מאמר שיטה

דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

DOI:

10.3791/54543

⸱

15 בספטמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן הניתנים להתאמה אישית שניתן להשתמש בהם לזיהוי בו-זמני של נוגדנים עצמיים IgG ו-IgM בסרום מבני אדם ועכברים. מערכים אלה מאפשרים זיהוי תפוקה גבוהה וכמותית של נוגדנים כנגד אנטיגנים או אפיטופים מעניינים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים עצמיים, שהם נוגדנים נגד אנטיגנים עצמיים, נמצאים במצבי מחלה רבים ויכולים לשמש כסמנים לפעילות המחלה. רמות הנוגדנים העצמיים לאנטיגנים ספציפיים מזוהות בדרך כלל בטכניקת בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA). עם זאת, בדיקת נוגדנים עצמיים מרובים עם ELISA יכולה להיות גוזלת זמן ודורשת כמות גדולה של דגימת חולים. טכניקת מיקרו-מערך האנטיגן היא שיטה חלופית שניתן להשתמש בה כדי לסנן נוגדנים עצמיים בצורה מרובה. בטכניקה זו, אנטיגנים מסודרים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות במיוחד עם מיקרו-מערך רובוטי. השקופיות נבדקות עם דגימות סרום של מטופלים ולאחר מכן מתווספים נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית כדי לזהות קשירה של נוגדנים עצמיים בסרום לאנטיגנים. תגובתיות הנוגדנים העצמיים מתגלה ומכומתת על ידי סריקת השקופיות עם סורק שיכול לזהות אותות פלואורסצנטיים. כאן אנו מתארים שיטות ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן מותאמים אישית. המערכים הנוכחיים שלנו מודפסים עם 9 פינים מוצקים ויכולים לכלול עד 162 אנטיגנים המנוקדים בשכפול. ניתן להתאים את המערכים בקלות על ידי שינוי האנטיגנים בלוחית המקור המשמשת את המיקרו-מערך. פיתחנו סכימת זיהוי נוגדנים משנית דו-צבעונית שיכולה להבחין בתגובתיות IgG ו-IgM על אותו משטח שקופיות. מערכת הזיהוי עברה אופטימיזציה לחקר קשירת נוגדנים עצמיים אנושיים ועכברים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים עצמיים קיימים במצבי מחלה רבים ולעתים קרובות יכולים להיות בעלי פעילות פתוגנית ישירה1. זיהוי נוגדנים עצמיים חשוב לאבחון מחלות מסוימות, לפרוגנוזה של תוצאות המחלה ולסיווג חולים שעשויים להפיק תועלת מטיפולים ספציפיים2. נוגדנים עצמיים מזוהים בדרך כלל בסרום המטופל באמצעות טכניקת ELISA; עם זאת, בדיקת אנטיגנים מרובים בטכניקה זו היא מייגעת וצורכת כמות גדולה של דגימת חולים. לכן יש צורך בטכנולוגיות חדשות כדי ליצור פרופיל של נוגדנים עצמיים בקנה מידה גדול יותר.

טכניקת מיקרו-מערך האנטיגן היא טכנולוגיה פרוטאומית המאפשרת לאפיין נוגדנים עצמיים בצורה מרובה3. בשלב הראשון של תהליך זה, ספריית אנטיגן מסודרת על משטח שקופיות באמצעות מיקרו-מערך רובוטי. השקופיות נבדקות בסרום מדולל ולאחר מכן מוסיפים נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית. תגובתיות נוגדנים מומחשת על ידי סריקת השקופיות עם סורק מיקרו-מערך ומכומתת על ידי עוצמות פלואורסצנטיות. מיקרו-מערכי אנטיגן מציעים יתרונות מרובים על פני טכניקת ELISA בבדיקת נוגדנים עצמיים: 1) הם דורשים רק מיקרוליטר של סרום כדי ליצור פרופיל של נוגדנים עצמיים למספר אנטיגנים בו זמנית, 2) הם משתמשים באנטיגן במשורה, מכיוון שרק ננוליטרים של אנטיגן מזוהים על המערכים, 3) יש להם רגישות משופרת3 בהשוואה ל-ELISA ו-4) הם מאפשרים את המקבילה עדיין, זיהוי נפרד של יותר מאיזוטיפ נוגדן אחד. מיקרו-מערכי אנטיגן שימשו לפרופיל נוגדנים עצמיים במחלות אוטואימוניות כגון דלקת מפרקים שגרונית, טרשת נפוצה וזאבת אדמנתית מערכתית4-6. בכל שלוש המחלות הללו, תובנה חדשה לגבי פתוגנזה של מחלה התקבלה מפרופיל נוגדנים עצמיים בקנה מידה גדול עם המערכים.

