מאמר שיטה

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

DOI:

10.3791/54518

⸱

9 בדצמבר 2016

 ,  , 
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

במאמר זה

הודעת תיקון

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן אנו מתארים פרוטוקולים לשבש בתאי יונקים ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורה קריוגני, לייצר תמצית התא מן אבקת התא וכתוצאה מכך, ולבודד קומפלקסים חלבונים של עניין על ידי לכידת זיקה על חרוזים פאראמגנטיים בקנה מידה מיקרון מצמידים נוגדנים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכידת זיקה היא טכניקה יעילה לבידוד קומפלקסי חלבונים אנדוגניים למחקר נוסף. הפועל בשיתוף עם נוגדן, הטכניקה הזו גם הוא מכונה לעתים קרובות כמו immunoprecipitation. ניתן ליישם לכידת זיקה ב בקנה מידה הספסל בהקשר תפוקה גבוהה. כאשר מצמידים עם ספקטרומטריית מסה חלבון, לכידת זיקה הוכיחה להיות סוס עבודה של ניתוח interactome. אמנם יש דרכים רבות פוטנציאל לבצע את הצעדים הרבים המעורבים, הפרוטוקולים הבאים ליישם השיטות המועדפות שלנו. שתי תכונות הם ייחודיות: שימוש אבקת תא cryomilled לייצר תמציות תא, וחרוזי פאראמגנטיים מצמידים נוגדנים כמדיום הזיקה. במקרים רבים, השגנו תוצאות טובות לאלו שהושגו עם שיטות לכידות זיקה קונבנציונליות יותר. Cryomilling ימנע בעיות רבות הקשורות עם צורות אחרות של שבירת תא. הוא מספק שביר ביותר של החומר, תוך הימנעות denatבעיות uration הקשורים חימום או הקצפה. זה שומר על מעלה ריכוז חלבון הילידים עד כדי מיצוי, מקלי דיסוציאציה macromolecular. זה מקטין את זמן חילוץ חלבונים לבלות בתמיסה, הגבלת פעילות אנזימטית מזיקה, והוא עשוי להפחית את הספיחה הלא הספציפית של חלבונים על ידי מדיום הזיקה. מיקרון בקנה מידת מדיה מגנטית זיקה הפכה יותר רגילה לאורך השנים האחרונות, החלפה ויותר agarose- המסורתי מבוססת מדיה Sepharose. יתרונות עיקריים של מדיה מגנטית כוללים בדרך כלל חלבון ספיחה שאינה ספציפית נמוכה; אין גבול הדרת גודל בגלל מורכבות חלבון המחייב מתרחש על פני השטח החרוזים ולא בתוך הנקבוביות; וקלות מניפולציה וטיפול באמצעות מגנטים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישום טיפוסי של שיטות העבודה שהוצגה בפניה הוא לייצב ולקבל תשואה וטוהרת גבוהות של קומפלקסי חלבונים אנדוגניים עניין לאפיון interactomic 1. מובן כי רשתות דינמיות של שני המתחמים ביציבות ויוצר באורח זמני הקשורים macromolecular, בעיקר המורכבים של חלבונים, לתזמר תהליכים תאיים 2,3. אמנם יש גישות ניסיוניות רבות לזיהוי אינטראקציות בין חלבונים, לכידת זיקה היא בין השיטות בשימוש הנרחבות ביותר עבור בידוד לנתח קומפלקסי חלבונים פיסיולוגיים 4-6. יתר על כן, טכניקה זו יש את היתרון של מניב מתחמי macromolecular כישויות פיזיות, לא רק כנקודות הנתונים מתוך לקריאה; לתועלתו, המתחמים שהושגו ניתן אפוא לשמש שורה של ביוכימיים במורד נוסף, אנזימטי, מבחנים מבניים 7-9. הפרוטוקולים שהוצגו פותחו כמענה לצורך למפות proteiרשתות אינטראקציה n-חלבון ולאפיין מתחמי macromolecular בתפקידים שלהם כמו מולקולות מפעיל של ביולוגיה של התא. הם מפורטים ביחס ויישומם בתאי יונקים הגדלים בתרבית רקמה, אך חלו גם על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות הנתונות tweaks ספציפי למערכת המתאימה.

ההיסטוריה של לכידת זיקה מותחת בחזרה בתחילת המאה עשרים עם הניסויים כרומטוגרפיה immunoaffinity הראשונים - דומה למה שמכונה בדרך כלל בימינו כמו immunoprecipitation (IP) - המופיע בספרות על ידי 1950 המוקדמים. השימוש המרכזי של הטכניקה פיתוח נוסף באמצעות תורו של המאה הזו ועד 10-13 הנוכחי. תאים שונים ומחקרים ביולוגיים מולקולריים יש ניצלה שבירים מכאנית של תאים על ידי כרסום בקירור במשך לפחות בארבעים השנים האחרונות 14-19; והפרדות מולקולריות ניצול (סופר) חרוזי פאראמגנטיים יש BECשת נפוץ יותר ויותר במהלך שני העשורים האחרונים 20. שילוב טכנולוגיות שונות אלה שמש כדי לשפר את תוצאות בסינרגיה שניתן להשיג בניסויים לכידים זיקת חלבון מורכבת 1, כפי שמעיד גוף נרחב של עבודות שתיכתבנה על ידי עצם וקהילת המחקר הרחבה יותר 7,9,11,18,19,21 -23. תוצאות תמיכה מוצגות באיור 1.

אוסף של אזהרות ושיקולים החלים על ביצוע ניסויים לכידת זיקה אפקטיבית ניתן למצוא התייחסות 1. בדרך כלל גישה זו היא המתאימה ביותר כדי: (I) לקטלג את interactors של חלבון של עניין, כלומר, להשתמש ספקטרומטריית חלבון מסה (MS) כדי לזהות חלבונים copurifying עד כה לא ידוע (ניתוח גישוש); (II) assay עבור נוכחות של שותף מתנגשות מסוים, כלומר, להשתמש ב- MS או כתם המערבי כדי לזהות חלבון מסוים או קבוצה מוגבלת של חלבונים חשוד בteract עם החלבון של עניין (בדיקת השערות); או (III) להכין קומפלקסי חלבונים מורכבים באופן אנדוגני המכילים את החלבון של עניין למחקר נוסף על ידי טכניקות נוספות (בדיקות preparative). לפני יציאת משטר ניסיוני לכידת זיקה הוא בהחלט הכרחי כדי להיות מגיב זיקה באיכות גבוהה כי נקשר לחלבון היעד, בדרך כלל נוגדן IP-מוסמכות נגד חלבון מטרת יליד הריבית או נגד תג המצורף חלבון היתוך. זה גם קריטי יש בשיטות של הודעה ניסיונית במקום: מכתים חלבון כללי (כגון כחול Coomassie, Sypro רובי, או כסף, SDS-PAGE הבא), מערבי סופגים, וחלבון של טרשת נפוצה כל נפוץ בשילוב עם לכידת זיקה 1. הפרוטוקולים שהוצגו לנצל חרוזים מגנטיים מצומדות נוגדן כמדיום זיקה. בעוד הפונקציה של מדיום הזיקה ניתן תוקף בתחילה בבדיקות לנצל כמה פרמטרים ניסיוניים, כדילהשיג את התוצאות הטובות ביותר כל ניסוי צריך להיות מותאם באופן אמפירי 1,11,24. הפרוטוקולים מופרדים לשלושה שלבים ייחודיים: (1) הכנת חומר תא קפוא; (2) תא שביר על ידי כרסום מצב מוצק בטמפרטורת קריוגני; ו (3) מיצוי חלבון ו לכידת זיקה באמצעות חרוזים פאראמגנטיים מצמידים נוגדנים.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

