ליצירת בעלי חיים נוקאאוט.

תקציר

מיקרו-הזרקה ציטופלזמית לעוברים חד-תאיים היא טכניקה חזקה מאוד. כדוגמה, הוא מאפשר העברת כלים לעריכת גנום שיכולים ליצור שינויים גנטיים שיהיו נוכחים בכל תא של אורגניזם בוגר. זה יכול לשמש גם להעברת siRNA, mRNA או נוגדנים חוסמים לחקר תפקוד גנים בעוברים טרום השרשה. הטכניקה המקובלת להזרקת מיקרו עוברים המשמשת במכרסמים מורכבת ממיקרופיפטה דקה מאוד החודרת ישירות לקרום הפלזמה כאשר היא מתקדמת לעובר. כאשר טכניקה זו מיושמת על בעלי חיים היא בדרך כלל מביאה ליעילות נמוכה. הסיבה העיקרית לכך היא שבניגוד לעכברים וחולדות, לזיגוטות בקר, בקר וחזיר יש ציטופלזמה כהה מאוד וממברנת פלזמה אלסטית מאוד המקשה על הדמיה במהלך הזרקה וחדירה של קרום הפלזמה. בפרוטוקול זה אנו מתארים שיטת מיקרו-הזרקה מתאימה להעברת תמיסות לציטופלזמה של זיגוטות בקר שהוכחה כמוצלחת גם עבור עוברי כבשים וחזירים. ראשית, לייזר משמש ליצירת חור ב-zona pellucida. לאחר מכן מוחדר מיקרופיפט זכוכית קהה דרך החור ומתקדם עד שקצה המחט מגיע לכ-3/4 לתוך העובר. לאחר מכן, קרום הפלזמה נשבר על ידי שאיבת תוכן ציטופלזמי בתוך המחט. לבסוף, התוכן הציטופלזמי הנשאף ואחריו תמיסת העניין מוזרק בחזרה לציטופלזמה העוברית. פרוטוקול זה שימש בהצלחה לאספקת פתרונות שונים לזיגוטות בקר ובקר עם יעילות של 100%, ליזה מינימלית ושיעורי התפתחות בלסטוציסטים תקינים.

מבוא

microinjection cytoplasmic של עוברי 1 תאים היא טכניקה רבת עוצמה. זה יכול לשמש להעברת כל פתרון לתוך העובר, למשל, לייצר הגן לדפוק-outs ללמוד תפקוד הגן או כדי ליצור חיות הגן בעריכה. רוב חקלאי-רלוונטי zygotes חוות חיות יש רכב חומצות שומן מאוד גבוה שגורם הציטופלסמה שלהם אטום וחשוך ^1. יש להם גם קרום פלזמה אלסטי למדי (PM). תכונות אלו הופכות את microinjection באמצעות pronuclear קונבנציונלי / הזרקת ציטופלסמית כפי שמוצגת במינים מכרסמים מאתגרים ולעתים קרובות לא מדויקים.

יש microinjection cytoplasmic יתרונות על פני microinjection pronuclear שכן הוא קל יותר לבצע וגם גורם פחות נזק את העוברים מוזרק, וכתוצאה מכך כדאיות גבוהה ^2. המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להדגים שיטה מוצלחת לאספקת פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes חיות משק. כדי להיות מסוגל לבצעmicroinjection cytoplasmic עם יעילות גבוהה על עוברי בעלי חיים, לייזר משמש כדי ליצור חור המעטפת השקופה (ZP) ולאחר מכן מחט זכוכית קהה-end משמש microinjection. אסטרטגיה זו שואפת להקטין את נזק מכני המוטבע על העובר במהלך ההזרקה. לאחר מכן, שאיפה של תוכן ציטופלסמית בתוך המזרק מאפשרת שבירה יעילה ובטוחה של ראש הממשלה להבטיח כי הפתרון מועבר לתוך הציטופלסמה של העובר.

