אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחיקת ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בניתוח של תפקוד גן. אחת השיטות היעילות ביותר לשבש גנים באופן ממוקד הוא החלפת הגן כולו עם סמן לבחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגי. במהלך הומולוגי, חילופי DNA מתרחשים בין רצפים עם דמיון גבוה. לכן, רצפי הגנום ליניארי איגוף גן מטרה ניתן להשתמש כדי לכוון סמן לבחירה במיוחד לאתר אינטגרציה הרצוי. קצוות בלאנט של לבנות את המחיקה להפעיל את מערכות תיקון דנ"א של התא ובכך לקדם אינטגרציה של המבנה או דרך רקומבינציה הומולוגי או שאינו הומולוגיים סוף-שהצטרף. באורגניזמים עם הומולוגיים יעילים, שיעור מחיקת גן מוצלח יכול להגיע ליותר מ -50% ביצוע אסטרטגיה זו מערכת שיבוש הגנטי יקרה. פטריית התועבה Ustilago maydis היא מיקרואורגניזם מודל אוקריוטים מראה recombinat הומולוגי יעיל כזהיוֹן. מתוך שלה על 6,900 גנים, רבים מתאפיינים תפקודי בעזרת מוטציות מחיקות, וחזר על כישלון נקודות ניסיונות החלפת גן על תפקוד חיוני של הגן. האפיון הבא של תפקוד הגן על ידי תיוג עם סמני ניאון או מוטציות של תחומים ניבאו גם מסתמך על חילופי דנ"א באמצעות רקומבינציה הומולוגי. כאן, אנו מציגים את U. דור אסטרטגית זן maydis בפירוט באמצעות הדוגמא הפשוטה ביותר, את מחיקת הגן.
מבוא
Ustilago maydis היא פטרייה מודל phytopathogenic כי נחקרה בהרחבה במשך עשרות שנים 1,2. היא קיימת בשני מורפולוגיות, שלב שמרים דמוי, שאינם פתוגניים וטופס filamentous, זיהומיות 3. תגליות פריצת דרך יוניברסל כגון מנגנוני רקומבינציה ותיקון DNA הומולוגיים נעשו בשלב הגדילה דמוי השמרים של פטריית 4 זו. יתר על כן, בורר מורפולוגיים לגורמי הנימה ארסי זיהומיות החשובים לזיהום הם היטב מאופיינים 5,6. הידע המולקולרי הגדיל אודות ביולוגיה ארסית של פטריית התועבה הזה מסתמך על אסטרטגיית התחדשות גן פשוט 7-9 הנתמך על ידי ביאור הגנום מעולה 10 ואת הקלות של גנטיקה הפוכה באמצעות, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דור 1. בין שני מושגים מחיקים
- צור פלסמיד המכיל את המבנה המחיק (איור 1) המהווים אגף זרם בהתאמת 1 kb (UF) לבין אגף במורד זרם (DF) כל ואת קלטת ההתנגדות המתאימה מוקפת אתרי הגבלת חיתוך בוטים.
הערה: כל אסטרטגיה שיבוט יכול לשמש (שיבוט ראה התייחסות 22) אנו ממליצים שיבוט שער הזהב עבור כאלה 9 פלסמידים. - והבלו המחיק לבנות מן הפלסמיד בעזרת סכין קהה להשיג DNA 1 מיקרוגרם של המחיקה לבנות 9. לטהר את המבנה המחיק לחסל אנזים חיץ 22 למשל
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הקונסטרוקציות המחיקות של כל ארבעת הגנים chitinolytic רשומים U. הגנום maydis נוצרו על ידי שיבוט גולדן גייט באמצעות קלטת hygR למחיקה של cts1, את natR למחיקה של cts2, הקלטת G418R למחיקה של cts3 ואת cbxR למחיקה של cts4 20. סקירה כללית של אסטרטגיית התחדשות הגן מודגמת על ידי מחיקת cts3 (איור 1). מוטציות יחידות וכפולות של cts1.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מוטציות מחיקות למחקרים גנטיים הפוכים ב U. maydis. נקודת המוצא היא קונסטרוקציה המחיקה המכיל רצפים איגוף של הגן של ריבית המכיל רצפים של כ 1 קילו במעלה הזרם של ההתחלה במורד הזרם של תחנת-קודון וכן קלטת התנגדות מתאימה כפי שהוא היה מותאם בעבר 7,9 . הבונה יש שתופק בנפרד עבור כל גן ומאומת בקפידה עבור שגיאות רצף לפני מחיקת הגן. מוטציות פוינט החביות יכולות לגרום לשינויים לא רצויים ברצף הגנומי, בפרט כשמדובר החביות להגיע אל גן השכן או המוטציה מש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
