הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח

14.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54522

⸱

30 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Microbiology, Heinrich-Heine University Düsseldorf, 2Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Department of Genetics, Institute of Applied Biosciences, Karlsruhe Institute of Technology, 4Cluster of Excellence in Plant Sciences (CEPLAS), Heinrich-Heine University Düsseldorf

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

תקציר

מחיקת ג'ין ממלאת תפקיד חשוב בניתוח של תפקוד גן. אחת השיטות היעילות ביותר לשבש גנים באופן ממוקד הוא החלפת הגן כולו עם סמן לבחירה באמצעות רקומבינציה הומולוגי. במהלך הומולוגי, חילופי DNA מתרחשים בין רצפים עם דמיון גבוה. לכן, רצפי הגנום ליניארי איגוף גן מטרה ניתן להשתמש כדי לכוון סמן לבחירה במיוחד לאתר אינטגרציה הרצוי. קצוות בלאנט של לבנות את המחיקה להפעיל את מערכות תיקון דנ"א של התא ובכך לקדם אינטגרציה של המבנה או דרך רקומבינציה הומולוגי או שאינו הומולוגיים סוף-שהצטרף. באורגניזמים עם הומולוגיים יעילים, שיעור מחיקת גן מוצלח יכול להגיע ליותר מ -50% ביצוע אסטרטגיה זו מערכת שיבוש הגנטי יקרה. פטריית התועבה Ustilago maydis היא מיקרואורגניזם מודל אוקריוטים מראה recombinat הומולוגי יעיל כזהיוֹן. מתוך שלה על 6,900 גנים, רבים מתאפיינים תפקודי בעזרת מוטציות מחיקות, וחזר על כישלון נקודות ניסיונות החלפת גן על תפקוד חיוני של הגן. האפיון הבא של תפקוד הגן על ידי תיוג עם סמני ניאון או מוטציות של תחומים ניבאו גם מסתמך על חילופי דנ"א באמצעות רקומבינציה הומולוגי. כאן, אנו מציגים את U. דור אסטרטגית זן maydis בפירוט באמצעות הדוגמא הפשוטה ביותר, את מחיקת הגן.

מבוא

Ustilago maydis היא פטרייה מודל phytopathogenic כי נחקרה בהרחבה במשך עשרות שנים 1,2. היא קיימת בשני מורפולוגיות, שלב שמרים דמוי, שאינם פתוגניים וטופס filamentous, זיהומיות 3. תגליות פריצת דרך יוניברסל כגון מנגנוני רקומבינציה ותיקון DNA הומולוגיים נעשו בשלב הגדילה דמוי השמרים של פטריית 4 זו. יתר על כן, בורר מורפולוגיים לגורמי הנימה ארסי זיהומיות החשובים לזיהום הם היטב מאופיינים 5,6. הידע המולקולרי הגדיל אודות ביולוגיה ארסית של פטריית התועבה הזה מסתמך על אסטרטגיית התחדשות גן פשוט 7-9 הנתמך על ידי ביאור הגנום מעולה 10 ואת הקלות של גנטיקה הפוכה באמצעות, למשל, באוסף פלסמיד המאורגן היטב במכון שלנו (http : //www.mikrobiologie.hhu.de/ustilago-community.html). סטנדרטיים, מבחני זיהום מהירים של תירסeedlings לאפשר מחקרים מפורטים של פתוגניות גורמי 11.

הגנום של U. maydis מכיל כ 6,900 גנים 10. כדי ללמוד את תפקידם, הם יכולים להימחק בנפרד או בשילוב בשל מערכת הומולוגית יעילה. אזורי איגוף של כ 1 kb המכילים קצוות הומולוגיים מושלם הם אידיאליים עבור שיעורים הומולוגיים יותר מ -50%, אבל כבר 250 נ"ב עם קצוות שאינם הומולוגיים לאפשר מידה מסוימת של אינטגרציה הנכונה של המבנה 9. נכון לעכשיו, חמש קלטות התנגדות שונות, hygR, cbxR, natR, G418R, ו phleoR בתיווך התנגדות נגד hygromycin, carboxin, nourseothricin, G418 ו- phleomycin, מועסק כדי לבחור עבור transformants 7,9. בנוסף, התנגדות hygromycin כבר התפתחה קלטת למחזור (FRT-hygR) כי ניתן להסיר על ידי הביטוי החולף של recombinase FLP Heterologous 12. זה מאפשר סר של הקלטת התנגדות ובכך ב שינויים גנטיים בלתי מוגבלים תאוריה. Phleomycin הוא מוטגנים 13, כך שעם הקלטות החדשות, בפרט את קלטת hygR למחזור, שימוש phleoR הולך ופוחת. מוטציות Quadruple ולכן יכולות להיוצר באמצעות הקלטות הארבעה אחרים, אבל עבור מוטציות מחומשות, מערכת FRT-hygR מומלצת 14.

אסטרטגיה מחיקת גן כללית זו הועברה בהצלחת פטריות תועבה אחרות כגון Sporisorium reilianum 15, ע ' 16 hordei, או U. אסכאלאנטה 17 ולכן מציע את הפוטנציאל עבור יישומים נוספים באורגניזמים עדיין גנטי סוררים עם מערכת הומולוגית יעילה. יתר על כן, אורגניזמים חסרי הומולוגיים יכול להיות שונה כדי לשפר את ההנדסה הגנטית כפי שהודגם על ידי מחיקה של גנים המעורבים שאינם הומולוגיים-אןד-מצטרף Neurospora crassa 18,19.

