אנלוגים של טרהלוז מתגלים כמולקולות חשובות ליישומים ביולוגיים וביו-רפואיים. אנו מתארים פרוטוקול אופטימלי לסינתזה וטיהור אנזימטית של אנלוגים של טרהלוז שהוא פשוט, יעיל, מהיר וידידותי לסביבה. יישומו לייצור וניהול מהיר של בדיקה לזיהוי מיקובקטריות מודגם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
צעד אחד ראפיד סינתזה האנזימטית-כל מימית טיהור של אנלוגים trehalose
במאמר זה
סיכום
תקציר
מבחינה כימית גרסאות מותאמות של trehalose, או אנלוגים trehalose, יש יישומים בביולוגיה, ביוטכנולוגיה, ומדע התרופות, בין שדות אחרים. למשל, אנלוגים trehalose נושאות תגים לזיהוי שימשו לגילוי שחפת Mycobacterium ייתכן יישומים כסוכני הדמיה לאבחון שחפת. גרסאות יציבה hydrolytically של trehalose גם אלה נשאפים בשל הפוטנציאל שלהם לשמש ממתיקים שאינם הקלורי וסוכני מוגני ביו. למרות הערעור של מש' זו של חומרים עבור יישומים שונים, את הפוטנציאל שלהם נשאר בלתי ממומש בשל חוסר מסלול חזק לייצור שלהם. כאן אנו מדווחים פרוטוקול מפורט לסינתזת biocatalytic צעד אחד המהירה ויעילה של אנלוגים trehalose שעוקפת את הבעיות קשורות סינתזה כימית. על ידי ניצול של synthase trehalose thermostable (TreT) האנזים מן Thermoproteus Tenax, אנלוגים trehalose יכול להיות generatאד בשינה בצעד אחד לבין מקבילי גלוקוז וגלוקוז דיפוספט uridine בתשואה גבוהה (עד מרה כמוני) ב 15-60 דקות. פרוטוקול טיהור פשוט ומהיר ללא chromatographic, אשר מורכב של דיאליזת ספין חילוף יונים, יכול לספק אנלוגים trehalose רבים של ריכוז ידוע בתמיסה מימית קטן כמו 45 דקות. במקרים בהם אנלוגי גלוקוז unreacted עדיין נשאר, טיהור chromatographic של המוצר אנלוגי trehalose יכול להתבצע. בסך הכל, שיטה זו מספקת פלטפורמת biocatalytic "ירוקה" לסינתזה המזורזת וטיהור אנלוגים trehalose כי הוא יעיל ונגיש-כימאים לא. כדי להדגים את תחולתה של שיטה זו, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה, כל-מימית טיהור, והמינהל של בדיקה הכימיה לחץ מבוסס-trehalose כדי mycobacteria, שכולן לקח פחות משעה 1 ואפשרה גילוי הקרינה של mycobacteria. בעתיד, אנו צופים כי, בין othאה יישומים, פרוטוקול זה ניתן להחיל את הסינתזה המהירה של בדיקות מבוססות trehalose לאבחון שחפת. למשל, נמשך זמן קצר אנלוגים trehalose שונים-רדיונוקלידים (למשל, 18 F-modified trehalose) יוכל לשמש עבור שיטות הדמיה קליניות מתקדמות כגון טומוגרפיה-טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוזיטרונים (PET-CT).
מבוא
Trehalose הוא דו סוכר סימטרי הלא צמצום מורכב משני moieties גלוקוז כי מצטרפים (איור 1 א) 1,1-α, α-glycosidic אג"ח. בעוד trehalose נעדר בני אדם ויונקים אחרים, הוא נפוץ למצוא חיידקים, פטריות, צמחים, וחסרי חוליות 1. התפקיד העיקרי של trehalose ברוב האורגניזמים הוא להגן מפני לחצים סביבתיים, כגון התייבשות 1. בנוסף, פתוגנים אנושיים מסוימים דורשים trehalose עבור ארסיות, כולל שחפת Mycobacterium גרימה-שחפת, אשר מנצלת trehalose כמתווך של ביוסינתזה מעטפת תא כאבן בניין לבניית glycolipids אימונו-2.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ביטוי טיהור של TreT מ coli Top10 E.
הערה: נא ליצור קשר עם הכותבים לבקש זן החיידק TreT להביע (פלסמיד pBAD TreT, המכיל את הגן ט Tenax tret בשליטת החלבון AraC, הופך Top10 E. coli 19) והסכם העברת החומר הנלווה . הפרוטוקול הבא בדרך כלל נותן תשואת חלבון של כ -4 מ"ג / L.
- הכן תרבות הלילה 3 מ"ל של TreT להביע E. coli.