קציר Cell 1. והקפאה

  1. לגדול 1-8 גרם של חומר התא באמצעות תנאי culturing המתאימים הקו הסלולרי של עניין 25,26. פרוטוקול זה הוא אופטימיזציה עבור עד 8 גרם של תאים (~ 10 9 תאים), שונה מן 19,27,28 אזכור. בדרך כלל, ~ 5 גרם של תאים HEK-293 או הלה ניתן להשיג משמונה 500 ס"מ 2 צלחות תרבות גדלה ~ 90% confluency.
    זהירות: פרוטוקולים אלה להשתמש בחנקן נוזלי (LN 2), מסוגל לגרום לכוויות קריוגני חמורות. דון ביגוד מגן ואמצעי זהירות וטיפול הולם תרגיל.
  2. יוצקים את מדיום הגידול (פסולת) לתוך מבחנה גדולה.
  3. מניחים את צלחת תרבות על קרח במחבת קרח מלבני גדול.
  4. הוסף 20 מ"ל של בופר פוספט 1x קר כקרח (PBS) כדי בצלחת תרבות לשחרר את התאים מצלחת באמצעות מגרד תא גדול; להעביר את התאים צינור 50 מ"ל, צונן מראש על קרח; להחזיק את הצינור על הקרח.
    הערה: צעדי טיפול עבור כל התא להשתמש סט אלקטרו-פיפטור כדי "נמוך" ו -25 טפטפות מיליליטר כדי למנוע מריחה מוגזמת של תאים במהלך מניפולציות העברה. מסדרים 50 מ"ל צינורות איסוף 1X PBS בתוך דלי קרח לפני שיזם את ההליך.
  5. הוסף 10 מ"ל נוספים של PBS 1x קר כקרח לאותו מאכל. אוספים את התאים הנותרים ולהעביר אותם אל הצינור 50 מ"ל.
  6. חזור על הפעולה עבור כל מנה; מתלי תא מפני מאכלים שונים עשויים להיות משולבים כדי להפחית את מספר המדגם ופסולת פלסטיק.
    הערה: מאחר התאים עצמם לא יהוו חלק גדול מנפח ההשעיה, שלוש צלחות שווות של השעית תא ניתן לשלב שני צינורות 50 מיליליטר. בגלל 50 מ"ל צינורות בעצם להחזיק יותר מאשר הנפח הנומינלי, שמונה צלחות ניתן להפיץ בדרך כלל על פני חמישה צינורות כאלה.
  7. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 1000 XG, 4 ° C.
  8. יוצקים בזהירות את supernatant. Resuspend כל גלולה ב 10 מ"ל קר כקרח 1x PBS. לאחד את resuכדורי spended, עד 5 לכל 50 צינור מ"ל, כדי להפחית את מספר המדגם.
  9. צנטריפוגה 5 דקות ב 1000 XG, 4 ° C.
  10. יוצקים בזהירות את supernatant. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל קר כקרח 1x PBS
  11. הסר את הבוכנה של מזרק 20 מ"ל והנח אותו בצד. הכיסוי או הזרבובית של המזרק ולהעביר את השעית התא אליו.
  12. יש להכניס את המזרק בתוך שפופרת 50 מ"ל ו דקות צנטריפוגות 5 XG ב 1000, C ° 4.
  13. לשאוב supernatant עם טפטפת טיפ נאה מחוברת מערכת מלכודת ואקום עד ממש את השכבה העליונה של תאי מתחיל להישאב. התוצאה היא תא גלולה רטוב.
  14. Uncap המזרק, להכניס את הבוכנה לטפטף את התאים ישירות לתוך מבחנה פלסטיק גדול מלא LN 2, שנערך באמבט 2 LN בקופסת קלקר. בכוח לדרדר את התאים הנותרים מן המזרק.
  15. העברת התאים קפואים 50 צינורות מיליליטר ידי שפיכה. רופף מכסה את הצינורות כדי לאפשר עודף LN 2 להתאדות; להחזיק tשולי לילה ב -80 מעלות צלזיוס. הדק כמוסות מלאות למחרת. התא הקפוא ניתן לאחסן בצורה זו ב -80 ° C עד cryomilling.
    הערה: אל בשר ומהדקת צינורות לפני כל LN 2 התאדו בעליל, אחרת לחץ מופרז עלול לגרום הצינור להתפוצץ. לא לסגור את הצינורות לאחר 2 LN התפוגגו עלול לגרום הצטברות כפור על חומר התאים, הוספת משקל מים עודף ובכך מפחיתים ביעילות את ריכוז החלבון על טחינה.

שיבוש 2. קריוגני של תאים קפואים

הערה: כל הכלים עבור טחינה ומניפולציות צריך להיות מראש מקורר עם LN 2. קנקן קטן יידרש להוספת LN 2 בתוך הצנצנת לשפוך LN 2 מעל צנצנת הכרסום הסגורה. כלי תוצרת בית מוצגים התייחסות 19. כפפות קריוגני יהיה צורך להתמודד עם LN 2 מקורר מנגנון טחינה. הכרסוםמכסים של צנצנות משמשים כאן (ראו טבלה של חומרים) בדרך כלל ספינה עם אטם גומי המותקן; זה יהיה צריך להיות מוחלף עם אטם מכסה זמין מסחרי טפלון לבצע את הפרוטוקול הבא באופן מהימן. זאת ועוד, מאחר לחץ גזי N 2 יכול לבנות עד רמות גבוהות בתוך הצנצנת במהלך טחינה, מומלץ להתקין שסתום לחץ זמין מסחרי 5 בר / 500 kPa כאמצעי זהירות שחרור בטיחות 28.

  1. הסר חרוזים תא מהאחסון -80 ° C ולהחזיק בעל שפופרת 50 מ"ל באמבט 2 LN.
  2. טרום לקרר את צנצנת 50 מ"ל, שני 20 כדורים מ"מ, ומכסה בתוך דלי קרח מלבני נקי המכיל LN 2. טרום לקרר את מבודדת polytetrafluoroethylene (PTFE) אם באמצעות אחד; או מפורט של pucks (ראה אסמכתא 27), או שרוול-ו-דיסקוס (ראה איור 2). קירור טרום יושלם כאשר הרותח האלים של מרגיע LN 2.
  3. משקל נגד מתאים נקבע עלטחנה.
    הערה: זה יהיה שווה למסה של הצנצנת, מכסה צנצנת, כדורי הכרסום בשימוש, ואת כמות התאים שתתווסף הצנצנת. אם כל מבודדים PTFE משמשים, המסה שלהם יש לכלול גם. אנו ממליצים הקלטת ההמונים של הצנצנת, המכסה, וכדורים (והמסה המשולבת שלהם, לרבות כל מבודדת בשימוש) מראש ורישומם על גבי גיליון מידע מאוחסן ליד הטחנה.
  4. בעזרת מלקחיים, במקום שני הכדורים כרסום מראש מקורר 20 מ"מ והתאים קפוא בתוך צנצנת טחינה מראש מקורר.
    הערה: בשל הפסדים קטנים של חומר על משטחי צנצנת כדור במהלך טחינה, אחוז עליות חומר התאוששו כמו הגוש של תאים הסתובב עליות. על ידי השיטה המתוארת, הפסדים מהותיים מאוד צנועים, להיות בסדר גודל של ~ 0.3 גרם משקל תא רטוב (WCW). ההנחיות של היצרן לציין את הנפח המרבי של מדגם טעון צריך להיות ~ 1/3 של נפח צנצנת. 29 ההיקף הכולל של הכדורים צריך להיות ~ 1/3 ו rמקום פנוי emaining ~ 1/3 הוא לתנועה חופשית של כדורים.
  5. להוסיף LN 2 לצנצנת עד ~ ½ מלא, לשים את המכסה על הצנצנת ולהעביר את ההרכבה לטחנה.
    הערה: ראשית להתקין את המבודדת בוחר אם להשתמש באחד.
  6. הצמד את הרכבת במקום ולבצע שלושה מחזורים של כרסום באמצעות התכנית הבאה: 400 סל"ד, 3 דקות, לעשות פעולות של סיבוב כל דקה, ללא הפסקת מרווח. מצננים את צנצנת טחינה עם LN 2 בין כל מחזור.
    הערה: במהלך כרסום רעש קרקוש ברור מופק כמו הכדורים מתנגשים בתוך צנצנת תנועת כוכב לכת. אם צלילים אלו אינם נשמעים, כרסום אינו מתרחש. לסיים את מחזור הטחינה, לא לספור את המעגל הזה, להעביר את הרכבת הצנצנת חזרה LN 2 ולבחון את תכולת הצנצנת. ודא שלא הקרח יצר ואם יש לו, לגרד אותו מן הקירות צנצנת עם מרית מראש מקורר. התחל שוב משלב 2.5.
    אם אתה משתמש לא pucks מבודד או המבודד, להזיז את הרכבת הצנצנת חזרה LN 2 בין מחזורי מחדש מגניב ולהוסיף LN 2 עד ~ ½ מלא בכל פעם. LN 2 הוסיף יתאדה בתוך הצנצנת ככל שהטמפרטורה של עליות הצנצנת במהלך טחינה. התוצאה היא לחץ הצטברות בתוך הצנצנת. לכן, כאשר מתנתקים הצנצנת מן הטחנה, שחרר את המהדק מאוד לאט. אם המהדק הוא שוחרר במהירות, תא אבקה עלולה להימלט עם ירידת לחץ מהיר. שחרור איטי של המהדק מאפשר לחץ להימלט מהצנצנת בצורה עדינה, מבוקרת, ומונע איבוד חומר תא. הבריחה העדינה של גזי N 2 לעתים קרובות יכולה להישמע שריקות כמו המהדק משתחרר לאט - זה נורמלי.
    אם אתה משתמש מבודד דיסקוס-ו-שרוול, הרכבת הצנצנת ניתן להשאיר טחנת LN 2 הוסיף אל המכלול המבודד / צנצנת באתרו.
  7. הזז את הצנצנת חזרה LN 2, ולתת לנוח לרגע להתקרר. אם אתה משתמש מבודד דיסקוס-ו-שרוול, הצנצנת ניתן להסיר מן השרוול wה- i בעזרת שני שפכטלים, מתן מינוף צידיו. לאחר צנצנת נח LN 2, להסיר את המכסה בזהירות, להסיר את הכדורים באמצעות מלקחיים, ולהעביר את אבקת לצינור מראש מקורר 50 מ"ל בעזרת מרית מראש מקורר. הוספת LN מעט 2 לצנצנת / האבקה הפתוחה יכול לעזור כדי לסלק אבקה כי הוא מכוסה על הכדורים, לפני הוצאתם.
    הערה: לאחר הצנצנת נפתחה, להוסיף כמות קטנה של LN 2 אליו לפני הסרת הכדורים. זה יעזור לשחזר אבקת נקרש על משטחים. אבקת התא צריך שיתקיים ב -80 מעלות צלזיוס או מתחת עד השימוש. מניסיוננו, אבקת תא ניתן לאחסן בדרך זו, למעשה ללא הגבלת זמן, מבלי להשפיע על הביצועים.