כאן אנו מתארים את האסטרטגיה המחיקה גן שפורסם U. maydis 7,9 בפירוט הניסיון עם דגש על האימות המהירה ומדויקת של המועמדים. כדוגמא, אנו משתמשים chitinases פטרייתי מתארים את הדור של מוטציות יחידות, כמו גם מחיקת מספר זני 20,21. Chitinases הם דוגמאות מעניינות, כי הם פועלים על כיטין בקיר התא הנוקשה. שיפוץ דופן התא נדרש עבור שינויים מורפולוגיים במהלך חלוקת התא, לעבור לצמיחה פילמנטיות, ולאחר יצירת הנבגים. לפיכך, מוטנטים מחיקה פנוטיפים לאורך כל מחזור החיים ניתן לצפות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דור 1. בין שני מושגים מחיקים

  1. צור פלסמיד המכיל את המבנה המחיק (איור 1) המהווים אגף זרם בהתאמת 1 kb (UF) לבין אגף במורד זרם (DF) כל ואת קלטת ההתנגדות המתאימה מוקפת אתרי הגבלת חיתוך בוטים.
    הערה: כל אסטרטגיה שיבוט יכול לשמש (שיבוט ראה התייחסות 22) אנו ממליצים שיבוט שער הזהב עבור כאלה 9 פלסמידים.
  2. והבלו המחיק לבנות מן הפלסמיד בעזרת סכין קהה להשיג DNA 1 מיקרוגרם של המחיקה לבנות 9. לטהר את המבנה המחיק לחסל אנזים חיץ 22 למשל באמצעות ריאגנטים מסחריים ופעל לפי הוראות היצרן.
    הערה: עמוד השדרה וקטור יכול להישאר תערובת טרנספורמציה.

2. הכנת פרוטופלאסט

הערה: שמור בתנאים סטריליים במהלך כל הזמנים של הדוארxperiment. דופן התא היא מחסום הגנה חזק שמגביל גישה של מולקולות קרום הפלזמה. כדי לאפשר ספיגת של DNA המכיל את מבנה המחיקה, דופן התא צריך להיות מוסר על ידי דופן התא משפיל אנזימים בריאקציה protoplasting. צעדים קריטיים הכין פרוטופלאסט הם 1) ייצוב האוסמוטי של המדיום ו -2) הימנעות לחץ מכאני על פרוטופלאסט.

  1. מארק 2 צינורות מ"ל עם תחתית עגולה להקפיא את פרוטופלאסט להתקרר אותם ב -20 ° C. התחל-תרבות טרום ב 3 מיליליטר YEPS-אור מצלחת טריה של המתח עם הרקע הגנטי הרצוי. לדגור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
    הערה: הזן יכול להיות SG200 זן solopathogenic 10, זני wildtype, זנים בוחנים כגון AB33 23, או כל רקע מוטציה עבור דור של מוטציות כפולות. ודא המתח הוא ללא ההתנגדות הרצויה.
  2. לדלל את התרבות ב 50 מיליליטר YEPS-אור בתוך flas מבולבלk דגירה על שייקר מסלולית ב 28 ° C עם 200 סל"ד.
    הערה: זמן ההכפלה הוא כ 2 שעות עבור זני wildtype. אפשר מינימום שלוש כפילויות.
  3. לגדול עד שלב מעריכים. ודא כי הצפיפות האופטית, נמדדה באורך גל של 600 ננומטר (OD 600), הוא בסביבות 0.8 (0.6 כדי 1.0 הוא מקובל). OD של 600 1.0 מתאים על 1 עד 2 x 10 7 U. maydis תאים לכל מיליליטר.
  4. בדוק את התאים עבור זיהום תחת מיקרוסקופ. השתמש בהגדלה 40X. גלולה התאים של תרבות 50 מ"ל המלא ל 5 דקות, 1,500 XG וזורקים supernatant. Resuspend גלולה ב 25 מ"ל נתרן ציטרט, פתרון סורביטול (SCS), דקות צנטריפוגות 5, 1500 XG, וזורקים supernatant.
    הערה: זיהומים חיידקיים יכולים להיות מזוהים כתאים קטנים ולעיתים קרובות נע. ניתן לזהות המבוססת זיהומים פטרייתיים על צורה או גודל תא שונה לעומת התאים בצורת הסיגר של U. maydis.
  5. במהלך CENtrifugation להכין פתרון protoplasting (12.5 מ"ג / מ"ל Trichoderma lysing אנזימים, ב SCS; להכין 3 מ"ל לכל תא גלולה; מסנן לעקר דרך פילטר 22 מיקרומטר; פתרון צריך להיות טרי לפעילות האנזימטית אופטימלי). SCS הוא מייצב האוסמוטי למנוע קרע של פרוטופלאסט עם הסרת דופן התא.
  6. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל protoplasting פתרון. דגירה במשך 5 עד 20 דקות ב RT ולבדוק מתחת למיקרוסקופ עד 30 עד 40% של התאים הם עגולים או כמו ראשי סיכה (איור 2).
    הערה: בצע את כל השלבים על הקרח מעכשיו ולטפל פרוטופלאסט בזהירות!
  7. 3x לשטוף 10 מ"ל קר (4 ° C) SCS, צנטריפוגה XG ב 1000 למשך 5 דקות.
  8. Resuspend גלולה ב 10 מ"ל סורביטול קר, TrisHCl, פתרון 2 CaCl (STC), ספין XG ב 1000 למשך 5 דקות, להשליך supernatant. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל קר STC, לעשות 100 aliquots μl של צינורות מקורר. להקפיא את aliquots ב -80 ° C עד לשימוש נוסף.