- Top10 E. coli....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ט Tenax TreT התקבל בחיידק הזה תשואה של כ -4 מ"ג / L להשתמש בביטוי חלבון סטנדרטי טכניקות טיהור. צעד כרומטוגרפיה זיקת ניקל יחיד היה מספיק כדי לטהר TreT מן lysate coli (עקבות FPLC נציג מוצגות באיור 4). כפי שנקבע בפרסום הראשוני שלנו על תהליך הסינתזה TreT, רקומביננטי ט Tenax TreT הוא מסוגל להמיר רחבה של אנלוגים-רבים גלוקוז מגוון אשר הזמינים באופן מסחרי-אל אנלוגים trehalose להתכתב עם יעילות גבוהה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
אנלוגים trehalose יש פוטנציאל להשפיע בתחומים שונים, החל משימור מזון ותרופות כדי אבחון וטיפול של זיהומים חיידקים 6. שיטות קיימות סינתזה כימית רבות שלבים שימושיות להפקת אנלוגים trehalose מורכבים עם מספר אתרים של שינוי (למשל, המתרחשים glycolipids mycobacterial מורכב באופן טבעי). עם זאת, שיטות אלו תמיד ממושך ובלתי יעילות, גם כאשר מוחלים על הסינתזה של אנלוגים trehalose monosubstituted הפשוטים יחסית 9,
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי מענק מהמכונים הלאומיים לבריאות (R15 AI117670) ל-B.M.S ו-P.J.W, כמו גם פרס Cottrell College Scholar מתאגיד המחקר (20185) ל-P.J.W. L.M.M. נתמך על ידי מלגת פרובוסט מ-CMU.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| LB אגר | מוצרי מחקר בינלאומיים | L24021 | |
| אמפיצילין מלח נתרן | סיגמא אולדריץ' | A9518 | |
| מרק לוריא | מוצרי מחקר בינלאומיים | L24045 | |
| מרק נהדרים | בינלאומיים | T15050 | |
| L-(+)-ערבינוז | סיגמא אולדריץ' | A3256 | |
| מלח חוצץ | פוספט GE Healthcare | SH30256 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | I5513 | |
| נתרן כלורי | BDH | BDH9286 | |
| נתרן פוספט, מסנן מזרק מונו-בסיסי | Fisher Scientific | S374 | |
| , 0.45 ומיקרו; m | פישר סיינטיפיק | 09719D | |
| מעכב פרוטאז מיני טבליות, ללא EDTA | Thermo Scientific | 88666 | |
| HisTrap עמודת זיקה ניקל HP, 5 מ"ל | GE Healthcare | 17-5248-02 | |
| TRIS בסיס ultrapure | מוצרי מחקר בינלאומיים | T60040 | |
| צינורות דיאליזה, MWCO 12– 14,000 | פישר סיינטיפיק | 21-152-16 | |
| אנלוגים של גלוקוז | CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals | דוגמאות לספקים המציעים אנלוגים רבים של גלוקוז | |
| 6-Azido-6-deoxy glucopyranose (6-GlcAz) | CarboSynth | MA02620 | |
| UDP-Glucose | abcam Biochemicals | ab120384 | |
| מגנזיום כלוריד הקסהידרט | פישר סיינטיפיק | M33 | |
| Amicon אולטרה-15 יחידת סינון צנטריפוגלי | EMD Millipore | UFC901008 | |
| Bio-Rex RG 501-X8 שרף חילופי יונים מעורב | Bio-Rad | 444-9999 | |
| מדיה ביו-ג'ל P2 עדינה במיוחד | Bio-Rad | 150-4118 | |
| לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה של ג'ל סיליקה בגיבוי זכוכית | EMD Millipore | 1056280001 | |
| n-בוטנול | פישר סיינטיפיק | A399 | |
| אתנול | פישר S25310A | ||
| מדעי חומצה גופרתית | פישר סיינטיפיק | A300 | |
| אצטוניטריל | EMD Millipore | AX0145 | |
| תחמוצת דאוטריום, 99.8% | אקרוס אורגניקס | 351430075 | |
| עמודת אמינופרופיל HPLC | סיגמא אולדריץ' | 58338 | |
| אלבומין סרום בקר | סיגמא אולדריץ' | 5470 | |
| פרה-פורמלדהיד | טד פלה | 18505 | |
| אלקין-488 | סיגמא אולדריץ' | 761621 | |
| נתרן אסקורבט | סיגמא אולדריץ' | A7631 | |
| טריס[(1-בנזיל-1H-1,2,3-טריאזול-4-יל)מתיל]אמין (TBTA) | קליק כלים כימיים | 1061 | |
| tert-בוטנול | סיגמא אולדריץ' | 360538 | |
| דימתילסולפוקסיד | סיגמא אולדריץ' | W387520 | |
| נחושת (II) סולפט | סיגמא אולדריץ' | C1297 | |
| פלואורומאונט-G הרכבה בינונית | דרום ביוטכנולוגיה | 10001 |
מקורות
- Elbein, A. D., Pan, Y. T., Pastuszak, I., Carroll, D. New insights on trehalose: a multifunctional molecule. Glycobiology. 13, 17-27 (2003).
- Tournu, H., Fiori, A., Van Dijck, P. Relevance of trehalose in pathogenicity: some general rules, yet many exceptions. PLoS Pathog....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