כאן אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן באמצעות שקופיות מצופות ניטרוצלולוז. ניתן לסדר מגוון אנטיגנים כולל חלבונים, פפטידים וליזטים של תאים על השקופיות בטכניקה זו. ניתן להתאים את המערכים בקלות על ידי הכללת אנטיגנים מעניינים בלוחית המקור המחזיקה את ספריית האנטיגן. בנוסף, אנו מראים כיצד ניתן להשתמש בזוג נוגדנים משניים כדי להפריד בין תגובתיות IgG ו-IgM על אותו משטח שקופית. כעת ביצענו אופטימיזציה של טכניקה זו למדידת נוגדנים עצמיים הן בבני אדם והן בעכברים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטיגנים מדללים 1. יצירת Microarrays Antigen

  1. לדלל אנטיגנים ב PBS לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. הדפס עד 162 אנטיגנים ייחודיים כפולים עם תצורת microarrayer עם 9 פינים. כלול אנטיגנים IgG ו IgM בספריית אנטיגן בקרות חיוביות כמו. כלול PBS רק כביקורת שלילית.
  2. הוסף 20 μl של כל אנטיגן 384 צלחת המקור הטובה. להוסיף אנטיגנים לצלחת מקור בקבוצות המשקפות את ההתקנה של ראש ההדפסה (למשל, לארגן אנטיגנים בקבוצות של 9 כאשר 9 פינים משמשים להדפסה).
  3. צלחת מקור מכסים בנייר כסף ולהקפיא ב -80 ° C עד מוכן להדפיס מערכים.
  4. נקה סיכות microarrayer מוצקות על ידי דוגר אותם באמבט sonicating עם מים ללא יונים עבור דק '3 x 1. סיכות מקום על המדף להתייבש ואז לארגן סיכות ראש ההדפסה microarray. במשך 9 סיכות, להשתמש בתצורת 3 x 3.
  5. תכנית microarrayer לדפוס מנוהלת על ידי הגדרת סיכות מספר על ראש הדפסה,מספר השקופיות להדפיס, מספר כריות על כל שקופית, ואת מספר הנקודות לשכפל לכל אנטיגן. בדרך כלל, השתמש 9 פינים, 70 מגלשות, 2 רפידות / שקופיות, ו -2 נקודות לשכפל לכל אנטיגן. microarrayer תוכנית כדי sonicate סיכות במים בין קבוצות שונות של אנטיגנים.
  6. צלחת מקור להפשיר ואז צלחת צנטריפוגות במשך 1 דקות ב 100 x ז. מניחים מקור צלחת במקום המיועד microarrayer. הסר את החלק של רדיד שמכסה קבוצת אנטיגנים הראשונה שיודפס.
  7. מסדרים שקופיות שלא הודפסו על משטח arrayer ותוכנית הדפסה לרוץ. הדפס שקופיות ב RT עם לחות להגדיר על arrayer ב 55 - 60% עם הגרסה ב- אדים של מכונה המערך.
  8. אחרי כל קבוצה של אנטיגנים מודפסת על כל השקופיות, להשהות את microarrayer. מכסה את אנטיגנים כי הודפסו רק בנייר כסף (כדי למנוע אידוי) ולחשוף את קבוצת אנטיגנים הבאה להדפסה. המשך תכנית להדפיס.
  9. אחרי הכל אנטיגנים הודפסו, מקור כיסוי plאכול עם חתיכת נייר ולהקפיא חדש ב -80 מעלות צלזיוס. מניח שקופיות מודפסות תיבת שקופיות חותמת ואקום. שקופיות ניתן להשתמש למחרת או עד חודש לאחר מכן.