טרנספורמציה 3. U. maydis

הערה: השינוי של U. פרוטופלאסט maydis מסתמך על פוליאתילן גליקול (PEG) שיטה טרנספורמציה בתיווך, שהיא פשוטה מבחינה טכנית בניגוד electroporation או טרנספורמציה biolistic אינה דורשת ציוד מיוחד.

  1. הכן את הצלחות דו-שכבתי בחירה (2 צלחות לכל תגובת טרנספורמציה). השכבה התחתונה מכילה אנטיביוטיקה בריכוז הוכפל. Pipet 12 מ"ל של RegLight המכיל 400 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin (או 300 מיקרוגרם / מ"ל ​​nourseothricin או 4 מיקרוגרם / מ"ל ​​carboxin או 1 מ"ג / מ"ל ​​G418) לתוך צלחת פטרי. הימנע בועות.
    הערה: צלחות השכבה התחתונה ניתן לאחסן כמה ימים על 4 מעלות צלזיוס, אבל להכין את השכבה העליונה טרי במהלך השינוי (ראו להלן).
  2. פרוטופלאסט להפשיר על הקרח (1 שפופרת / טרנספורמציה). הוסף 1 הפרין μl (15 מ"ג / מ"ל). הוסף 1 מיקרוגרם DNA (מבנה לינארית) או 10 μl H 2 O (שליטת מים). דגירה במשך 10 דקות על קרח.
  3. במהלך תקופה זו, על השכבה העליונה להתפשט 12 מ"ל מעובה RegLight (לרתיחה ומצננים עד 60 ° C) לצלחת התחתונה RegLight.
    הערה: שכבה זו אינה מכילה אנטיביוטיקה.
  4. הוסף 500 μl STC / PEG (פוליאתילן גליקול) אל הצינור השינוי (3. 2) ומערבבים בזהירות על ידי צינור היפוך. דגירה 15 דקות על הקרח.
  5. פזר כל תגובה טרנספורמציה על שתיים מן הצלחות RegLight דו-שכבתית. מורחים בזהירות ובאיטיות עם pipet זכוכית. דגירה צלחות זקוף על 28 מעלות צלזיוס במשך 5 עד 7 ימים עד transformants לגדול כקולוניות. השג על 100-200 מושבות בכל צלחת.
    הערה: מספרים נמוכים יותר עלולים להיגרם על ידי "רעה" פרוטופלאסט שכוללת יותר מדי קיר תא ולכן לא יכול לקחת עד DNA או לא יכול להתחדש. לשעבר יכול להיבדק על ידי טרנספורמציה עם פלסמיד המשכפלת את עצמה, זה האחרון על ידי בדיקת התחדשות על צלחות ללא אנטיביוטיקה.
  6. כן YEPS-אור צלחות המכילות האנטיביוטיקה המתאימה ב 200 מיקרוגרם / מיליליטר hygromycin (או 150 מיקרוגרם / מיליליטר nourseothricin או 2 מיקרוגרם / מיליליטר carboxin או 500 מיקרוגרם / מיליליטר G418; ריכוזים אלה חצי שווים של אחד המשמש צלחות תחתונות). Re-לטהר 24 מושבות transformant משוערות לפחות על צלחות אלה. יש לקבל מושבות בודדות. באותו פס פסק זמן הזן המקורי על תקשורת הלא סלקטיבי.
    הערה: ניתן לאחסן צלחות ב 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 שבועות.

4. אימות של אירועים מחיקים נכון

הערה: המוטציות אומת בהליך בן שלושה שלבים (איור 1). ראשית, מועמדים המכילים את עותק wildtype של גן מודרים על ידי PCR. שנית, השילוב של הקלטת ההתנגדות לתוך המוקד מאומת על ידי PCR. שלישית, האינטגרציה של הקלטת ההתנגדות רק אל המוקד הרצוי מאומתת על ידי ניתוח כתם דרום. אימות זן זהירות היא essential, כך פנוטיפים מוטנטים לתאם באמת בתהליך המחיקה.