טכניקה זו כבר נוצלה בהצלחה בעוברי שור לספק siRNA לתוך הציטופלסמה zygotic ^3,4 וליצור מוטציות באמצעות חזרות palindromic קצרות interspaced התקבצו באופן קבוע (CRISPR) / קשור CRISPR מערכת 9 (Cas9) מערכה ^5. זה גם מתאים (עם שינויים קלים) להזרקת ביציות קומולוס סגורה שור ^6. כאן אנו מתארים פרוטוקול ההזרקה שלנו ומספק צבע, שיכול לחול על הזרקת כל desפתרון IRED לתוך הזיגוטה, ולהראות כי באמצעות טכניקה זו גורמת תמוגה מינימלי ואינו להשפיע על התפתחות העובר המוקדם.

פרוטוקול

1. ייצור Micropipette

1. micropipette הזרקה
   1. מניח זכוכית נימי בורוסיליקט (קוטר חיצוני (OD): 1.0 מ"מ, קוטר פנימי (ID): 0.75 מ"מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי ימין ושמאל נימים) ונעל אותו.
   2. השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם טאפר ארוך. (דוגמה: חום: 825; משוך: 30; מהירות: 120; זמן: 200; לחץ: 500).
   3. מוציאים בזהירות את טפטפות משך מהמכשיר והנח אותו על microforge במצב מאוזן.
   4. תביא פיפטה משכה נימת דוד microforge עם חרוז הזכוכית שלה אל מוקד. השתמש reticle העינית כדי למדוד את העובי הרצוי ולעבור פיפטה אופקית עד נימת הדוד מגיעה הקוטר הפנימי היעד (5 מיקרומטר).
   5. התאם את החום לכ -45% ובעדינות להביא את פיפטה למטה כך הוא בא במגע עם הנימה. הפעל את החימום בקצרה. w זהחולה מעט להמס את פיפטה כך שומר על הנימה ו בקירור, פיפטה תשבור בנקודת מגע יצירת חתך ישר.
      הערה: הגדרת הטמפרטורה המתאימה היא המפתח בשלב זה מאז בטמפרטורות גבוהות מדי יגרום העיקול פיפטה ובכך חתך ישר לא ניתן יהיה וטמפרטורות נמוכות מדי לא יספיקו כדי להמיס את פיפטה (איור 1 א).
   6. תן זווית משוערת 30 ° ליד קץ פיפטה ידי מיקומה על 10 מיקרומטר הרחק נימת הדוד. כוונו את הטמפרטורה ל -60% ולהפעיל את החימום.
      הערה: זה יהיה לכופף את פיפטה על הנימה. זווית זו היא רצויה כך קצה המחט הוא במקביל לפני השטח של צלחת ההזרקה כאשר רכובים לתוך המזרק (האיור 1B).
   7. טפל טפטפות microinjection בזהירות כפי שהם מאוד חדים ושבריר.
2. micropipette החזקה
   1. מניחים borosilicזכוכית נימי אכלו (OD: 1.0 מ"מ, מזהה: 0.75 מ"מ) ב חולץ micropipette (במרכז מחזיקי נימי ימין ושמאל) ונעל אותו.
   2. השתמש בתוכנית המתאימה למשוך את נימי זכוכית כך התוצאה היא קצה דק עם ארוך אפילו להתחדד ו קירות מקבילים (דוגמה: חום: 815; משוך: 20; מהירות: 140; זמן: 175; לחץ: 200).
   3. מוציאים בזהירות את פיפטה משך מהמכשיר חולץ ומניחים אותו על בעל microforge במצב מאוזן. התאם את המיקוד על נימת חימום פיפטה.
   4. השתמש reticle העינית כדי למדוד את קוטר פיפטה ולהעביר את פיפטה עד קוטרו מעל הנימה מגיע 180 מיקרומטר.
   5. באותו הגודל המצוין, לסמן את נימי זכוכית עם עט בעל חוד יהלום, ולאחר מכן לחץ בעדינות על קצה המשך לשבור את הכוס. זה אמור לגרום חתך ישר (איור 1 ג).
   6. הזז את פיפטה לתנוחה אנכית עם קצו קרוב הנימה. הגדר את הטמפרטורה של microforge ל -60%.
   7. אש-פולני קצה פיפטה באמצעות טכניקות סטנדרטיות ⁷ עד שהוא מגיע מזהה של 40 מיקרומטר. השתמש reticle העינית יבדוק את התעודה (1D איור).
   8. תן זווית על פיפטה.
      1. תביאו פיפטה בחזרה למצב אופקי על 10 מיקרומטר הרחק נימה ו -5 מ"מ הרחק קצהו. הגדר את הטמפרטורה לכ 60% ולהפעיל את החימום כדי לכופף את פיפטה על הנימה. המשך חימום עד לזווית רצויה (של כ -30 ^o) הוא הגיע. בדוק את זווית ראייה (1E איור).
         הערה: פיפטה בדרך כלל רכובה על microinjector בזווית של כ -60 ^o ביחס לחלק התחתון של מנת ההזרקה. הטיפ של פיפטה מכופף כך שהוא מקביל התחתון של המנה, אשר הוא הכרחי עבור הזריקה הנכונה של העובר מטוס באמצע שלה.