3. לכידת זיקה של קומפלקסי חלבונים מתמציות ניידות

הערה: הפרוטוקול הבא מיישמת תקשורת זיקה מורכבת ליגנד זיקה, פיתיון, או נוגדן כי אינטראקציה עם החלבון של עניין, שיתוףupled כדי מיקרון בקנה מידה חרוזים פאראמגנטיים. אלה יכולים להיות מוכנים בתוך הבית 19,30, באמצעות ערכות זמינות מסחרי, או שנרכשו ריאגנטים מן המוכן.

  1. הכנת תמצית תא
    הערה: בעת טיפול בתא אבקה, לזכור להשתמש בכלים וצינורות מראש מקוררים עם LN 2. צינורות המכילים את תא האבקה תמיד צריכים שיתקיימו ב LN 2 כאשר לא ב -80 מעלות צלזיוס. מניחים את הצינור 50 מ"ל (ים) המכיל אבקת תא מתלה צינור, במיכל קלקר עם LN 2.
    1. תשקול 100 מ"ג של אבקת תא לתוך צינור microfuge 1.5 או 2 מיליליטר.
      הערה: ראינו כי כמות זו של תאים הוא נקודת התחלה טובה, כי בדרך כלל תניב את חלבון המטרה של עשרות עד מאות ננוגרם נע לאחר לכידת זיקה חלבון הביע בינוני (~ 50 מסה kDa, נוכח אלפי עותקים לכל תא), מתוך הנחה כי יעילות מיצוי כיבוש היעד הם ≳70%. תשואות אלו מספקות עבור visualiz ישירהation של השבר מטוהרים על ידי SDS-PAGE ו מכתים חלבון.
    2. משקל אנליטי טרה עם צינור microfuge ריק. לוותר אבקת התא לתוך צינור באמצעות LN 2 מקורר כף או מרית. בדוק את המסה של האבקה לוותר בתוך צינור על משקל אנליטי.
      הערה: כדי להקל על השקילה מתוך אבקות תא, כפות מדידת נפחית קטנות עשויות לשמש. אלו נמצאו לתת תוצאות לשחזור (ראה אסמכתא 19). מצאנו תוצאות הטובות ביותר באמצעות בורג מכסה או 'נעילה בטוחה' צינורות microcentrifuge. לחץ מ מתאדה LN 2 שעשויים להיכנס הצינורות יכול לגרום צינורות microcentrifuge סטנדרטיים פופ לפתוח במהלך ההתחממות הבאה רק לפני התוספת של פתרון החילוץ - וכתוצאה מכך לגרום פסד של המדגם.
    3. פתח הצינור (או לשחרר-מתברג) עם אבקת תא ולתת לעמוד ב RT עבור 1 דקות. זה ישחרר לחץ בתוך הצינור ולמנוע את ההקפאה המיידית של החילוץפתרון כאשר מתווסף האבקה. אין הפשרה הוא ציין במהלך דגירת 1 דקות זה.
    4. להוסיף 400 μl של extractant השלים עם מעכבי פרוטאז ו מערבולת בקצרה, ולאחר מכן חזק על קרח בזמן שימשיך לשלב 3.1.5. דוגמאות צריכות שתתקיימנה על קרח בין כל המניפולציות הבאות, עד elution.
      הערה: ההרכב הטוב ביותר של extractant יהיה תלוי מורכב החלבון (es) להיטהר. כמה הנחיות כלליות מסופקות בלוח 1 והאסמכתאות תומכים.
    5. השתמש ultrasonicator microtip לתת המדגם דופק אנרגיה נמוכה קצר לפזר כל אגרגטים. (Ultra) sonicate עם 4 פעימות (2 שניות כל אחד, 2 א '; כ 15-20 J מהאנרגיה הכוללת).
      הערה: vortexing מחלק את האבקה לתוך התא extractant, אבל בהתאם לאופי הפתרון, אפשר לראות כמה אגרגטים. מצאנו כי פיזור אגרגטים אלה מספק את התשואה הטובה ביותר במהלך לכידת זיקה שלאחר מכן. Microtip קצרה סוניקטיון בקלות מפזר אגרגטים אלה. הפתרון צריך להופיע חצי שקוף אבל הומוגנית, ללא אגרגטים ברור. sonicators באמבט מים נוטה להיות צריכת חשמל נמוכה מדי לפזר אגרגטים כזה ביעילות ללא זמני טיפול מדגם ארוכים משמעותי, אך הוא עשוי להיות מתאים עם הגדרות מתאימות.
    6. להבהיר את תמצית ידי צנטריפוגה (למשל, 20,000 XG, 10 דק ', 4 ° C).
      הערה: aliquot של תמצית התא הבהיר עשויה להישמר להשוואה לתוכן של הגלולה, supernatant ללכוד שלאחר הזיקה, ואת השברים המתקבלים לאחר elution ממדיום הזיקה כדי לקבוע את היעילות של מיצוי לכידתו של חלבון המטרה , למשל, על ידי כתם המערבי (ראה דיון).
    7. הסר את supernatant (תמצית מזוקקת) והמשך כיבוש הזיקה.
      הערה: הגלולה עשויה להיות מחדש חילוץ במאגר טעינת מדגם SDS-PAGE ב 70 מעלות צלזיוס על מנת לקבוע את מידת שחרורו של ד חלבון המטרהuring החילוץ הלא denaturing הראשוני בהשוואת התמצית שהושגה בשלב 3.1.6.
  2. לכידת זיקה
    1. כביסה מוקדמת מדיום הזיקה המגנטי. ניתן לעשות זאת תוך תמציות התא נמצאים centrifuged.
    2. מניחים את הצינור (ים) על המגנט. החרוזים יצטברו על הצד של הצינור בתוך שניות, המתיר את פתרון האחסון שיש להסירו.
    3. הוסף 500 μl של פתרון חילוץ חרוז. בקצרה תערובת מערבולת במהירות בינונית (מספיק כדי resuspend). Pulse-לסובב את הצינורות בצנטריפוגה-מיני לאסוף את כל התוכן לתחתית. במידה ותעשה זאת מבטיחה את שריד מינימום של פתרונות. מניחים צינורות על המגנט לשאוב את הפתרון.
      הערה: מדיה מגנטית עם מאפיינים ייחודיים זמינה ממגוון רחב של ספקים מסחריים. התוצאות עשויות להשתנות בהתאם מאפיינים אלה, כולל חרוז גודל, אחידות, ציפוי פני השטח, וכימיה צימוד נוגדן. Side-by-סיניסויי דה ביישום שלך מומלצים לפני שהתיישב על ריאגנט ברירה.
    4. ליזום את לכידת זיקה על ידי העברת תמצית התא הבהיר לצינור מ"ל 1.5-2.0 המכיל בינוני זיקה מראש שטף מערבולת בקצרה resuspend.
    5. דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C עם ערבוב עדין רציף על גלגל מסובב; החרוזים צריכים להיות מושעים במשך הדגירה.
    6. Pulse-לסובב את הצינורות בצנטריפוגה-מיני לאסוף את כל התוכן לחלק התחתון של הצינור. לשאוב supernatant ולשטוף את החרוזים שלוש פעמים עם 1 מ"ל של תמיסת מיצוי קר כמתואר בשלב 3.2.3. מניחים את הצינורות על המגנט. הסר את הפתרון. המשך להוסיף את הפתרון הבא וחזור. במהלך לשטוף 2 nd, להעביר את חרוזי פתרון לשטוף יחד לצינור microfuge טרי ידי pipetting. פעולה זו מפחיתה זיהום מדגם, בנקודת elution, על ידי חלבונים אקראיים שנספחו הקירות של הצינור משמשים דגירה עם tהוא התא לחלץ. לאחר לשטוף 3 rd, החרוזים צריכים להיות בקצרה סובב דופק בצנטריפוגה-מיני לאסוף את כל התוכן לתחתי. מניח את הצינור בחזרה על המגנט, ולהסיר כל נוזל שיורים. זה מאפשר סר של האחרונים μl של פתרון לפני המשחררים, הבטיחו דגימות eluted תצטרך כרכים אחידים. זה גם מבטיח את elution יהיה יעיל, כפתרון elution לא להיות מדולל על ידי לשטוף שיורית; שאריות כאלה יכולים גם לתרום תופעות מלח לשנות את ההגירה של חלבוני SDS-PAGE (ראה להלן).
      הערה: aliquot של supernatant מחייב רשומה יכולה להינצל להשוואה כדי לחלץ הבהיר שנוצר 3.1.6. על ידי כתם המערבי. התוצאה תציין את מידת הדלדול של חלבון המטרה מתמצית התא.
    7. Elute באופן הילידים או או denaturing; לשקול את האסטרטגיה הטובה ביותר עבור היישום במורד הזרם 1.
      הערה: הפרטים של Strategie elution הילידיםהים יהיה תלוי תג הזיקה בשימוש (ראה דיון). עבור רוב המשתמשים, denaturing elution עם חיץ מדגם SDS-PAGE ואחריו ניתוח של המדגם על ידי SDS-PAGE עם מכתים חלבון 31, תהיה הגישה הראשונית המעשית ביותר.
      הערה: הרכב למאגר המדגם יהיה תלוי במערכת אלקטרופורזה בשימוש. מעבדות רבות להטיל ג'ל טריס-גליצין משלהם, תוך שימוש אלקטרופורזה רציפה ומערכת חיץ Laemmli 32-34. מתכון במאגר מדגם משותף (1x) כולל: 10% (w / v) סוכרוז, 50 מ"מ DTT, 2% (w / v) SDS, 62.5 מ"מ טריס-Cl-pH 8.8, 0.0004% (w / v) bromophenol כחול 31 . אנו ממליצים להכין מלאי 1.1x כי משמיט DTT. 1/10 ה בהיקף של 500 מ"מ DTT אמור להתווסף המדגם לפני SDS-PAGE (ראו להלן). רבים זמינות מסחרי מערכות SDS-PAGE זמינות גם; אלה עשויים לכלול מאגרי מדגם ספציפי למערכת.
    8. הוסף חוצץ מדגם SDS-PAGE ללא צמצום סוכן (כדי להקטין את שחרורוחלק מרשתות נוגדן מן החרוזים) דגירה למשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה.
      הערה: זה יפריע רוב האינטראקציות מבוססות זיקה, משחרר את החלבונים שנתפסו לתוך supernatant. אינטראקציות נוספות מתמשכות עשויות להפיק תועלת הטמפרטורה גבוהה לשחרור (בדרך כלל 70 ° C מספיקה).
    9. לאסוף ולשמור את supernatant. דוגמאות עשויות להיות קפוא ב -20 ° C עבור אחסון קצר (מספר ימים) או -80 מעלות צלזיוס לאחסון ממושך עד רצוי ניתוח.
    10. נושא דגימות SDS-PAGE ואחריו מכתים חלבון באמצעות טכניקות סטנדרטיות 31. טרשת נפוצה עלולה לשמש כדי לאפיין מדגם רכב 1. להקות חלבון בודדות ניתן ניכרו לצורך זיהוי או המדגם כולו עשוי להתאפיין ניתוח יחיד על ידי electrophoresing המדגם רק בקצרה (4-6 מ"מ לתוך הג'ל) ועיבוד כל החלבונים במדגם יחד כ 'תקע ג'ל. "
      הערה: הוסף DTT לפני initiaאלקטרופורזה טינג. במידה ואתם מתכננים להמשיך MS, דגימות עשויות להיות alkylated לאחר אלקטרופורזה 35; עם זאת, הוא לעתים קרובות יותר נוח alkylate לפני אלקטרופורזה 36.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