תודה מיוחדת לד"ר בנדיקט Steuten לקריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה המקורית על chitinases בוצע על ידי ד"ר תורסטן Langner. המעבדה של VG נתמך לפי האשכול של מצוינות למדעי הצמח (CEPLAS, DFG EXC 1028) ו BioSC, המעבדה של KS הוא נתמך על ידי BioSC. KB נתמך על ידי BioSC. הפעילות המדעית של מרכז המדע Bioeconomy (BioSC) נתמכו כלכלית על ידי משרד חדשנות, מדע ומחקר במסגרת של NRW Strategieprojekt BioSC (מס '313 / 323-400-00213). LF נתמך על ידי דוקטורט של 1525 iGRADplant קבוצת הדרכת המחקר הבינלאומי DFG.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצה אמינובנזואית (חומצה חופשית) | Sigma Aldrich | A-9878 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Bacto peptone | BD | 211677 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| תמצית שמרים Bacto | BD | 212750 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| CaCl2*2H2O | Grü ssing GmbH | 10234 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Ca-Pantothenat (מלח Hemi-Ca) | Sigma Aldrich | P-2250 | |
| Carboxin | סיגמא אולדריץ' | 45371 | |
| חומצות קסאמינו | BD | 223050 | |
| כולינכלוריד | סיגמא אולדריץ' | C-1879 | |
| חומצת לימון | ChemSolute | 24,321,000 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| CuSO4*5H2O | Fluka | 61240 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| D(+)סוכרוז | Roth | 4621.1 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| DNA degr. חומצה חופשית | סיגמא-אולדריץ' | D-3159 | |
| EDTA | סיגמא אולדריץ' | E4378 | |
| FeCl3*6H2O | Grü ssing GmbH | 10288 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Geneticin (G418) מלח דיסולפט | Sigma Aldrich | A1720 | |
| Trichoderma lysing Enzymes | Sigma Aldrich | L1412 | |
| D(+) Glucose | Caelo | 2580 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Glycerin | פישר כימיקלים | G065015 | לחלופין להשתמש בספק המקומי |
| H3BO3 | AppliChem | A2940 | חומר מסוכן. אנא בדוק את הוראות הבטיחות של היצרן. |
| מלח נתרן הפרין | סיגמא אולדריץ' | H3393-50KU | |
| Hygromycin B-solution | Roth | 1287.2 | חומר מסוכן. |
| KCl | VWR | 26764298 | לחלופין להשתמש בספק המקומי |
| KH2PO4 | AppliChem | A3620 | לחלופין להשתמש בספק המקומי |
| MgSO4 ללא מים | Merck | 7487-88-9 | ללא מים הוא קריטי. לחלופין, השתמש בספק המקומי |
| MnCl2*4H2O | AppliChem | A2087 | לחלופין השתמש בספק מקומי |
| myo-Inositol | Sigma Aldrich | I-5125 | |
| Na2-EDTA*2H2O | AppliChem | A2937 | לחלופין השתמש בספק מקומי |
| Na2MoO4*2H2O | Roth | 0274.2 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Na2SO4 | Grü ssing GmbH | 12174 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| NaCl | Fisher Chemical | S316060 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| NaOH | ChemSolute | 13,751,000 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| NH4NO3 | Roth | K299.1 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| חומצה ניקוטינית (חומצה חופשית) | Sigma אולדריץ' | N-4126 | |
| נורסאותריצין דימימן גופרתי | Werner BioAgents | 5,001,000 | |
| ציר מזין | ספקים מקומיים | של Difco | |
| פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1) pH 6.7 | סיגמא אולדריץ' | P3803 | חומר מסוכן. אנא בדוק את הוראות הבטיחות של היצרן. |
| פוליאתילן גליקול (PEG) | סיגמא אולדריץ' | P-3640 | |
| אשלגן אצטט | AppliChem | 121479 | לחלופין להשתמש בספק המקומי |
| פירידוקסין (מונוהידרוכלוריד) | סיגמא אולדריץ' | P-9755 | |
| ריבופלבין | Sigma Aldrich | R4500 | |
| RNaseA | Sigma Aldrich | R5503 | |
| SDS | Roth | Cn30.3 | לחלופין השתמש במזרק קטן של ספק מקומי |
| BD | 300300 | לחלופין השתמש | |
| במסנן סטרילי של ספק מקומי, 22 ומיקרו; m | VWR | 28145-477 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| סורביטול | רוט | 6213.1 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Thiamin-hydrochloride | Serva | 36020.02 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| tri-Na-Citrate | Fisher Chemical | S332060 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Tris- (hydroxymethyl) aminomethane | VWR | 103156X | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Tris hydrochloride | Roth | 9090.4 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| Triton X-100 | סרווה | 37240 | לחלופין השתמש בספק המקומי |