le "> 2. הגדרת Micromanipulator

1. בדוק כי microinjectors נטענים באופן מלא עם שמן וכי אין בועות אוויר במערכת (בועות microinjector למנוע בקרה טובה של הזרקה).
2. בדוק כי micromanipulators נמצא בעמדת המרכז. זה יאפשר מגוון רחב של תנועה של טפטפות.
3. הכנס פיפטה מחזיק לתוך מחזיק micromanipulator השמאל פיפטה הזריקה לתוך מחזיק המיקרומניפולציה התקין.
4. אפשר שמן להיכנס טפטפות ידי קפילריות ולבדוק כי המערכת פועלת כראוי על ידי העברת הנפט מעלה ומטה בתוך פיפטה באמצעות הפקדים microinjector.
   הערה: אם אין תנועה של שמן בתוך המחטים, ייתכן שיש לסתום. במקרה זה, השתמש מחט חדשה.
5. השתמש בפקדים micromanipulator להביא את טפטפות למרכז השדה של מיקרוסקופ מבט. באמצעות הגדלה 4X, לבדוק כי טיפים micropipette נמצאים בזווית הנכונה (עמ 'arallel אל החלק התחתון של המנה).
   הערה: התקנה נכונה של המחטים היא מפתח עבור זריקה מוצלחת ועל עקביות תוצאות.
6. כייל את מערכת הלייזר הבאים במדריך כיול של היצרן.

3. הכנת צלחת הזרקה (איור 2)

1. מניחים ירידה 50 μl של התחמם (37 ° C) SOF-HEPES (הרכב המפורטים בסעיף חומרים) בתוספת 20% עוברי בסרום שור (FBS) על במרכז המכסה של צלחת פטרי 100 מ"מ. מניחים 1 - ירידה μl 2 של הפתרון להיות מוזרק קרוב עד טיפת ההזרקה. ודא כי עוברי לא להתקרר מתחת RT.
   הערה: בפרוטוקול זה נוסיף את צבען אדום-Dextran לפתרון ההזרקה כדי להיות מסוגל לדמיין באתר ההזרקה ולעקוב אחר זה מאוחר יותר.
2. מכסים את טיפות בצלחת ההזרקה באמצעות כ 10 מ"ל של שמן מינרלי.
3. מניח את צלחת ההזרקה על הבמה של מיקרוסקופ הפוכה ולהביא החרצןettes לתוך ירידת ההזרקה. בדוק כי המחטים הן בפוקוס בתוך הטיפה. וכוון את גובהם לפי הצורך באמצעות הפקדים micromanipulator.
4. באמצעות microdispenser, לטעון על 20 - 30 zygotes (17 - 20 שעות לאחר ההפריה (hpf)) בצד העליון של ירידה ההזרקה. בצע הזרקה בטמפרטורת חדר כך את מספר העוברים בירידת ההזרקה נקבע לפי המהירות שבה האדם יכול להזריק אותם. אל תטען יותר עוברים יותר מאלה שיכולים להיות מוזרק 30 דקות.
   1. כדי לטעון את העוברים לתוך microdispenser, לוחץ על המתג לחלוטין לטבול את הקצה לתוך התמיסה המכילה את העוברים. געו העוברים שיאספו אותו עם הקצה של נימי הזכוכית (אחד בכל הפעם) ולאט לאט לשחרר את הבוכנה כך כל עובר נכנסה לתוך הנימים. חזור על פעולה זו עד שכל העוברים נאספים או יכולת microdispenser מלאה.
   2. כדי לשחרר את העוברים הטעונים, לוחץ על המתג בעדינות עד שיתוף כל הנפחntaining עובר הוא שוחרר מן הנימים.