איור 1, לוח הקלט ממחיש כי cryomilling וחרוזים מגנטיים יכולים לעבוד יחד כדי לשפר את איכות המדגם. לוחות IA-C להוכיח כי החומר המרכיב את המדיום מסיס המשמש ללכידת זיקה יכול להשפיע על proteome התאושש 19. החלבון של עניין, phosphatase אלקליין חיידקי FLAG-מתויג מטוהרים (BAP), היה זינק לתוך תמציות תאים אנושיים. BAP אינה צפויה אינטראקציה ספציפית עם copurify חלבונים אנושיים. החתימה של חלבונים copurifying, נשפט על ידי SDS-PAGE ו Coomassie מכתים, מגוונים בהתאם המדיום בשימוש. מיקרון בקנה מידת חרוזים מגנטיים הראו את הפרופיל הנקי, מה שמעיד על רמה נמוכה יחסית של חלבון ספיחה הלא ספציפית. מזהה פאנלים ו- IE להמחיש כי שיטת תמוגה התא יכול גם להשפיע על proteome התאושש. בדוגמה בתנאי, תסביך חלבון אנדוגני (למשנהו מורכבים 37), היה נתון captu זיקהמחדש מתא cyromilled או sonicated תמציות 19. פחות מזהמים גבוהה המוניות נצפו כאשר תמצית התא הופקה מ אבקת תא cryomilled.