| ZnCl2 | Fluka | 96470 | לחלופין השתמש בספק מקומי |
| הרכב תמיסות/הכנת חומר | הרכב התמיסות | ||
| קרבוקסין | : 5 מ"ג/מ"ל במתנול, ריכוז סופי: 2 ומיקרו; גרם/מ"ל | ||
| צלחות | 0.25% (w/v) חומצות קסאמינו, 0.1% (w/v) תמצית שמרים, 1.0% (v/v) תמיסת ויטמין Holliday, 6.25% (v/v); תמיסת מלח הולידיי, 0.05% (w/v) DNA degr. חומצה חופשית, 0.15% (w/v) NH4NO3, 2.0% (w/v) Bacto Agar; להתאים ל-pH 7.0 באמצעות 5 M NaOH; לאחר החיטוי יש להוסיף 1% גלוקוז | ||
| גנטיצין (G418) | מלאי: 50 מ"ג/מ"ל ב-H2O, ריכוז סופי: 500 ומיקרו; גרם/מ"ל | ||
| חרוזי זכוכית שטופים ב-HCl (0.35-0.45 מ"מ) | מכסים חרוזי זכוכית ב-HCl מרוכז (25%, 7.8 מ') ודוגרים למשך 60 דקות. שפכו HCl (שמרו על נוזל מפורק) ושטפו חרוזי זכוכית עם 3 M HCl (שמרו על נוזל מפורק). שטפו חרוזי זכוכית מספר פעמים עם H2O מזוקק כפול עד שה-pH הוא 7 (הנוזל לא צריך להיות צהוב-ירוק יותר). ציטטו את חרוזי הזכוכית וייבשו אותם בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס. יש לנטרל את ה-HCl המושקע לפני השלכתו. | ||
| הפרין | : 15 מ"ג/מ"ל | ||
| תמיסת | 16.0 ופרמיל; (עם / נ) KH2PO4, 4.0 ופרמיל; (עם / נ) Na2SO4, 8.0 ‰ (עם / נ) KCl, 1.32 ופרמיל; (עם / נ) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (V/V) יסודות קורט, 2.0 ופרמיל; (עם / נ) MgSO<תת>4; תמיסת ויטמין הולידיי מסוננת סטרילית | ||
| 0.1&פרמיל; (עם / נ) תיאמין, 0.05 ופרמיל; (עם / נ) ריבופלבין, 0.05 ופרמיל; (עם / נ) פירידוקסין, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) Ca-Pantothenat, (0.05 ופרמיל; (עם / נ) חומצה אמינובנזואית, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) חומצה ניקוטינית, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) כולינכלוריד, 1.0 ופרמיל; (w/v) מיו-אינוזיטול; ניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C | |||
| Hygromycin | Stock: 50 מ"ג/מ"ל ב-PBS, ריכוז סופי: 200 ומיקרו; גרם/מ"ל | ||
| מלאי נורסאותריצין | : 200 מ"ג/מ"ל ב-H2O, ריכוז סופי: 150 ומיקרו; גר'/מ"ל | ||
| NSY-גליצרול-בינוני | 0.8% (w/v) ציר תזונתי, 0.1% (w/v) תמצית שמרים, 0.5% (w/v) סוכרוז, 80.0% (v/v) 87% גליצרין (f.c. 69.6%) | ||
| RegLight | 1.0% (w/v) תמצית שמרים 0.4% (w/v) בקטו פפטון, 0.4% (w/v) סוכרוז, 18.22% (w/v) סורביטול, 1.5% (w/v) Agar | ||
| SCS, pH 5.8 | תמיסה 1: 20 מ"מ tri-Na-ציטראט, 1 M סורביטול; קולוטיון 2: 20 מ"מ חומצת לימון, 1 מ' סורביטול, הוסף תמיסה 2 לתמיסה 1 עד שמגיעים ל-pH 5.8; חיטוי | ||
| STC, pH 8 | 1 M סורביטול, 10 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ CaCl2; מסנן סטרילי | ||
| STC/PEG | 40% (v/v) PEG במאגר STC | ||
| חוצץ TE, pH 8 | 1.31 מ"מ Tris-Base, 8.69 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ Na2-EDTA*2H2O | ||
| TE/RNase | 10 ומיקרו; גרם/מ"ל RNaseA במאגר TE | ||
| יסודות | 0.06‰ (עם / נ) H3BO3, 0.14‰ (עם / נ) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (עם / נ) ZnCl2, 0.4 ‰ (עם / נ) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (עם / נ) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (עם / נ) CuSO4*5H2O | ||
| אנזימי ליזינג Trichoderma | 12.5 מ"ג/מ"ל SCS; מסנן סטרילי; הכן זמן קצר לפני השימוש | ||
| Tris-HCl pH 7.5 | 806 מ"מ Tris-HCl, 194 מ"מ Tris-Base; בדוק את ה-pH ובמידת הצורך התאם עם HCl; חיטוי | ||
| מאגר Usti-lysis 1, pH 8 | 10 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 10 מ"מ NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. אין למדוד pH באמצעות מד pH. | ||
| מאגר Usti-lysis 2 | תערובת מאגר Usti lysis 1 עם 1x TE ביחס של 1:1 | ||
| YEPS-Light בינוני | 1.0% (w/v) תמצית שמרים, 0.4% (w/v) בקטו פפטון, 0.4% (w/v) סוכרוז, לצלחות: 1.5% (w/v) בקטו אגר |
מקורות
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
- Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (201....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
תגיות