4. Microinjection

1. באמצעות מטרת 4X, טען את הפתרון להיות מוזרק לתוך פיפטה ההזרקה ידי הפעלת לחץ שלילי (aspirating). טען פתרון מספיק להזריק 2 - 3 zygotes. לאחר מכן להעביר עד טיפת ההזרקה.
2. בתוך טיפת ההזרקה, להזיז את פיפטה מחזיק כך שהקצה מתקרב קרוב זיגוטה. החל לחץ שלילי (לשאוב) עם microinjector ההחזקה כך הזיגוטה מקבל קבוע פיפטה מחזיקה ותיקונים לבוא מטרה 20X.
3. לאחר הזיגוטה מחוברת פיפטה מחזיקה, לבדוק את איכותו בעזרת פיפטה ההזרקה כדי להזיז את העובר בעדינות ממקום למקום מבלי לנתק אותו. זיגוטה באיכות טובה צריכה שני גופים הקוטביים (אם כי לפעמים רק אחד נתפס) ו הציטופלסמה הומוגנית. אין להזריק zygotes נורמלי (איור 3 א).
4. במידת הצורך, לשנות את מיקום העובר עבור זריקה נכונהמקום. מיצוב טוב יהיה זה שבו יש קצת מקום בין ZP וראש הממשלה, כך ראש הממשלה אינו ולהינזק ידי לייזר.
5. בדוק כי פיפטה ההזרקה ממוקמת על-המטוס באמצע של העובר על ידי נגיעת הזיגוטה בעדינות באתר הזרקה. אם זה לא על אמצע המטוס שלה, המחט תהיה נוטה להפוך את העובר לסובב במקום לנקב. התאם את הגובה של פיפטה הזריק לפי צורך.
6. הפוך חור ZP באמצעות לייזר (איור 3 ב).
   1. תוך שימוש במקום התוכנה של לייזר צלב הכיוון לייזר ZP איפה החור ייעשה (בצד הנגדי למקום שבו העובר מחוברת פיפטה מחזיקה). באמצעות קליק חלון בקרת לייזר על כפתור האש. ודא כי גודלו של החור הוא גדול מספיק כדי ליצור פתח ZP עבור המחט לעבור מבלי לפגוע PM (דוגמה: 0.662 רוחב פולס msec / 6.9 מיקרומטר גודל חור).
7. להעביר את מחט הזריקהדרך חור ZP וליצור קשר עם ראש הממשלה. המשך לדחוף פיפטה קדימה עד שהמחט נמצאת ¾ של הדרך אל העובר (איור 3 ג).
8. שים את המיקום של המניסקוס על שלבי פתרון-שמן, כמו זה ישמש לשלוט נפח הזרקה בעקביות.
9. החל לחץ שלילי (לשאוב) על פיפטה ההזרקה, אשר תגרום PM ו הציטופלסמה להיות aspirated לתוך מחט הזריקה. המשך עד שהתנועה של הציטופלסמה לתוך המחט מאיצה או כאשר תוכן הציטופלסמה ערבוב עם פתרון הזרקה ניתן לראות. אלה יציינו שבירה של ראש הממשלה (איור 3D).
10. להזריק בחזרה התוכן ציטופלסמית ואחריו הפתרון לתוך הציטופלסמה של הביצית המופרית על ידי הפעלת לחץ חיובי (הזרקה), עד המניסקוס על שלבי פתרון-שמן התקדם מקביל בקוטר של הזיגוטה אחד בעבר לנקודת ההתחלה.
    הערה: בתנאים שלנו, repre זהsents כ 7 pl של פתרון מוזרק (איור 3E).
11. שינוי מטרת 4X להזיז את העובר / הים המוזרק אל הצד התחתון של ירידת ההזרקה. שחרר את העובר על ידי הפעלת לחץ חיובי על microinjector ההחזקה. שמור את העוברים הלא מוזרק בצד העליון ואת אלה מוזרקים בצד התחתון של הירידה כדי לסייע במעקב אחר של עוברים המוזרקים / הלא מוזרק ולעבוד ביעילות.