אתגר בעת השימוש לכיד זיקה ללמוד קומפלקסי חלבונים אנדוגניים הוא שזה עלול להיות קשה להפלות interactors הפיזיולוגי בתום הלב של החלבון של עניין מן התוצאות חיוביות שגויות (FPS). FPS יכול לנבוע ממקורות רבים, כוללים ספיחה הלא ספציפית כדי צינורות וכלי, מדיום הזיקה, ליגנד הנוגדן או זיקה, ו / או לחלבון של העניין עצמו. כתוצאה מכך, מאמץ משמעותי חייב להיות מוקדש אופטימיזציה של תהליך הצילום. הגילוי של FPS עדיין מהווה אתגר מרכזי עבורו מספר רב של כלים שונים פותח, כולל ניסוי 38-40 חישובית גישות 41-43, כל אחד עם יתרונות וחסרונות שונים. בניסויים שלנו אנחנו קודם לכן ציינו דפוס של Fחלבון P כריכה המתקבל לאחר הדגירה של מדיום מגנטי α-FLAG עם תמציות תאים בלתי מבוקרים, כי היה נבדל הדפוס שהושג בנוכחות-tagged חלבוני 3xFLAG. יתר על כן, FPS אלה יוכל להשתחרר מן המדיום ידי הדגירה עם 3xFLAG פפטיד 7. תצפית זו עולה בקנה אחד עם אופורטוניסטים עקדת FPS אל paratope-FLAG α בהעדר של epitope מאותו מקור. הבנת מהות רקע FP זה חשוב מאחר ומחקרים רבים להשתמש "שורת תא הורית מתויגת כביקורת מדומה עבור לכידת זיקה; בקרות אלו עשויות להיות ראויים לקבוע את הספציפיות של אינטראקציות עם החלבון המתויג. כדי לקבוע את רקע כריכה שנתרמה על ידי בינוני הזיקה שלנו כאשר paratopes נוגדן תפוס או לא, ערכנו ניסויים לכידי זיקה מדומה באמצעות מדיום מגנטי-FLAG α ותמציות תא HEK 293T (לא חלבון מתויג הביע) בנוכחות או בהעדר 3xFLAGספייק בפפטיד. התוצאות מוצגות באיור 1, פאנל II. בקצרה, בינוני מגנטי-FLAG α הודגר תמציות התא (של ≳10 מ"ג / החלבון הכולל מ"ל) המכיל 500 mM NaCl ו 1% v / v טריטון X-100 ב 20 מ"מ HEPES-Na pH 7.4 למשך 30 דקות. המדיום הודגר אז עם 1 מ"ג / מ"ל ​​פפטיד 3xFLAG לעקור כל החלבונים תחרותי מאוגד paratope α-FLAG מקורי או עם חיץ מדגם SDS-PAGE כדי להשיג elution denaturing. בנוסף, את אותו הניסוי בוצע כאשר תמציות התא היו מתובל 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו -10 מיקרוגרם / מ"ל ​​של הפפטיד 3xFLAG. כל שברי eluted היו נתוני SDS-PAGE ו מכתים כסף. הבחנו כי בהעדר epitope מאותו המקור שלה, בינוני α-FLAG אין ללכוד ברמה לגילוי של חלבוני רקע שניתן eluted עם פפטיד 3xFLAG - בדוגמא שמספקת איור 1-II, זן דומיננטי נצפה בין 37 ו 50 kDa. דפוס eluted עםSDS-PAGE חיץ המדגם היה דומה, עם מינים בולטים נוספים. עם זאת, בנוכחות פפטיד 1 מיקרוגרם / מ"ל ​​3xFLAG, FP מחייב למדיום זיקה חוסל אל מתחת לרמה של איתור לא נצפתה באחד משני שברים elution יליד או denaturing. תוצאה זו מרמזת כי paratopes נוגדן הפנוי יכול להיות מופקר בהעדר epitope מאותו המקור שלהם התרומה משמעותית proteome שהושג במהלך לכידת זיקה אפילו עבור נוגדנים נקשרים epitope שלהם זיקה גבוהה, כמו במקרה של M2 3xFLAG / α-FLAG צִמוּד. כמו כן suggestd כי תנאים מחמירים מאוד באמצעות מלח גבוה, לעתים קרובות נבחר כדי להמתיק את הלא ספציפי מחייב, עלולים להיות לא יעילים בהעדר אינטראקצית אנטיגן / הנוגדן. כדי ומעקב ביצע לנו ניתוח כולל ניסוי דומה על ידי SDS-PAGE וכן כמותית MS (איור. S1). של 347 חלבונים לכמת, צפינו שכל חלבון למעט אחד (דיסקו שוואשיעור מאוד = 1%; S1 טבלה) היה קשור עם חלבון הפיתיון מתויג 3xFLAG לעומת פפטיד 3xFLAG ממוסמר מדגם שליטה. תוצאות אלו מצביעות כי בניסויים שלנו הרוב המכריע של חלבונים ציינו צפויים לשתף לטהר עם החלבון המתויג או מחוץ יעד תוצרי לוואי של paratopes α-FLAG הפנוי. מניסיוננו, אות לרעש גבוהה בתוצאות לכידות זיקה מודגמות ב SDS-PAGE ו מכתים חלבון ידי דפוס דיסקרטי של להקות חדות, שופעות בערך stoichiometric כמו גם מיעוט מכתים רקע מלהקות חוורים אחרות; לדוגמא רבה של עיקרון זה ניתן לראות התייחסות 11.

המניע באמצעות מבודד PTFE (אשר מומלץ) כאשר cryomilling היא להפחית את קצב ההתחממות של צנצנת במהלך טחינה, להקטין את נטל קירור LN 2 חזר במהלך תהליך הטחינה, ולהפחית את מידת קרחהיווצרות בצנצנת. זה הופך לפשוט יותר ביצועי כרסום עקביים מקל על הטיפול של אבקת התא. מבודדת דוגמא ניתן למצוא התייחסות 27 (pucks) ו מתואר באיור 2, להלן (שרוול-ו-דיסקוס).

figure-results-1
איור 1: בחר נציג תוצאות. (I) פאנל זה כבר שונה מההתייחסות 19. Coomassie כחול מוכתם ג'ל SDS-polyacrylamide. (משמאל) חרוזים מגנטי מיקרון בקנה מידה להיראות נמוכים מחוץ יעד מחייב מאשר תקשורת agarose המבוסס. (א) חרוזים מגנטיים; (ב) agarose המסורתית; (C) ברזל ספוג (מגנטי) agarose; כל מצמידים נוגדנים נגד FLAG M2 ו המשמש ללכידת phosphatase אלקליין חיידקי FLAG-מתויג (BAP; שכותרתו) זינק לתוך תמציות המיוצר מתאי cryomilled HEK-293. purifications Agarose המבוססהראה רמות גבוהות יותר של ספיחה שאינה ספציפית (להקות תווית). (מימין) תמציות מיוצרות מתאי cryomilled הלה מפגינים ספיחה מחוץ היעד תחתונה על חרוזים מגנטיים מצמיד נוגדנים מאלה המיוצרים על ידי sonication כאשר נעשה שימוש כדי לטהר תסביך חלבון אנדוגני. LAP-tagged 44 RBM7 היה זיקה שנתפסו באמצעות חרוזים מגנטיים מצמידים נוגדנים אנטי GFP polyclonal לטהר את 19,37 מורכבים הבא (D) חלץ המופק אבקת cryomilled; (E) תמציות המיוצר על ידי sonication של תאים שלמים. הפס השחור האנכי מדגיש אזור של הג'ל שבו interactors הלא ספציפית מסה גבוהה הם נצפו להיות מועשרים במדגם שהכין sonication. החיצים השחורים הצביעו על interactors הספציפי הצפוי (שכותרתו). להקות ציינו ~ 50 kDa במסלולי D ו- E הן המיוחס שרשרות כבדות הלמה IgG. (II) כסף מוכתם ג'ל SDS-polyacrylamide. (Std.) לכידת זיקה מדומה שבוצעה על HEK-293T תא התמציות באופן הסטנדרטי. לאחר לכידת, elution של החומר כבול הושג באמצעות (N) elution הלא denaturing עם 1 מ"ג / מ"ל ​​3xFLAG פפטיד או (ד) denaturing elution במאגר מדגם SDS-PAGE; (PB 1) כפי Std. אבל הפפטיד 3xFLAG נכלל פתרון החילוץ ב מיליליטר 1 מיקרוגרם / לחסום את paratopes-FLAG α על מדיום הזיקה; (PB 10) כמו PB 1 אך בנוכחות של 10 מיקרוגרם / מ"ל ​​פפטיד 3xFLAG. IgG הקשורות להקות פפטיד 3xFLAG מסומנים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-2
איור 2: שרוול-ו-דיסקוס מבודד PTFE. צנצנת PTFE 250 מ"ל מוצג (1). צנצנת טחינה נירוסטה 50 מ"ל (2) מתאים בתוך הצנצנת PTFE (3) ומספקתהזדמנות לעזוב את צנצנת הטחינה המותקנת בתוך הטחנה בין מחזורי. דיסקוס מבודד PTFE עליון (2) משמש בין ההרכבה מהדק ואת מכסה הצנצנת. כדי לקרר את הרכבת הצנצנת מבודדת מותקן (3), LN 2 הוא הוסיף ישירות לתוך הגוף של המבודד, המקיף את הצנצנת. המחזור הבא של טחינה יכול להיות יזם אז. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

מֵגִיב ריכוז מוצע הערות
נתרן כלורי 0.1-0.5 M ריכוזים גבוהים (> 300 מ"מ) נוטים לשפר את המיצוי של חלבון הכולל ולשמור רקע נמוך, אך הוא עשוי להתפשט משם כמה היתר יציב אחרתשחקנים. ריכוזים מתחת 150 מ"מ אינם בדרך כלל יעיל להפחתת הלא ספציפית רקע.
אמוניום אצטט 0.2-2 M מלח, מורכב משני מאגרים, כי תשואות פתרון pH ניטראלי 57. ריכוזים גבוהים יותר לייצב כמה קומפלקסים חלבונים. פתרונות חומציים יכולים לנבוע ישנות, מניות גבישים מאוחסנות כראוי על חשבון הפסד אמוניה. אין חיץ או מלחים pH נוסף נדרש extractants המכיל אמוניום יצטט. ניתן לשלב עם NaCl לווסת התוצאות שהתקבלו.
Tween 20 0.1% v / v חומר ניקוי שאינו יוני 58; בדרך כלל בשילוב עם NaCl.
טריטון X-100 נ 0.5-1% / v חומר ניקוי שאינו יוני 58; בדרך כלל בשילוב עם או NaCl או NH 4 CH 3 CO 2 H
בחורים 5 מ"מ חומר ניקוי zwitterionic 58 </ Sup>; בדרך כלל בשילוב עם NaCl.
Sarkosyl 1 מ"מ חומר ניקוי anionic 58 מפחיתת רקע ויכול לערטל רכיבים מורכבים יציבים, פוטנציאל חושף קישוריות בינארי; בדרך כלל בשילוב עם NaCl.
טריס-Cl 20 מ"מ PK א '8.8 ב 4 ° C, 8.1 במהירות של 25 ° C.
(PH 8.0)
HEPES-Na 20 מ"מ PK א '7.8 ב 4 ° C, 7.5 במהירות של 25 ° C. NaOH או KOH המשמש איזון pH תלוי מלח (למשל, NaCl, KCl, או CH 3 CO 2 K) המשמשים extractant.
(PH 7.4)