2. גשוש Microarrays Antigen עם מדולל סר

  1. מניח שקופיות לתוך מסגרות באמצעות תאי דגירה. הוסף 700 μl של חיץ חסימה (2.5% [כרך / כרך] נסיוב עגל העוברי (FCS), [כרך / כרך] 0.1% Tween 20 ב PBS) לכל משטח מערך.
  2. מניח סרט דבק מעל המסגרת ומניח במכל אטום עם פיסת הרקמה רטובה. דגירה O / N ב 4 ° C על כיסא נדנדה.
  3. לדלל דגימות סרום 1: 100 בחסימת המאגר. לשאוב פתרון לחסימת מערכים ולהוסיף 500 μl של מדגם בדילול לכל משטח המערך.
  4. מכסים עם סרט דבק דגירה במשך שעה 1 ב 4 ° C עם נדנדה.
  5. מדולל נוגדנים משני בחסימת המאגר. עבור מחקרים בבני אדם, לדלל נוגדן IgG Cy3 שכותרתו עז נגד אדם כדי 0.33 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו Cy5 שכותרתו עז נגד הומאn IgM נוגדנים 0.25 מיקרוגרם / מ"ל. עבור מחקרים העכבר, לדלל Cy3 שכותרתו עז נגד העכבר נוגדן IgG 0.38 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו Cy5 שכותרתו עז נגד העכבר נוגדן IgM 0.7 מיקרוגרם / מ"ל.
  6. לשאוב דגימות מערכים ולשטוף משטחי מערך 4 פעמים עם חיץ לשטוף (0.1% Tween 20 ב PBS). יוצקים חיץ על מנת מגלשות מכבה במהירות.
  7. הוסף 700 μl של חיץ חסימת לשטוף כל משטח מערך דגירה 10 דקות ב RT עם נדנדה. צעד חזור על לשטוף פעמיים נוספות.
  8. הוסף 500 μl של נוגדנים משני מדוללים לכל משטח שקופית ומכסה סרט דבק. דגירה 45 דקות ב 4 ° C עם נדנדה.
  9. לשאוב תערובת נוגדנים משני מן השקופיות ולשטוף 4 פעמים כנ"ל. לשטוף מחליק 3 פעמים עם 700 μl של חסימה / דילול חיץ כנ"ל.
  10. סר שקופיות ממסגרות ומניחים מתלים מתכת שקופית כי הוא שקוע PBS. דגירה 20 דקות ב RT עם רעד מסלולית. מניחים במיכל החדש של PBS ו דגירה עוד 20 מ 'ב עם רעד.
  11. מקום מתל שקופיות במכל של סעיף 15 מים ללא יונים. מניח מתל במכל מים חדש דגירה עוד 15 שניות.
  12. לשקופיות יבשות, מתל שקופית מקום על מתאם צלחת ELISA בצנטריפוגה ספין ב 220 XG במשך 5 דקות ב RT.
  13. מניח שקופיות בתיבת אור חזקה עד מוכן לסריקה.

3. Microarrays Antigen סריקה וייצוא נתונים

  1. שקופיות סריקה באמצעות סורק microarray שיכולים לזהות אותות ניאון Cy3 ו Cy5. על מנת להתאים את הצינור המכפיל (PMT) הרמות של הסורק, טרום לסרוק שקופיות אשר חקרו רק עם נוגדנים משני.
    הערה: שקופית זה צריכה לכלול את ספריית אנטיגן המלאה מודפסת עליו כולל חיובי (IgG ו IgM) כמו גם שלילי שולט (PBS). The-הסריקה מראש היא סריקה ברזולוציה נמוכה המאפשרת למשתמש לאתר במהירות את גדרות PMT האופטימליות.
  2. הגדר את ערכי PMT כך תכונות IgG אדם (בערוץ Cy3) ואת הזמזוםיש תכונות IgM (בערוץ Cy5) א עוצמת הקרינה מינוס רקע החציוני דומה (MFI-B) (בדרך כלל 40,000). רמות PMT נקבעות על ידי לחיצה על כפתור "חומרה". לאחר ההגדרה, לשמור הגדרות PMT אלה קבוע.
  3. סרוק את השקופיות הניסיוניות על שני הערוצים על ידי לחיצה על כפתור "סריקה". שמור את השקופיות (בשני הערוצים) לאחר כל סריקה.
  4. טען את השקופיות להיות מנותח לתוך התוכנה microarray באמצעות כפתור "קובץ".
  5. טען את רשימת מערך הגנים (GAL) הקובץ באמצעות כפתור "קובץ". קובץ GAL יש את הפריסה של המערך עם הזהויות של תכונות המערך.
  6. מניחים את התבנית מערך מעל התמונה הסרוקה כך תכונות מערכים להתאים את התבנית ככל האפשר.
  7. יישר תכונות בכל בלוקים עם התבנית על ידי לחיצה על הכפתור "align". התכנית תהיה בדרך כלל למצוא את קווי המתאר של התכונות העגולות אבל כמה התאמות ידניות ייתכן שתהיינה צורך. התאמות אלה יכולים להתבצע על ידי כניסה למצב תכונה. התוכנה אז תחשב MFI-B עבור כל אחד אנטיגנים.
  8. השתמש בלחצן "קובץ" לייצא את התוצאות הללו כקובץ טקסט.

4. נתוני מערך ניתוח עם ניתוח המשמעות של Microarrays (SAM)

  1. לטעון קבצי טקסט בודדים לתוך Excel ולזהות את העמודות שיש MFI-B עבור ערוצי Cy3 ו Cy5.
  2. חישוב הממוצע עבור תכונות כפולות.
  3. עבור כל MFI-B שלילי, להחליף את המספר השלילי עם 10. Transform נתונים על ידי חלוקת MFI-B גלם ב -100 ולאחר מכן על ידי חישוב יומן בסיס 2.
  4. לנתח נתוני יומן הפך עם ניתוח המשמעות של Microarrays (SAM) כפי שתואר לעיל 7.
  5. עבור מחקר באמצעות שתי קבוצות (לדוג ', אמצעי לעומת מטופלים בריאים), התווית קבוצה אחת "1" לבין הקבוצה "2." השתמש ניתוח מזווג, השנייה בינוני SAM לזהות reactivities אנטיגנים כי הם יםignificantly שונה בין שתי הקבוצות (ערך q <0.05).
  6. השתמש מניב אשכולות וחום-מפת תוכנה כדי להפוך את תמונות עבור מצגת 8.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטיגנים מסודרים צלחת 384 היטב מודפסים על גבי שקופיות על ידי microarrayer רובוטית כפי שמוצג באיור 1. איור 2 מראה שקופיות להציב מסגרת עם תאי הדגירה שקופית סרק לאחר עיבוד. איור 3 מציג שקופיות בקרה חיובית ושלילית. השקופית השלילית חקרה רק עם נוגדנים משני וגלישת הבקרה החיובית היא חקרה עם סרום מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית. באמצעות בנפרד שני נוגדנים משני שכותרתו, IgG ו- IgM reactivities ניתן להפריד על אות...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר כימות של נוגדנים עצמיים באמצעות טכניקת microarray אנטיגן. microarrays Antigen להציע מספר יתרונות על פני קונבנציונאלי ELISA ב בדיקות סקר לאיתור נוגדנים עצמיים. קודם כל, מגוון רחב של אנטיגנים כולל חומצות גרעין, חלבונים, פפטידים, ו lysates תא ניתן ערוך על השקופיות צופה nitrocellulose, ובכך מאפשר להקרנה מרובבת של נוגדנים עצמיים. בנוסף, רק מיקרוגרם של אנטיגן נחוץ על מנת ליצור את המערכים מאז nanoliters של אנטיגן הם הבחינו על כל שקופית. המערכים גם דורשים מדגם מ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מקרן הלב והשבץ של קנדה ותוכנית ההכשרה ברפואה רגנרטיבית (המכונים הקנדיים לחקר הבריאות). F.Y.Y.H. נתמך על ידי תוכנית ההכשרה ברפואה רגנרטיבית. עבודה זו מומנה על ידי מענק מ-Astellas Pharma Canada. אנו גם רוצים להודות לד"ר Mark Menenghini (אוניברסיטת טורונטו) על השימוש בסורק המיקרו-מערך Axon שלו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ריבוזומלי P0Diarect14100מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
אנושי IgGJackson Immuno009-000-003מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
אנושי IgMJackson Immuno009-000-012מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל בעכבר PBS
IgG Sigma-AldrichI5381מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל בעכבר PBS
IgMBiolegend401601לדלל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
DNA דו-גדיליSigma-AldrichD1626לדלל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
חד-גדיליSigma-AldrichD8899לדלל ל-0.2 מ"ג/מ"ל
במיקרו-מערךVirtekVersArray Chipwriter Proסוגים רבים של מערכים מתאימים
סיכות הדפסה מוצקותArrayit CorporationSSP015
תוכנה למיקרו-מערך רובוטיVirtekChipwriter Pro 
שקופיות מהירות (2 פדים)GVS Northa America10485317
מסגרת מהירהGVS נורת'ה אמריקה10486001
תאי דגירה מהירים (2 רפידות)GVS Northa America10486242
384 צלחותבאר Whatman7701-5101
אוטמי צלחותVWR60941-062
כיסוייצלחות נייר כסףVWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
סרום עגל עובריInvitrogen12483020
Cy3 עז אנטי אנושי IgGJackson Immuno109-165-096השתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Cy5 עז אנטי אנושי IgMJackson Immuno109-175-129השתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Cy3 עז נגד עכבר IgGג'קסון אימונוס115-165-071להשתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Cy5 עז אנטי עכבר IgMJackson Immuno115-175-075להשתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Microarray סורקהתקנים מולקולרייםAxon 4200A
Microarray תוכנהמולקולרייםGenepix 6.1
אשכולות תוכנהeisenlab.orgאשכול 3.0
תוכנת מפת חוםeisenlab.orgTreeview 1.60
תוכנה סטטיסטית Microarrayאוניברסיטת סטנפורדSAM 4.0 (ניתוח מובהקות של מיקרו-מערכים)
DNA PBS מכשירים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention. Autoimmun Rev. 14, 555-563 (2015).
  3. Robinson, W. H., et al. Autoantigen microarrays for multiplex characterization of autoantibody responses. Nature. medicine. 8, 295-301 (2002).
  4. Quintana, F. J., et al. Antigen microarrays identify unique serum autoantibody signatures in clinical and pathologic subtypes of multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18889-18894 (2008).
  5. Hueber, W., et al. Antigen microarray profiling of autoantibodies in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 52, 2645-2655 (2005).
  6. Price, J. V., et al. Protein microarray analysis reveals BAFF-binding autoantibodies in systemic lupus erythematosus. J. Clin. Invest. 123, 5135-5145 (2013).
  7. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98, 5116-5121 (2001).
  8. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95, 14863-14868 (1998).
  9. Chruscinski, A., et al. Generation of Antigen Microarrays to Screen for Autoantibodies in Heart Failure and Heart Transplantation. PloS one. 11, e0151224(2016).
  10. Price, J. V., et al. Characterization of influenza vaccine immunogenicity using influenza antigen microarrays. PloS one. 8, e64555(2013).
  11. Singh, H., et al. Reactivity profiles of broadly neutralizing anti-HIV-1 antibodies are distinct from those of pathogenic autoantibodies. Aids. 25, 1247-1257 (2011).
  12. Porcheray, F., et al. Chronic humoral rejection of human kidney allografts associates with broad autoantibody responses. Transplantation. 89, 1239-1246 (2010).
  13. Haddon, D. J., et al. Mapping epitopes of U1-70K autoantibodies at single-amino acid resolution. Autoimmunity. 48, 513-523 (2015).
  14. Schroeder, H. W. Jr, Cavacini, L. Structure and function of immunoglobulins. J Allergy Clin Immunol. 125, S41-S52 (2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Antigen MicroarrayAutoantibody DetectionTwo color DetectionIgG IgM DetectionMicroarray PrintingSerum ProbingFluorescent ScanningPBS BlockingSecondary AntibodySlide Alignment

מאמרים קשורים