5. שחזור העובר תוצאות הזרקה

1. הפוך 3 טיפות של כ 200 μl בצלחת חדשה עם טרום חימם SOF-HEPES. אסוף את העוברים מוזרק באמצעות microdispenser (כמתואר לעיל). לשטוף את העוברים מוזרק על ידי העברתם דרך 3 SOF-HEPES טיפות.
2. לספור את העוברים lysed במהלך microinjection וזורקים אותן.
   הערה: זיגוטה lysed ניתן להבחין בקלות מתוך אחד שלם מאז הראשון מופיע שקוף, מלא את כל ZP, וזה בדרך כלל יש cytoplasmicתוכן דולף החוצה של העובר.
3. לחלופין, סמן את יעילות microinjection באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עליך להיות מודע לכך חשיפה לאור UV יכול לגרום נזק לעובר שיכולים להשפיע על התפתחות שלאחר מכן.
4. קבוצות התרבות של 25 עוברים מוזרק 50 טיפות μl של המדיום אופטימיזציה סימפלקס אשלגן (KSOM) השלימו עם 4 מ"ג / אלבומין בסרום שור מ"ל (BSA) תחת שמן מינרלי על 38.5 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ באוויר, והלחות לרוויה.
5. להשלים את תרבות התקשורת עם 5% FBS יומיים לאחר ההזרקה.
6. בדוק הבלסטוציסט (BL) מחירים 7 ימים לאחר ההזרקה. חישוב שיעורי BL כמו מספר כולל של עוברי הבלסטוציסט / מספר כולל של עוברים בתרבית הטיפה.

תוצאות

ליזר בסיוע microinjection cytoplasmic הוא פרוטוקול חזק ואמין כדי לספק פתרונות לתוך הציטופלסמה של zygotes בעלי החיים. איור 3 מראה בקווים כלליים את zygotes לפני ואחרי ההזרקה כמו גם את קווי המתאר הכלליים של הטכניקה. Dextran-אדום משמש הזרקת פתרון ולאפשר לאתר מעקב של יעילות הזרקת הזרקת ודיוק. משלוח מוצלח של הפתרון מתואר באיור 4 מראה עובר מוזרק לאחרונה שבה לצבוע מופץ בצורה הומוגנית בציטופלסמה. באמצעות טכניקה זו 100% מן ה...