טבלה 1: כמה הציע ריאגנטים שימושי לטיהור קומפלקסים חלבונים. l טבלה זוists כמה ריאגנטים שמצאנו שימושי עבור קומפלקסי חלבונים לטיהור מ שורות תאים אנושיות, עם ריכוז עובדים שהציע. ניסוח extractant טיפוסי מכיל חיץ pH, מלח, וחומר ניקוי 1,11,24,45-48. השיטה המומלצת היא לזהות את השילוב המורכב לפחות של ריאגנטים כי מניב את התוצאה הרצויה.

figure-results-3
S1 איור: מערבבים לאחר טיהור (של מיפוי) ניתוח SILAC של תוצאות חיוביות שגויות. I. סכמטי תרשים: בניסוי זה 3xFLAG מתויג ORF2p קומפלקסים חלבונים (לידי ביטוי מתוך pLD401) היו מטוהרים מן כבד-הראש ו שכותרתו אור HEK-293T תאים 7, בהתאמה. התמצית תא שכותרתו האור ומשובץ פפטיד 3xFLAG למנוע לכידת הזיקה של ORF2p 3xFLAG מתויג על ידי עיכוב תחרותי; זה לא צפוי לחסום את הכריכה של חלבונים שעלולים להתרחש-ספציפי שאינוקאלי עם המדיום המגנטי או המבנים הלא paratopic של הנוגדן. לאחר elution מן החרוזים המגנטיים, הדגימות הכבדות וקלות היו טיהור פוסט מעורבת ונותח על ידי כמותית MS (MAP-SILAC 39) כדי לקבוע את החלק היחסי של חלבונים הקשורים מדגם או; פרט מתודולוגיים נוסף ממוקם בטבלה S1. II. כסף מוכתם ג'ל הממחיש כי חומרי האור וכבדים שכותרתו להניב תוצאות דומות (השווה L עם H), וכי הטיהור שנערכה בנוכחות של ספייק-ב 3xFLAG (LI) חלה עיכוב תחרותי. להלן, תקע המוכתם ג'ל Coomassie הכחול G-250 מורכב של H המעורב ושברי LI, לפני ניתוח proteomic מבוסס ג'ל, כמתואר בטבלה S1. אנא לחץ כאן כדי להוריד גרסה גדולה יותר של דמות זו.

לוח S1:MAP-SILAC. גיליון זה כולל את הנתונים שהתקבלו על ביצוע ניסוי MAP-SILAC המתואר בתרשים S1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הטבלה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלושה פרוטוקולים אלה לעבוד במקביל על מנת (1) להכין תאים עבור שבירה של מצב מוצק על ידי cryomilling, (2) להשיג שבירה בטחנת הכדור פלנטרית, ו (3) לייצר תמציות מתא אבקת זיקה לכידת חלבון של עניין מורכב עם interactors הפיזיולוגי אינו רב. רבות בטכניקות שונות תא תמוגה קיימות, כוללים גישות מכאניות / פיסיות העסקת ריסוק השפעה, גז, ו / או לחץ, כמו גם כימיות / גישות האנזימטית, כל אחד עם יתרונות וחסרונות שונים 49,50. חוקר מעודד כל לחקור שיטות המתאימות ביותר עבור הניתוחים שלהם, תוך התחשבות כי כל גישה שנבחרה שבירת תא מיצוי חלבון צפויה להציג הטיות 51,52 המחייב אופטימיזציה אמפירית (ראה להלן). שיטות מכאניות עלולות לייצר חום גבוה ו / או כוחות גז אשר יכול לשבש קומפלקסי חלבונים. Cryomilling ימנע תופעות חימום מכוח העסקת קירור 2 LN של דגימות עבור tמשך הוא של התהליך. טחנות כדור פלנטריים הם הבינו לסמוך על כוחות השפעת החיכוך, כוללים מאמץ גזירה, כמרכיבים של צמצום גודל חלקיקים 53,54. בהגדרות דיווח לא ראינו ניוון של קומפלקסי חלבונים. אכן יש לנו חילוץ והוציא כנראה פגע ~ 50 מתחמי נקבוביות הגרעין מד"א 11 ו enzymatically רטרוטרנספוזון פעיל מפגין פעילות ספציפית גבוהה יותר מאשר ההכנות העסקת 'עדין' מבוסס-דטרגנט תמוגה 7. שיטות כימיות / אנזימטית של תמוגה התא סובלות ההגבלה כי תוכן התא משתחרר לתוך המילייה במבחנה שתומכת שיבוש קרום תא מקרומולקולות מבני אבל לא יכול להיות מתאים תחזוקה של שלמות מורכב החלבון (es ) של עניין. לעתים קרובות, לא המרכיבים של מתחמי הקים עם החלבון של עניין ולא התנאים הדרושים כדי לייצב את מתחמי היעד הםידוע מראש. יתרון עיקרי של כרסום מצב המוצק הוא שבירה והפקה הם זוגיים, המתירים מקור חומר כדי להיות מוכנה ללא נוזל הוסיף, מאוחסן (ב -80 ° C או נמוך יותר), צברה, והוציאה נוח לניסויים על פי דרישה; למשל, לחקור אופטימיזציה בתנאים במבחנה עבור לכידת זיקה. אינטראקציות חלבון יציבות ביותר בריכוז גבוה 55,56, ולכן צמצום היקף extractant יכול להיות יתרון עבור שמירת אינטראקציות פיסיולוגיות. מצד השני, ישנם שיקולים מעשיים - מתחמי החלבון צריכים לעשות כדי להיות למחיצות מתוך התאים לתוך שלב מימי בלתי צמיג, ללא אגרגטים מסיסים, על מנת לערבב את מתחמי היעד עם מדיום הזיקה. יתר על כן, חלק סטנדרטיזציה וביקורת על הסביבה חוץ גופייה (pH, ריכוז מלח, וכו ') דרושות שיטתיות ועל שחזור. אנו מוצאים כי תמציות produced בטווח דילול של 1: 4-1: 9 (w: v) לספק דאגות מעשיות ותיאורטיות, מניב תוצאות איכותיות. בנוסף, שיעור אופטימלי של תמצית התא זיקה לצרכים בינוני שייקבע. הדבר נעשה באופן אמפירי על ידי טיטרציה של תמציות עם כמויות משתנות של מדיום זיקה יכול להיות השפעות לזיהוי על יחס אות לרעש של הניסוי, עוד נדון בהמשך. דלדול מעולה של חלבון המטרה הוא בדרך כלל ≥70% של השבר המסיס של חלבון המטרה, אבל> 90% רצויים ועלולים להיות ברי השגה עם parameterization הזהיר של תנאי חילוץ. שיקולים מעשיים רבים כגון מכוסי התייחסות 1. חרוזי פאראמגנטיים הם מניפולציה באמצעות מגנטי ניאודימיום בבעל צינור מיוחד microcentrifuge, למרות חלופות תוצרת בית הן קיימא. כאשר הניח בתוך מחזיק, חרוזים לאסוף בצד של הצינור תחת השפעת השדה המגנטי. הפתרונות עשויים מכן להסירו מבלי disturbing החרוזים.

מגבלה אחת של פרוטוקול cryomilling שהוצג, פותחת עם טחנת כדור פלנטרית משמשת כאן (ראה טבלה של חומרים), הוא כי כמות מינימאלית של חומר נדרשה טחנה ביעילות לשחזר אבקת תא באמצעות המכשיר הזה (> g 1). כמויות כאלה מתקבלות בקלות עם חיידקים רבים, שורות תאים, ואורגניזמים מודל, וגם לעתים קרובות יכולות להיות מושגת עם רקמות הניכרות מן בחיות מעבדה. עם זאת, שורות תאים מסוימות עשויות להיות מאוד קשות לגדול ברקמות שפע בעלי חיים עשויים להיות נדיר. כמויות של חומר קטנים יותר ניתן הסתובבו וזהוב באמצעות מכשירים אחרים ניצול מכולות קטנות יותר, אם כי באופן פוטנציאלי על ההקרבה של עדינות אבקת מושגת. בנוסף, העלות של מכשירי טחינה מכאניים עשויה להיות יקרה מדי עבור מעבדות כמה. ניתן להשיג Cryomilling באמצעות מספר setups אלטרנטיבה 14-19, כולל, רוב משתלם ביד באמצעות הדברהle וטיח, אם כי יעילות שבירה טיפות באופן משמעותי. פרוטוקולים לכידי זיקה בדרך כלל לשאוף יעילות גבוהה של תמוגה תא כדי להקל מיצוי חלבון מקסימלית לתוך פתרון ומכאן, את מרב פוטנציאל עבור לכידתו של קומפלקסי חלבוני היעד. מצד השני, זה הודגם עבור שמרי שחבור במבחנת תמציות כי תמוגה מקסימלי לא יכולה להשוות עם מקסימאלית בפעילות הביוכימית במבחנת 57,58. אנחנו לא הבחנו בעיות כאלה במערכות בדקנו עד כה, ולכן לא בכוונה להגביל שבירת התא שלנו כאשר cryomilling. אף על פי כן, האפשרות הזאת צריכה לזכור בעת ביצוע אופטימיזציה עבור מבחנים במבחנה האנזימטית. למרות cryomilling היא שיטה יעילה מאוד עבור שבירת תאים, כמות מוגבלת של sonication לעתים קרובות הטבות תמציות תא הומוגנית הייצור כולו מרקמות יונקות כי אגרגטים הומוגניות לפעמים יכולים להיות שנצפו על ידי בדיקה ויזואלית: בדרך כללבתנאי חילוץ באמצעות נמוך עד בינוני מלח (100-300 מ"מ) ניקוי שאינו יוני (נ 0.1-1% / v) ריכוזים. מכיוון שאנחנו ציינו כי הנוכחות של אגרגטים אלה יכול להפחית את התשואה ו / או האיכות הלכידה הזיקה הבאה, אנו שגרתי ליישם sonication לפזר אותם (גם כאשר הם לא נצפו בעין בלתי המזוינת). המצרפים עולים בקנה אחד עם שברי קרום מגובבים, דומים לאלה שדווחו בעבר תמציות מתאי שמרים הסתובבו 58. Sonication משמש גם פרוטוקולים מסוימים גזירה DNA ולשחרר שברי הכרומטין לתוך פתרון, אולם מידת sonication להחיל בפרוטוקול זה לא DNA שבר ניכרת. הזמינות המוגבלת (או העלות הגבוהה) של ליגנד זיקה מעולה או נוגדן נגד חלבון מסוים של עניין עשוי להיות מכשול אחר. מגוון רחב של חומרים כימיים זיקה זמינות מסחרי ניתן למנף כאשר אורגניזם המודל ניתן תיוג גנומית או TRansfection עם וקטורי ביטוי אקטופי, המתירים את הביטוי של חלבונים בעלי עניין כמו התכה-tagged זיקה. עם זאת, בייצור הנוגדנים ונוהגין מגדיל את האפשרות ושניהם נוגדני polyclonal ו חד שבטיים יכולים לבצע מצוין ללכוד יישומי זיקה. שיקולים רבים אלה מכוסים גם ביתר פירוט ביחס 1.

דוגמאות איך שיטת תמוגה תא ובחירת בינוני זיקה יכולות להשפיע על תוצאות הן באיור 1. דוגמאות של השפעות שהפעילו extractants השונה ניתן לראות אזכור 1,11,24. בגלל הפרמטרים של הניסוי אלה ואחרים משפיעים על איכות לכידת זיקה, מה שמקשה להפלות FPS, מאגרים של "proteomes חרוז" ו גישות חישוביות לחסל מזהמים שאינם ספציפיים פותחו כדי לסייע בזיהוי FPS 40-43. אף על פי כן, גישות כאלה רק substitאוטה להכנת מדגם אופטימלי עד רמה מסוימת 59. התבוננות שיטות עבודה מומלצות לאופטימיזציה של הניסוי לכידת זיקה אמפירית תספק דגימות באיכות הגבוהה ביותר עבור ניתוחים במורד הזרם, עוד נדון בהמשך. תרגול מיושם בקלות שיכול לשפר טוהר מדגם הוא elution ילידים. elution Native נמצא דווקא בשימוש תכוף להשיג מורכב החלבון המבודד זיקה, ללא פגע, לניסויים נוספים; אבל כפי שהוא לעתים קרובות משפר טוהר המדגם, זה יכול לשמש גם מטעם זה בלבד. עם זאת, כפי שמודגם באיור 1, פאנל II, היכולת של elution יליד לשפר טוהר המדגם יכולה להיות תלויה על טיטרציה מדויק של כמות בינונית זיקה שפע של חלבון המטרה של תמצית התא - כאשר המדיום הוא העולה , paratopes הפנוי רשאי להתיר ההצטברות מחוץ היעד של חלבוני FP נצפים שברי eluted באופן מקורי. באמצעות ריאגנטים הליכים המתוארים כאן, זה hכמו מנסיוננו, התורם הגדול ביותר של FPS לניסויים שלנו הוא החלבון מתויג עצמו הסיר פעם מההקשר של התא החי. (איור. 1.II ו איור. S1). במקרים כאלה, שולטת שורת תאים ההורית שמניבות proteomes רלוונטי בהעדר האנטיגן להן כל ערך מעשי; גם לגבי תג בלבד או ספייק בבקרות שהן ריקות פרט האנטיגן היעד. לכן, בכל פעם המעשית אנו מקיימים I-DIRT 7,38, אשר ישירות מודד את ההצטברות של אינטראקציות חלבון שלאחר תמוגה באמצעות MS כמותית. כאמור בשלב 3.2.7 של הפרוטוקול, נהלי elution היליד ישתנו עם הפרטים של מערכת הזיקה בשימוש. elution Native מושג לרוב על ידי עקירה התחרותית של שסע החלבון מורכב או פרוטאוליטים המתויגים של התג, שחרור במתחם ממדיום הזיקה. מערכות זיקה כמה מורכבות תגי epitope קטנים קיימות, for שבו epitope עצמו זמין כמו פפטיד שימושי עבור elution התחרותי של קומפלקסי חלבונים מתויגים 60. כמו כן, כמה פרוטאזות זמינים לדבוק אתרים מאותו מקור ספציפי במיקום אסטרטגי זיקה מתויג חלבונים היתוך 61. תלוי את הפרטים של מערכות זיקה נבחרו, את ערכת elution המתאימה ניתן לאמץ.

באופן כללי, את איכות התוצאות שהתקבלו תושפע באופן משמעותי על ידי איכות הכנת המדגם. חשוב לעבוד בזהירות ובדייקנות בכל שלב ושלב של פרוטוקולים אלה, במהירות האפשרית, תוך שמירה על טיפול ודיוק. מומלץ לעקוב אחר חלוקת החלבון של עניין בכל שלב ושלב כדי להבין את היעילות של כל מניפולציה. לדוגמא: איך שופע הוא החלבון של עניין התא או רקמה מדובר? אולי החלבון נחקר (והמכלולים שלה) יהיה מאתגר לאפיין על ידי המוניספקטרומטריית בשל שפע נמוך. אם מתחמי המטוהרים ניתנים לזיהוי על ידי מכתים חלבון כללי (כ ננוגרם הטווח), ספקטרומטריית מסה עשויה להצליח. אם החלבון של עניין שנתפס ניתן לאבחון רק על ידי מערבי סופג chemiluminescent משופרת רגיש (טווח picogram כ), ספקטרומטריית מסה היא פחות סיכוי להיות יעיל. גם אם החלבון של עניין הוא שופע בתא, איך בשפע נמצא ב תמצית התא מיוצר? האם המחיצה חלבון לפתרון או שמא המטרה היא גלולה? אם האחרון, פתרון חילוץ חדש ניתן המציא שעשויה לשפר את ההתאוששות. לאחר תמצית התא משולבת עם מדיום הזיקה, איך ביעילות הוא החלבון בשבי? האם החלבון אבל מחובר לנצח באמצעות השטיפות הבאות? מה לגבי חלבונים copurifying אחרים? על ידי שמירת aliquot של כל דגימה על צעדים מתאימים לפרוטוקול השאלות הללו ניתן לענות בקלות, בדרך כלל על ידי מערבי סופג נגד החלבון של ענייןאו מכתים חלבון בכלל, אבל מבחני אחרים עשויים גם להיות מתאים. אופטימיזציה כל צעד תשפר את התשואה וטוהרת של מתחמים שנתפסו, אם כי ייתכנו trade-off להתבצע למקסם תכונה זו או אחרת.

יישום טיפוסי של לכידת זיקה חוקרת רבים הוא לזהות מועמד interactors vivo עבור מספר קטן של חלבונים בעלי עניין; אלה מועמדים חשופים בדרך כלל אימות על ידי גישות מאונכות in vivo כדי להדגים את המשמעות הביולוגית של interactors הפיסית. לכידת זיקה מועסקת גם על ידי מחקרי תפוקה גבוהה כדי ליצור רשימות של copurifying חלבונים שנצפו על בסיס (כמעט) proteome-רחב, דבר המקל על היקשים חישובית בנוגע משוער מתחמי vivo. דוגמאות רבות של מחקרים כאלה ניתן למצוא בספרות. גישה זו מוותרת אופטימיזציה של התנאי ללכוד עבור כל מטרה שניתן לטובת אדם לחקורמטרות y; ככזה, מתחמי מוסק עצמם בקושי מאוחזרות במלואו ללא פגם טהור מאוד בכל במדגם נתון. במקום זאת, החפיפה חלקית בקומפוזיציות נצפו בין דגימות זיקה שנתפסה ברורים רבים משמשת כבסיס של ההיקשים 42. שתי הגישות לתרום נתונים חשובים להבנתנו של interactome. אף על פי כן, אחד יתרונות גדולים של לכידת זיקה הוא שזה לעתים קרובות מציע את ההזדמנות להשיג את מתחמי שלמים נקיים במיוחד, ובלבד נעשים מאמצים כדי לייעל את ההליך. אנו מאמינים כי העתיד של הגישה טמון בהגדלת הקלות והיעילות של אופטימיזציה של לכידתו של קומפלקסים חלבונים אנדוגניים 11 עבור הערכה מדויקת יותר של מכלול interactors פיזיולוגיים שימוש תכוף יותר ביוכימי נוסף במורד הזרם, enzymological, ומחקרים מבניים, למשל, מפנה 7,9,23.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים פרופ 'בריאן טי חייט עבור ייעוץ, תמיכה שלא יסולא בפז שלו, וגישה למתקני בקרה-מדידה MS, כמו גם גב' קלי ר מולוי לקבלת תמיכה טכנית מעולה. אנו מודים לגב 'קלי Bare לתמיכה עם עריכת עותק. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH מענקים P41GM109824, P41GM103314, ו P50GM107632.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אמצעי גידול וכלי תרבית תאיםלייצור תאים קפואים (I)
500 ס"מ2 כלי תרביתקורנינג431110לייצור תאים קפואים (I)
גדולה (1-2 ליטר)לייצור תאים קפואים (I)
מחבת קרח מלבנית פישר סיינטיפיק 13-900-747לייצור תאים קפואים (I), & cryomilling (II)
תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)לייצור תאים קפואים (I)
מגרדי תאים גדוליםפישר סיינטיפיק 08-100-242לייצור תאים קפואים (I)
חנקן נוזלי לייצור תאים קפואים (I), קריוטלינג (II) ולכידת זיקה (III)
50 מ"ל צינורות חרוטייםקורנינג352098לייצור תאים קפואים (I), וקריומילינג (II)
20 מ"ל מזרקלייצור תאים קפואים (I)
מכסי מזרק נעילת לורwww.dymax.comT11182לייצור תאים קפואים (I)
בקירור צנטריפוגהלייצור תאים קפואים (I)
מתלה צינור 50 מ"ל, 4 מצביםלייצור תאים קפואים (I), קריוטלינג (II) ולכידת זיקה (III)
קופסתלייצור תאים קפואים (I), קריוטלינג (II), ולכידת זיקה (III)
טחנת כדור פלנטרית, PM 100 רטש20.540.0001 עבור כרסום בהקפאה (II)
צנצנת כרסום נירוסטה, 50 מ"ל Retsch01.462.0149עבור כרסום קריוטלינג (II)
כדורי כרסום מנירוסטה, 20 מ"מ Ø  Retsch05.368.0062עבור כרסום קריומינג (II)
אטם מכסה: אטם אנרגטי קפיץ עטוף PFA, 2.62 מ"מ 44.63 מ"מ   www.marcorubber.comT1044-2.62x44.63לקריקן קריוטלינג (II)
mini-LN2קנקן תוצרת ביתראה אסמכתא 19לקריות (II)
250 מ"ל מבודד צנצנת PTFE (אופציונלי)תוצרת ביתאוניברסיטת רוקפלרלהקפאה (II); ניתן לייצר על ידי חנות המכשירים לפיזיקה של אנרגיה גבוהה של אוניברסיטת רוקפלר, או לתכנן שרטוטים, על פי בקשה
מבודד פאק PTFE (אופציונלי)תוצרת ביתאוניברסיטת רוקפלרלהקפאה (II); ניתן לייצר על ידי חנות המכשירים לפיזיקה של אנרגיה גבוהה של אוניברסיטת רוקפלר, או לעצב שרטוטים מסופקים, על פי בקשה.
שסתום הפגת לחץ 5 בר/500 kPa (אופציונלי)שסתום סימון מסדרת http://www.leeimh.com/ 558לקריוטמילינג (II)
צינורות מיקרופוגהללכידת זיקה (III)
מחלץללכידת זיקה (III)
טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז ללא EDTA מלאות 11873580001Roche Applied Scienceללכידת זיקה (III)
מערבלללכידת זיקה (III)
דליללכידת זיקה (III)
סוניקטור מיקרוטיפ, Q700QsonicaQ700ללכידת זיקה (III)
בדיקה מיקרוטיפ בעוצמה נמוכה 1/16 אינץ'Qsonica4717ללכידת זיקה (III)
מיקרוצנטריפוגהמקוררת על ספסלללכידת זיקה (III)
Dynabeads M-270 אפוקסיתרמו פישר14302Dללכידת זיקה (III)
נוגדנים או ליגנד זיקה בשילוב עם Dynabeadsתוצרת ביתללכידת זיקה (III); ראה הפניה 19
מסובב לדוגמא ללכידת זיקה (III)
מגנט ניאודימיוםLife Technologies123-21D ללכידת זיקה (III)
מאגר דגימה SDS-PAGE (ללא חומר מפחית)ללכידת זיקה (III)
DTTללכידת זיקה (III)
SDS-PAGEללכידת זיקה (III)
ג'לללכידת זיקה (III)
כתםללכידת זיקה (III)
נעילת לואר קלקר 1.5-2 מ"ל מערבולת קרח מערכת SDS-פוליאקרילאמיד חלבון

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -Y., Ke, A., Wang, H. -W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. 0 (0), 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells. , John Wiley & Sons. (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Basic Cell Culture Protocols. 946, Humana Press. (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. , 1–3at Retsch GmbH. http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/ (2014).
  30. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  31. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  32. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  33. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  34. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A. N., Padovan, J. C., Zhang, W. MALDI Sample Preparation. , Available from: rockefeller.edu at http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html (2006).
  37. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  38. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  39. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  40. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  41. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  42. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  43. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  44. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1(2005).
  45. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839(1999).
  46. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  47. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  48. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  49. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  50. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  51. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  52. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679(2016).
  53. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  54. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201(2012).
  55. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345(1982).
  56. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  57. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, City of Hope. (2003).
  58. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , Retsch GmbH. (2005).
  59. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  60. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  61. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תיקון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 1/20/2017. Citeable Link.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:

  1. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  2. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  3. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  4. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  5. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  6. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  7. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  8. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  9. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  10. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  11. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  12. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  13. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  14. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  15. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  16. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  17. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  18. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  19. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  20. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  21. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  22. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  23. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  24. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  25. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  26. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  27. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  28. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
  29. Williams, R. J., & Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911–1912 (1932).
  30. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).
  31. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  32. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  33. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  34. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).

to:

  1. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1–3at <http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/> Retsch GmbH (2014).
  2. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  3. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  4. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  5. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  6. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  7. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  8. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  9. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  10. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  11. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  12. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  13. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  14. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  15. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  16. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  17. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  18. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  19. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  20. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).
  21. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  22. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  23. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  24. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  25. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  26. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  27. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  28. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  29. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  30. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  31. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  32. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  33. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).

תגיות

מאמרים קשורים