  1. האבחון הראשון PCR 20
    1. זיווג פריימרים עיצוב בגן למחיקה כי תוצאת תוצר של 250-600 נקודות בסיס (איור 1). מוצרים קטנים כאלה קלים להגביר במושבה PCR, וארוך מספיק לגילוי ב ג'ל אלקטרופורזה סטנדרטית.
    2. עבור כל מועמד ואת המתח המקורי כביקורת חיובית, resuspend קצת (סכום של ראש סיכה) של חומר התא של מושבה אחת עם קיסם 20 μl 0.02 M NaOH. לדגור על RT במשך 30 דקות.
      הערה: השתמש מושבות טריות. אם הצלחות הן מבוגרת 1 שבוע מחדש פס להשיג מושבה טריה.
    3. השתמש 1 μl של ההשעיה תא עבור PCR מיד. הפעל תגובת PCR תקן ולנתח שברים וכתוצאה מכך.
      הערה: דגימות אלה לא ניתן לאחסן.
      הערה: בדיקות PCR זה עבור נוכחות של גן wildtype ובכך מאפשרת זיהוי מהיר של CAND השליליתidates שבו הגן של עניין לא הוחלף. משובטים מניבים להקות תגובת PCR זה ייפסל. צריך כגון שיבוט שלילי אחת בכל מקרה להתבצע לאורך כפקד שלילי נוסף. מועמדים ללא מוצר PCR צריכים להיות מנותחים נוסף. עבור גנים ללא השפעות מזיקות כמחצית המועמדים תכיל את גן wildtype, ואילו החצי השני לא אמור לגרום להקה. זה יתאים לשיעור הומולוגי של 50%.
  2. PCR לאבחון שנית
    1. הכנה של הדנ"א הגנומי.
      הערה: הדנ"א הגנומי (gDNA) ניתן להכין באמצעות שני פרוטוקולים שונים. הראשונה כוללת ריאגנטים רעילים כמו פנול כלורופורם ומכאן, צריכים להיות מטופלים רק על ידי חוקרים מנוסים (המתואר 4.2.1.1 כדי 4.2.1.5) ואילו השני יכול גם להיות מטופלים על ידי תלמידים מנוסים פחות (המתואר 4.2.1.6 ל -4.2. 1.11). שני הפרוטוקולים פועלים באופן מהימן. שלב 4.2.1.1 זהה עבור שניהם protocOLS.
      1. לחסן 5 מ"ל YEPS-אור עם כל מועמד לדגור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. ירידה של 2 μl של התרבות על צלחת CM. שמרו על תרבות סטרילי.
        הערה: להלן פרוטוקול סטנדרטי (זהירות: צעדים רעילים).
      2. שים 1 סקופ (~ 200 μl) של חרוזי זכוכית HCl שטוף 2 מ"ל צינורות. הוסף 2 מ"ל של U. תרבות maydis. ספין XG 12,000 במשך 5 דקות. בטל supernatant (גלולה אפשר להקפיא בשלב זה). הוסף 500 μl פנול / כלורופורם / Isoamylalcohol (25: 24: 1) על הגלולה. זְהִירוּת! פנול רעיל!
      3. הוסף 500 μl אוסטי-תמס-חיץ 1. Shake עבור 6 עד 10 דקות על vibrax ב 1000 סל"ד. ודא כי גלולת התא resuspended לחלוטין, אך להימנע מורחב רועדים למנוע מריחה של gDNA. ספין ב XG 12,000 במשך 15 דקות. העבר 400 μl של השלב המימי לתוך צינור התגובה החדש (לא לגעת ביניים).
      4. הוסף 1 מ"ל 100% (V / V) אתנול. הפוך את 3x צינור לערבב, להתבונן גרם של DNA כי זמן קצר מופיע. ספין ב XG 12,000 במשך 5 דקות. הסר supernatant ולשטוף עם 200 μl 70% EtOH. אל resuspend גלולה ב בשלב זה.
      5. הסר supernatant לחלוטין (לא נותנים גלולה להתייבש לחלוטין). הוסף 50 μl TE / RNase. ממיסים gDNA ידי רועד ב 400 סל"ד ב 50 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לנתח 2 μl של gDNA על ג'ל 0.8% agarose 20.
        הערה: השלבים הבאים מהווים פרוטוקול חלופי רעיל.
    2. הכנה חלופית של הדנ"א הגנומי
      1. שים 1 סקופ (~ 200 μl) של HCl שטף חרוזי זכוכית 2 צינורות מ"ל. הוסף 2 מ"ל של U. תרבות הספין maydis XG ב 12,000 במשך 5 דקות. בטל supernatant (כדורים אפשר להקפיא בשלב זה).
      2. הוסף 500 μl אוסטי תמוגה חיץ 2 על הגלולה. לנער במשך 5 עד 15 דקות על vibrax ב 1000 סל"ד. ודא כי גלולת התא resuspended לחלוטין.
      3. דגירת הצינורות ב C 65 מעלות במשך 15 עד 20 דקות. שימוש approחממות priate שנועדו לארח 2 צינורות מיליליטר היא קריטיות. לאחר מכן, למקם אותו על קרח למשך 5 דקות.
      4. הוספת 100 μl 8 M אשלגן אצטט, מערבולת או להפוך 8 עד 10 פעמים. ספין XG 12,000 במשך 15 דקות ב RT.
      5. העברת 500 μl של supernatant לצינור 1.5 מ"ל טריים ולהוסיף 400 isopropanol μl. וורטקס או הפוך 8 עד 10 פעמים. ספין XG 12,000 במשך 15 דקות. הסר supernatant ולשטוף עם 500 μl 70% EtOH. ספין XG 12,000 במשך 5 דקות.
      6. משרים את supernatant לחלוטין! בסופו של דבר, להוסיף סיבוב קצר (10 שניות) כדי להסיר את הנוזל שיורית. תן יבש גלולת DNA במשך 3 עד 5 דקות. הוסף 50 μl TE / RNAase לדגור על 50 מעלות צלזיוס למשך 10 עד 15 דקות ב 400 סל"ד.
    3. PCR
      1. עיצוב שני זוגות פריימר עם אחד מהם מחייב מחוץ חביות ואת המקביל אחד מחייב בתוך קלטת התנגדות (UF-f, RC-r; RC-F, DF-r, איור 1) 9.
      2. השתמש 1 μl של דילול 1:10 של gDNA של כל גandidate כתבנית ב 2 תגובות PCR אימות ההכנסה הנכונה במעלה או במורד 9.
      3. השתמש PCR תגובות סטנדרטיות לכל מועמד ולנתח וכתוצאה שברת 22.
        הערה: אלה PCRs לבדוק את ההחדרה של קלטת התנגדות מוקד גנומית הנכון. אם מוצרים מתקבלים לשני הצדדים, המועמד הוא הכנסה נכונה סביר. עם זאת, גם מועמדים שבו רק צד אחד (במעלה או במורד הזרם) ניתן היה לאשר צריך להתבצע לאורך לניתוח נוסף במקרה זה תגובות PCR נכשל פשוט לאגפו אחד.
  3. אימות של הכנסת הגנום נכון על ידי דרום כתם ניתוח 22
    1. תקציר 15 μl של gDNA (4.2.1) של המועמדים מוטציה ואת המתח wildtype / ובתאים להתכתב עם אנזים מתאים שחותך מחוץ לוקוס / לבנות ובנוסף, חותך או בגן או קלטת התנגדות המוביל בבירור distדפוסי inguishable (איור 1) 8.
      הערה: אף אחד הלהקות הצפויות צריכה להיות גדול יותר מ -10 קילו, כך שהם להבחין באופן ברור בין ה- DNA המעוכל.
    2. השתמש במעלה או במורד הזרם בכנף כמו בדיקות. לתייג אותם למשל להשתמש ערכת תיוג DIG PCR או כל שיטה תקן דומה. מערבב את הבדיקות שכותרתו יחס של 1: 1 מולקולרי ולבצע את כתם הדרום. שמור לפחות שני transformants הנכון עצמאי.
      הערה: תבנית wildtype ניתן תהיה לקלוט בבירור את המתח המקורי ואת השיבוטים הנכונים צריכים להכיל רק הלהקות הצפויות. להקות נוספות רק נוכח המועמדים מצביעות הוספות אחרות של לבנות בתוך מוקד טועה. אמור להיות מושלך שיבוטים כזה. המועמד השלילי שזוהה PCR האבחון הראשון צריך לכלול את להקות wildtype ואת הלהקות (צפויות בגודל) של המבנה המחיק משולב בצדק.
  4. מניות גליצרול
    הערה: מניות גליצרול לשמש כדי לשמור על השיבוטים במשך שנים באוספי זן. לפחות שני transformants העצמאי צריך להישמר לכל מוטציה. זה מאפשר פנוטיפים השוואה שאמורה להיות זהה.
    1. לגדול 5 מ"ל תרבויות של זנים מוטנטים אישר YEPS-אור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס מערבבים 500 μl של כל תרבות עם 500 μl NSY-גליצרול-בינוני. היפוך צינור עד ההתרבות ובינונית הן גם מעורבות. גליצרול במדיום מונע היווצרות של גבישי קרח.
    2. להקפיא ב -80 ° C. Re-פס חלק מהתרבות קפואה לבדוק אם המנייה היא פונקציונלית.

5. פנוטיפים מיקרוסקופים

  1. לגדול 5 מ"ל תרבויות של wildtype זנים מוטנטים YEPS-אור על גלגל מסתובב במשך 12 שעות ב 28 מעלות צלזיוס.
  2. למחרת, לדלל את התרבות כדי OD 600 של כ 0.1 לגדל אותו עד OD 600 בין 0.5 ו -0.7. OD של 600 1.0 corresponds לכ 1 עד 2 x 10 7 U. maydis תאים לכל מיליליטר.
  3. בדוק את מורפולוגיה התא מיקרוסקופי.
    הערה: בריאה תאים להופיע בצורת סיגר (איור 4, WT). vacuoles מבוטא או היווצרות נימה עולה כי התאים הם הדגישו.
    הערה: בהתאם פנוטיפ מוטנטי הצפוי, הניתוח יכול להיות מותאם, למשל, אם זני כתב משמשים את assay המתאים יכול להתבצע בשלב זה. אם מורפולוגיה לתא יתחלף ניתוח סטטיסטי צריך להתנהל, למשל, כדי לקבוע את אורך התא הממוצע.

Assay זיהום 6.

הערה: assay שתיל הזיהום כבר דמיין בעבר ביומן הזה 11. זה יכול גם להתבצע באמצעות רקע מתח הפלואידים, solopathogenic כגון SG200 10 או על ידי ערבוב שותפי הזדווגות תואמים אשר שניהם נושאים את המוטציה.

  1. לגדול לפחות 40 שתילי תירס לכלזן עבור 7 ימים בכל מחזור אור של 16 שעות, 200 μE, 28 ° C / 22 ° C (יום / לילה). הם צריכים להיות בשלב 3-עלה 10-15 ס"מ על יום של זיהום.
  2. יומיים לפני ההדבקה, להתחיל תרבות מראש של זנים ב 5 מ"ל YEPS-אור על גלגל מסתובב במשך 24 שעות ב 28 מעלות צלזיוס. לגדול תרבות עיקרית 50 מיליליטר YEPS-אור עד OD 600 = 1.0 (שיעור חלוקת תא = 2 hr, לאפשר 3 חטיבות מינימום, אפשר לעשות O / N).
  3. ספין למטה התאים של תרבות 50 מ"ל ב 1500 XG במשך 5 דקות וזורקים supernatant. לשטוף 3x עם H 2 O. סטרילי Resuspend התאים סטרילי H 2 O ל OD 600 של 3.0. במידת הצורך, לערבב השותפים ההזדווגות.
  4. להזריק 250 - 500 μl של מתלי התא לתוך הגזע של שתילי תירס בן 7 יום באמצעות מזרק קטן. השתמש סטרילי H 2 O כביקורת. שמור שתילים נגועים עבור 7-14 ימים נוספים בתנאי אור וטמפרטורה אותו. ציון פנוטיפ של כל מפעלccording כדי בריא, ירקון, היווצרות אנתוציאנין, גידולים קטנים, גידולים גדולים, צמחים מתים 10.
    הערה: הניקוד יכול להיעשות מוקדם ככל 7 ימים וחזר ב 14 ימים כדי לעקוב אחרי זיהום לאורך זמן.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הקונסטרוקציות המחיקות של כל ארבעת הגנים chitinolytic רשומים U. הגנום maydis נוצרו על ידי שיבוט גולדן גייט באמצעות קלטת hygR למחיקה של cts1, את natR למחיקה של cts2, הקלטת G418R למחיקה של cts3 ואת cbxR למחיקה של cts4 20. סקירה כללית של אסטרטגיית התחדשות הגן מודגמת על ידי מחיקת cts3 (איור 1). מוטציות יחידות וכפולות של cts1...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מוטציות מחיקות למחקרים גנטיים הפוכים ב U. maydis. נקודת המוצא היא קונסטרוקציה המחיקה המכיל רצפים איגוף של הגן של ריבית המכיל רצפים של כ 1 קילו במעלה הזרם של ההתחלה במורד הזרם של תחנת-קודון וכן קלטת התנגדות מתאימה כפי שהוא היה מותאם בעבר 7,9 . הבונה יש שתופק בנפרד עבור כל גן ומאומת בקפידה עבור שגיאות רצף לפני מחיקת הגן. מוטציות פוינט החביות יכולות לגרום לשינויים לא רצויים ברצף הגנומי, בפרט כשמדובר החביות להגיע אל גן השכן או המוטציה מש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

תודה מיוחדת לד"ר בנדיקט Steuten לקריאה ביקורתית של כתב היד. העבודה המקורית על chitinases בוצע על ידי ד"ר תורסטן Langner. המעבדה של VG נתמך לפי האשכול של מצוינות למדעי הצמח (CEPLAS, DFG EXC 1028) ו BioSC, המעבדה של KS הוא נתמך על ידי BioSC. KB נתמך על ידי BioSC. הפעילות המדעית של מרכז המדע Bioeconomy (BioSC) נתמכו כלכלית על ידי משרד חדשנות, מדע ומחקר במסגרת של NRW Strategieprojekt BioSC (מס '313 / 323-400-00213). LF נתמך על ידי דוקטורט של 1525 iGRADplant קבוצת הדרכת המחקר הבינלאומי DFG.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אמינובנזואית (חומצה חופשית)Sigma AldrichA-9878
Bacto agar BD214010לחלופין השתמש בספק המקומי
Bacto peptoneBD211677לחלופין השתמש בספק המקומי
תמצית שמרים Bacto BD212750לחלופין השתמש בספק המקומי
CaCl2*2H2OGrü ssing GmbH10234לחלופין השתמש בספק המקומי
Ca-Pantothenat (מלח Hemi-Ca)Sigma AldrichP-2250
Carboxin סיגמא אולדריץ'45371
חומצות קסאמינו BD223050
כולינכלורידסיגמא אולדריץ'C-1879
חומצת לימוןChemSolute24,321,000לחלופין השתמש בספק המקומי
CuSO4*5H2OFluka61240לחלופין השתמש בספק המקומי
D(+)סוכרוז Roth4621.1לחלופין השתמש בספק המקומי
DNA degr. חומצה חופשית סיגמא-אולדריץ'D-3159
EDTAסיגמא אולדריץ'E4378
FeCl3*6H2OGrü ssing GmbH10288לחלופין השתמש בספק המקומי
Geneticin (G418) מלח דיסולפטSigma AldrichA1720
Trichoderma lysing EnzymesSigma AldrichL1412
D(+) GlucoseCaelo2580לחלופין השתמש בספק המקומי
Glycerin פישר כימיקליםG065015לחלופין להשתמש בספק המקומי
H3BO3AppliChemA2940חומר מסוכן. אנא בדוק את הוראות הבטיחות של היצרן.
מלח נתרן הפריןסיגמא אולדריץ'H3393-50KU
Hygromycin B-solutionRoth1287.2חומר מסוכן. 
KClVWR26764298לחלופין להשתמש בספק המקומי
KH2PO4AppliChemA3620לחלופין להשתמש בספק המקומי
MgSO4 ללא מיםMerck7487-88-9ללא מים הוא קריטי. לחלופין, השתמש בספק המקומי
MnCl2*4H2OAppliChemA2087לחלופין השתמש בספק מקומי
myo-InositolSigma AldrichI-5125
Na2-EDTA*2H2OAppliChemA2937לחלופין השתמש בספק מקומי
Na2MoO4*2H2ORoth0274.2לחלופין השתמש בספק המקומי
Na2SO4Grü ssing GmbH12174לחלופין השתמש בספק המקומי
NaClFisher ChemicalS316060לחלופין השתמש בספק המקומי
NaOHChemSolute13,751,000לחלופין השתמש בספק המקומי
NH4NO3RothK299.1לחלופין השתמש בספק המקומי
חומצה ניקוטינית (חומצה חופשית)Sigma אולדריץ'N-4126
נורסאותריצין דימימן גופרתי   Werner BioAgents5,001,000
ציר מזין ספקים מקומייםשל Difco
פנול: כלורופורם: אלכוהול איזואמיל (25: 24: 1) pH 6.7סיגמא אולדריץ'P3803חומר מסוכן. אנא בדוק את הוראות הבטיחות של היצרן.
פוליאתילן גליקול (PEG)סיגמא אולדריץ'P-3640
אשלגן אצטטAppliChem121479לחלופין להשתמש בספק המקומי
פירידוקסין (מונוהידרוכלוריד)סיגמא אולדריץ'P-9755
ריבופלבין Sigma AldrichR4500
RNaseASigma AldrichR5503
SDSRothCn30.3לחלופין השתמש במזרק קטן של ספק מקומי
BD300300לחלופין השתמש
במסנן סטרילי של ספק מקומי, 22 ומיקרו; mVWR28145-477לחלופין השתמש בספק המקומי
סורביטולרוט6213.1לחלופין השתמש בספק המקומי
Thiamin-hydrochlorideServa36020.02לחלופין השתמש בספק המקומי
tri-Na-CitrateFisher ChemicalS332060לחלופין השתמש בספק המקומי
Tris- (hydroxymethyl) aminomethaneVWR103156Xלחלופין השתמש בספק המקומי
Tris hydrochlorideRoth9090.4לחלופין השתמש בספק המקומי
Triton X-100 סרווה 37240לחלופין השתמש בספק המקומי
ZnCl2Fluka96470לחלופין השתמש בספק מקומי
הרכב תמיסות/הכנת חומרהרכב התמיסות
קרבוקסין: 5 מ"ג/מ"ל במתנול, ריכוז סופי: 2 ומיקרו; גרם/מ"ל
צלחות0.25% (w/v) חומצות קסאמינו, 0.1% (w/v) תמצית שמרים, 1.0% (v/v) תמיסת ויטמין Holliday, 6.25% (v/v); תמיסת מלח הולידיי, 0.05% (w/v) DNA degr. חומצה חופשית, 0.15% (w/v) NH4NO3, 2.0% (w/v) Bacto Agar; להתאים ל-pH 7.0 באמצעות 5 M NaOH; לאחר החיטוי יש להוסיף 1% גלוקוז 
גנטיצין (G418)מלאי: 50 מ"ג/מ"ל ב-H2O, ריכוז סופי: 500 ומיקרו; גרם/מ"ל
חרוזי זכוכית שטופים ב-HCl (0.35-0.45 מ"מ)מכסים חרוזי זכוכית ב-HCl מרוכז (25%, 7.8 מ') ודוגרים למשך 60 דקות. שפכו HCl (שמרו על נוזל מפורק) ושטפו חרוזי זכוכית עם 3 M HCl (שמרו על נוזל מפורק). שטפו חרוזי זכוכית מספר פעמים עם H2O מזוקק כפול עד שה-pH הוא 7 (הנוזל לא צריך להיות צהוב-ירוק יותר). ציטטו את חרוזי הזכוכית וייבשו אותם בטמפרטורה של 180 מעלות צלזיוס. יש לנטרל את ה-HCl המושקע לפני השלכתו. 
הפרין: 15 מ"ג/מ"ל
תמיסת16.0 ופרמיל; (עם / נ) KH2PO4, 4.0 ופרמיל; (עם / נ) Na2SO4, 8.0 ‰ (עם / נ) KCl, 1.32 ופרמיל; (עם / נ) CaCl2*2H2O, 8.0 ‰ (V/V) יסודות קורט, 2.0 ופרמיל; (עם / נ) MgSO<תת>4; תמיסת ויטמין הולידיי מסוננת סטרילית
 0.1&פרמיל; (עם / נ) תיאמין, 0.05 ופרמיל; (עם / נ) ריבופלבין, 0.05 ופרמיל; (עם / נ) פירידוקסין, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) Ca-Pantothenat, (0.05 ופרמיל; (עם / נ) חומצה אמינובנזואית, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) חומצה ניקוטינית, 0.2 ופרמיל; (עם / נ) כולינכלוריד, 1.0 ופרמיל; (w/v) מיו-אינוזיטול; ניתן לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C
HygromycinStock: 50 מ"ג/מ"ל ב-PBS, ריכוז סופי: 200 ומיקרו; גרם/מ"ל
מלאי נורסאותריצין: 200 מ"ג/מ"ל ב-H2O, ריכוז סופי: 150 ומיקרו; גר'/מ"ל
NSY-גליצרול-בינוני0.8% (w/v) ציר תזונתי, 0.1% (w/v) תמצית שמרים, 0.5% (w/v) סוכרוז,   80.0% (v/v) 87% גליצרין (f.c. 69.6%) 
RegLight1.0% (w/v) תמצית שמרים  0.4% (w/v) בקטו פפטון, 0.4% (w/v) סוכרוז, 18.22% (w/v) סורביטול, 1.5% (w/v) Agar
SCS, pH 5.8תמיסה 1: 20 מ"מ tri-Na-ציטראט, 1 M סורביטול; קולוטיון 2: 20 מ"מ חומצת לימון, 1 מ' סורביטול, הוסף תמיסה 2 לתמיסה 1 עד שמגיעים ל-pH 5.8; חיטוי
STC, pH 81 M סורביטול, 10 מ"מ Tris-HCl pH 7.5, 100 מ"מ CaCl2; מסנן סטרילי
STC/PEG40% (v/v) PEG במאגר STC 
חוצץ TE, pH 81.31 מ"מ Tris-Base, 8.69 מ"מ Tris-HCl, 10 מ"מ Na2-EDTA*2H2O
TE/RNase10 ומיקרו; גרם/מ"ל RNaseA במאגר TE
יסודות0.06‰ (עם / נ) H3BO3, 0.14‰ (עם / נ) MnCl*4H2O, 0.4 ‰ (עם / נ) ZnCl2, 0.4 ‰ (עם / נ) Na2MoO4*H2O:2, 0.1 ‰ (עם / נ) FeCl3*6H2O, 0.04‰ (עם / נ) CuSO4*5H2O
אנזימי ליזינג Trichoderma12.5 מ"ג/מ"ל SCS; מסנן סטרילי; הכן זמן קצר לפני השימוש
Tris-HCl pH 7.5806 מ"מ Tris-HCl, 194 מ"מ Tris-Base; בדוק את ה-pH ובמידת הצורך התאם עם HCl; חיטוי
מאגר Usti-lysis 1, pH 810 מ"מ Tris-HCl (pH 8.0), 10 מ"מ NaCl, 1% (w/v) SDS, 2% (v/v) TritonX-100, 1 mM EDTA. אין למדוד pH באמצעות מד pH. 
מאגר Usti-lysis 2תערובת מאגר Usti lysis 1 עם 1x TE ביחס של 1:1
YEPS-Light בינוני1.0% (w/v) תמצית שמרים, 0.4% (w/v) בקטו פפטון, 0.4% (w/v) סוכרוז, לצלחות: 1.5% (w/v) בקטו אגר
מלאי CM מלאי מלח הולידיי קורט תמיסת

מקורות

  1. Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13, 414-430 (2012).
  2. Vollmeister, E., et al. Fungal development of the plant pathogen Ustilago maydis. Fems Microbiol Rev. 36, 59-77 (2012).
  3. Banuett, F. Ustilago maydis, the delightful blight. Trends in Genetics. 8, 174-180 (1992).
  4. Holloman, W. K., Schirawski, J., Holliday, R. The homologous recombination system of Ustilago maydis. Fungal Genetics and Biology. 45, S31-S39 (2008).
  5. Feldbrügge, M., Kämper, J., Steinberg, G., Kahmann, R. Regulation of mating and pathogenic development in Ustilago maydis. Current Opinion in Microbiology. 7, 666-672 (2004).
  6. Ökmen, B., Doehlemann, G. Inside plant: Biotrophic strategies to modulate host immunity and metabolism. Current Opinion in Plant Biology. 20, 19-25 (2014).
  7. Brachmann, A., König, J., Julius, C., Feldbrügge, M. A reverse genetic approach for generating gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 272, 216-226 (2004).
  8. Kämper, J. A PCR-based system for highly efficient generation of gene replacement mutants in Ustilago maydis. Molecular Genetics and Genomics. 271, 103-110 (2004).
  9. Terfrüchte, M., et al. Establishing a versatile Golden Gate cloning system for genetic engineering in fungi. Fungal Genetics and Biology. 62, 1-10 (2014).
  10. Kämper, J., et al. Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis. Nature. 444, 97-101 (2006).
  11. Chavan, S., Smith, S. M. A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines. Journal of Visualized Experiments. (83), e50712(2014).
  12. Khrunyk, Y., Münch, K., Schipper, K., Lupas, A. N., Kahmann, R. The use of FLP-mediated recombination for the functional analysis of an effector gene family in the biotrophic smut fungus Ustilago maydis. New Phytologist. 187, 957-968 (2010).
  13. van Peer, A. F., de Bekker, C., Vinck, A., Wösten, H. A. B., Lugones, L. G. Phleomycin Increases Transformation Efficiency and Promotes Single Integrations in Schizophyllum commune. Appl Environ Microb. 75, 1243-1247 (2009).
  14. Sarkari, P., et al. Improved expression of single-chain antibodies in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 191, 165-175 (2014).
  15. Schirawski, J., Heinze, B., Wagenknecht, M., Kahmann, R. Mating type loci of Sporisorium reilianum: Novel pattern with three a and multiple b specificities. Eukaryotic Cell. 4, 1317-1327 (2005).
  16. Cervantes-Chavez, J. A., Ali, S., Bakkeren, G. Response to Environmental Stresses, Cell-wall Integrity, and Virulence Are Orchestrated Through the Calcineurin Pathway in Ustilago hordei. Mol Plant Microbe In. 24, 219-232 (2011).
  17. Yu, J. J., et al. An efficient genetic manipulation protocol for Ustilago esculenta. FEMS Microbiology Letters. 362, (2015).
  18. Ninomiya, Y., Suzuki, K., Ishii, C., Inoue, H. Highly efficient gene replacements in Neurospora strains deficient for nonhomologous end-joining. P Natl Acad Sci USA. 101, 12248-12253 (2004).
  19. Colot, H. V., et al. A high-throughput gene knockout procedure for Neurospora reveals functions for multiple transcription factors. P Natl Acad Sci USA. 103, 10352-10357 (2006).
  20. Langner, T., et al. Chitinases Are Essential for Cell Separation in Ustilago maydis. Eukaryot Cell. 14, 846-857 (2015).
  21. Langner, T., Göhre, V. Fungal chitinases: function, regulation, and potential roles in plant/pathogen interactions. Current Genetics. , (2015).
  22. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloining: a laboratry manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  23. Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Molecular Microbiology. 42, 1047-1063 (2001).
  24. Becht, P., Vollmeister, E., Feldbrügge, M. Role for RNA-binding proteins implicated in pathogenic development of Ustilago maydis. Eukaryotic Cell. 4, 121-133 (2005).
  25. Vollmeister, E., et al. Tandem KH domains of Khd4 recognize AUACCC and are essential for regulation of morphology as well as pathogenicity in Ustilago maydis. RNA. 15, 2206-2218 (2009).
  26. Stock, J., et al. Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis. Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).
  27. Baumann, S., Pohlmann, T., Jungbluth, M., Brachmann, A., Feldbrügge, M. Kinesin-3 and dynein mediate microtubule-dependent co-transport of mRNPs and endosomes. Journal of Cell Science. 125, 2740-2752 (2012).
  28. Pohlmann, T., Baumann, S., Haag, C., Albrecht, M., Feldbrügge, M. A FYVE zinc finger domain protein specifically links mRNA transport to endosome trafficking. eLife. 4, (2015).
  29. Kronstad, J. W., Leong, S. A. Isolation of two Alleles of the b-Locus of Ustilago. P Natl Acad Sci USA. 86, 978-982 (1989).
  30. Koepke, J., et al. The RNA-binding protein Rrm4 is essential for efficient secretion of endochitinase Cts1. Molecular & cellular proteomics. 10, (2011).
  31. Schuler, D., et al. Hxt1, a monosaccharide transporter and sensor required for virulence of the maize pathogen Ustilago maydis. New Phytologist 206. , 1086-1100 (2015).
  32. Schuster, M., Schweizer, G., Reissmann, S., Kahmann, R. Genome editing in Ustilago maydis using the CRISPR-Cas system. Fungal Genetics and Biology. , (2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

PCR
מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.