דיון

Microinjection של zygotes הוא שיטה מבוססת היטב מציגים פתרונות לעוברי יונקים. עם כמה וריאציות תלויות המין ואת מטרת הניסוי, טכניקה זו יכולה להיות בשימוש נרחב. אנו מראים כיצד לבצע microinjection intracytoplasmic באמצעות לייזר כדי לסייע בכניסה של micropipette בוטה לקצה. Zygotes של כמה מיני בעלי חיים (כמו בקר, כבשים, חזירים) יש הציטופלסמה כהה, שימנע את להדמיה של פיפטה בזריקה אחת בתוך העובר. כמו כן, ממברנות הפלזמה שלהם הן מאוד אלסטי, מה שהופכים החדירה שלהם עם מחט משופע ממוסמר (בדרך כלל ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
חולץ מיקרופיפטות	מכשיר סאטר	P-97
מכשירי סאטר	נימי זכוכית	B100-75-10	נימים אלו משמשים לייצור פיפטות האחיזה וההזרקה. ניתן להשתמש בכל צינורות בורוסיליקט בקיר עבה/סטנדרטי ללא נימה.
Microforge	Narishige	MF-9	מצויד בעדשת הגדלה פי 10.
מיקרומניפולטור	Nikon / Narishige	NT88-V3
מיקרוסקופ הפוך	Nikon	TE2000-U	מצויד בעדשות 4X, 20X ובמערכת לייזר.
מכשירי מחקר	לייזר	7-47-500	שבתאי 5 לייזר פעיל.
מיקרו-דיספנסר	דראמונד	3-000-105	המיקרו-דיספנסר משמש להזזת העוברים. ניתן להשתמש גם בפיפטה p10 אך לטעון נפח מינימלי ככל האפשר.
צלחת תרבית 100 על 15 מ"מ	פלקון	351029	השתמש במכסה הכלי כדי ליצור את צלחת ההזרקה מכיוון שיש להם קירות נמוכים יותר ויקלו על המיקום וההזזה של המיקרומניפולטור. ניתן להשתמש גם במכסה של צלחת תרבות 60 מ"מ.
צלחת תרבית 35 מ"מ	קורנינג	430165	כלים אלה משמשים לתרבית העוברים ב-50 μ l טיפות מכוסות בשמן מינרלי. לחלופין, ניתן להשתמש גם בצלחת 4 בארות. ללא קשר למנה שנבחרה לתרבית העוברים, הם תמיד צריכים להיות מאוזנים באינקובטור לפחות 4 שעות לפני העברת העוברים אליהם.
חממה	Sanyo	MCO-19AIC	כל חממה שניתן להגדיר ל-38.5 מעלות; C, 5% CO2 ניתן להשתמש בתנאי פחמן.
סטריאומיקרוסקופ	ניקון	SMZ800	משמש להדמיית העוברים בטיפות התרבית ובמהלך שטיפות. ניתן להשתמש בכל סטריאומיקרוסקופ עם הגדלה פי 10.
יחידת בקרה HT	Minitube	12055/0400	מערכת חימום מחוברת לסטריאומיקרוסקופ.
מיקרוסקופ מחומם שלב	Minitube	12055/0003	מערכת חימום מחוברת לסטריאומיקרוסקופ.
Dextran-Red	Thermo Scientific	D1828	תמיסה סטרילית של 10 מ"ג/מ"ל משמשת להזרקה.
שמן מינרלי	סיגמא	M8410	שמור את השמן המינרלי בטמפרטורת החדר ומוגן מפני אור באמצעות נייר נייר כסף.
KSOMaa Evolve Bovine	Zenit	ZEBV-100	בתוספת של 4 מ"ג/מ"ל BSA. יש לאזן את צלחות KSOM לתרבית עוברים בחממה למשך 4 שעות לפחות לפני השימוש.
FBS	Gemini-Bio	100-525	השתמש ב-FBS מוסמך לתאי גזע.
זיגוטות זיגוטות			מוזרקות 17 - 20 hpf וניתן להפיק אותן in-vitro- או in-vivo.
NaCl	Sigma	S5886	ריכוז סופי: 107.7 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
KCl	Sigma	P5405	ריכוז סופי: 7.16 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
KH2PO4	Sigma	P5655	ריכוז סופי: 1.19 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
MgCl2 6H2O	Sigma	M2393	ריכוז סופי: 0.49 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
נתרן DL-לקטט	סיגמא	L4263	ריכוז סופי: 5.3 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O	סיגמא	C7902	ריכוז סופי: 1.71 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
D-(&מינוס;)-פרוקטוז	סיגמא	F3510	ריכוז סופי: 0.5 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
HEPES	סיגמא	H4034	ריכוז סופי: 21 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
MEM-NEAA	Sigma	M7145	ריכוז סופי: 1x. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
BME-EAA	Sigma	B6766	ריכוז סופי: 1x. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
NaHCO3	Sigma	S5761	ריכוז סופי: 4 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
נתרן פירובט	סיגמא	P4562	ריכוז סופי: 0.33 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
Glutamax	Gibco	35050	ריכוז סופי: 1 מ"מ. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
BSA	Sigma	A-3311	ריכוז סופי: 1 מ"ג/מ"ל. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
Gentamicin	Sigma	G-1397	ריכוז סופי: 5 μ גרם/מ"ל. רכיב של מדיום SOF-HEPES.
מים להעברת עוברים	Sigma	W1503	רכיב של מדיום SOF-HEPES.
מדיום SOF-HEPES	מיוצר במעבדה		pH 7.3 - 7.4, 280 ו-plusmn; 10 mOs. מסנן מעוקר דרך 22 μ ניתן לאחסן מסנן M במקרר בטמפרטורה של 4 מעלות; C למשך חודש. חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש.