Method Article

דור שני צבעים Antigen Microarrays לאיתור סימולטני של IgG ו- IgM נוגדנים עצמיים

DOI:

10.3791/54543

⸱

September 15th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Multi-Organ Transplant Program, University Health Network, 2Institute of Medical Science, University of Toronto, 3Divison of Neurosurgery, University Health Network, 4Division of Cardiac Surgery, University Health Network

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן שיטה ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן הניתנים להתאמה אישית שניתן להשתמש בהם לזיהוי בו-זמני של נוגדנים עצמיים IgG ו-IgM בסרום מבני אדם ועכברים. מערכים אלה מאפשרים זיהוי תפוקה גבוהה וכמותית של נוגדנים כנגד אנטיגנים או אפיטופים מעניינים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים עצמיים, שהם נוגדנים נגד אנטיגנים עצמיים, נמצאים במצבי מחלה רבים ויכולים לשמש כסמנים לפעילות המחלה. רמות הנוגדנים העצמיים לאנטיגנים ספציפיים מזוהות בדרך כלל בטכניקת בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים (ELISA). עם זאת, בדיקת נוגדנים עצמיים מרובים עם ELISA יכולה להיות גוזלת זמן ודורשת כמות גדולה של דגימת חולים. טכניקת מיקרו-מערך האנטיגן היא שיטה חלופית שניתן להשתמש בה כדי לסנן נוגדנים עצמיים בצורה מרובה. בטכניקה זו, אנטיגנים מסודרים על שקופיות מיקרוסקופ מצופות במיוחד עם מיקרו-מערך רובוטי. השקופיות נבדקות עם דגימות סרום של מטופלים ולאחר מכן מתווספים נוגדנים משניים עם תווית פלואורסצנטית כדי לזהות קשירה של נוגדנים עצמיים בסרום לאנטיגנים. תגובתיות הנוגדנים העצמיים מתגלה ומכומתת על ידי סריקת השקופיות עם סורק שיכול לזהות אותות פלואורסצנטיים. כאן אנו מתארים שיטות ליצירת מיקרו-מערכי אנטיגן מותאמים אישית. המערכים הנוכחיים שלנו מודפסים עם 9 פינים מוצקים ויכולים לכלול עד 162 אנטיגנים המנוקדים בשכפול. ניתן להתאים את המערכים בקלות על ידי שינוי האנטיגנים בלוחית המקור המשמשת את המיקרו-מערך. פיתחנו סכימת זיהוי נוגדנים משנית דו-צבעונית שיכולה להבחין בתגובתיות IgG ו-IgM על אותו משטח שקופיות. מערכת הזיהוי עברה אופטימיזציה לחקר קשירת נוגדנים עצמיים אנושיים ועכברים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים עצמיים קיימים במצבי מחלה רבים ולעתים קרובות יכולים להיות בעלי פעילות פתוגנית ישירה1. זיהוי נוגדנים עצמיים חשוב לאבחון מחלות מסוימות, לפרוגנוזה של תוצאות המחלה ולסיווג חולים שעשויים להפיק תועלת מטיפולים ספציפיים2. נוגדנים עצמיים מזוהים בדרך כלל בסרום המטופל באמצעות טכניקת ELISA; עם זאת, בדיקת אנטיגנים מרובים בטכניקה זו היא מייגעת וצורכת כמות גדולה של דגימת חולים. לכן יש צורך בטכנולוגיות חדשות כדי ליצור פרופיל של נוגדנים עצמיים בקנה מידה גדול יותר.

טכניקת מיקרו-מערך האנטיגן היא טכנולוגיה פרוטאומית המאפשרת לאפיין נוגדנים עצמיים בצורה מרובה3. בשלב הראשון של תהליך זה, ספריית אנטיגן מסודרת על משטח שקופיות ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטיגנים מדללים 1. יצירת Microarrays Antigen

  1. לדלל אנטיגנים ב PBS לריכוז סופי של 0.2 מ"ג / מ"ל. הדפס עד 162 אנטיגנים ייחודיים כפולים עם תצורת microarrayer עם 9 פינים. כלול אנטיגנים IgG ו IgM בספריית אנטיגן בקרות חיוביות כמו. כלול PBS רק כביקורת שלילית.
  2. הוסף 20 μl של כל אנטיגן 384 צלחת המקור הטובה. להוסיף אנטיגנים לצלחת מקור בקבוצות המשקפות את ההתקנה של ראש ההדפסה (למשל, לארגן אנטיגנים בקבוצות של 9 כאשר 9 פינים משמשים להדפסה).
  3. צלחת מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנטיגנים מסודרים צלחת 384 היטב מודפסים על גבי שקופיות על ידי microarrayer רובוטית כפי שמוצג באיור 1. איור 2 מראה שקופיות להציב מסגרת עם תאי הדגירה שקופית סרק לאחר עיבוד. איור 3 מציג שקופיות בקרה חיובית ושלילית. השקופית השלילית חקרה רק עם נוגדנים משני וגלישת הבקרה החיובית היא חקרה עם סרום מחול עם זאבת אדמנתית מערכתית. באמצעות בנפרד שני נוגדנים משני שכותרתו, IgG ו- IgM reactivities ניתן להפריד על אות.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר כימות של נוגדנים עצמיים באמצעות טכניקת microarray אנטיגן. microarrays Antigen להציע מספר יתרונות על פני קונבנציונאלי ELISA ב בדיקות סקר לאיתור נוגדנים עצמיים. קודם כל, מגוון רחב של אנטיגנים כולל חומצות גרעין, חלבונים, פפטידים, ו lysates תא ניתן ערוך על השקופיות צופה nitrocellulose, ובכך מאפשר להקרנה מרובבת של נוגדנים עצמיים. בנוסף, רק מיקרוגרם של אנטיגן נחוץ על מנת ליצור את המערכים מאז nanoliters של אנטיגן הם הבחינו על כל שקופית. המערכים גם דורשים מדגם מ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A.C. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט מקרן הלב והשבץ של קנדה ותוכנית ההכשרה ברפואה רגנרטיבית (המכונים הקנדיים לחקר הבריאות). F.Y.Y.H. נתמך על ידי תוכנית ההכשרה ברפואה רגנרטיבית. עבודה זו מומנה על ידי מענק מ-Astellas Pharma Canada. אנו גם רוצים להודות לד"ר Mark Menenghini (אוניברסיטת טורונטו) על השימוש בסורק המיקרו-מערך Axon שלו.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ריבוזומלי P0Diarect14100מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
אנושי IgGJackson Immuno009-000-003מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
אנושי IgMJackson Immuno009-000-012מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל בעכבר PBS
IgG Sigma-AldrichI5381מדולל ל-0.2 מ"ג/מ"ל בעכבר PBS
IgMBiolegend401601לדלל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
DNA דו-גדיליSigma-AldrichD1626לדלל ל-0.2 מ"ג/מ"ל ב-PBS
חד-גדיליSigma-AldrichD8899לדלל ל-0.2 מ"ג/מ"ל
במיקרו-מערךVirtekVersArray Chipwriter Proסוגים רבים של מערכים מתאימים
סיכות הדפסה מוצקותArrayit CorporationSSP015
תוכנה למיקרו-מערך רובוטיVirtekChipwriter Pro 
שקופיות מהירות (2 פדים)GVS Northa America10485317
מסגרת מהירהGVS נורת'ה אמריקה10486001
תאי דגירה מהירים (2 רפידות)GVS Northa America10486242
384 צלחותבאר Whatman7701-5101
אוטמי צלחותVWR60941-062
כיסוייצלחות נייר כסףVWR60941-124
Tween-20Fisher ScientificBP337-500
סרום עגל עובריInvitrogen12483020
Cy3 עז אנטי אנושי IgGJackson Immuno109-165-096השתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Cy5 עז אנטי אנושי IgMJackson Immuno109-175-129השתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Cy3 עז נגד עכבר IgGג'קסון אימונוס115-165-071להשתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Cy5 עז אנטי עכבר IgMJackson Immuno115-175-075להשתמש במלאי עבודה ב 50% glyercol
Microarray סורקהתקנים מולקולרייםAxon 4200A
Microarray תוכנהמולקולרייםGenepix 6.1
אשכולות תוכנהeisenlab.orgאשכול 3.0
תוכנת מפת חוםeisenlab.orgTreeview 1.60
תוכנה סטטיסטית Microarrayאוניברסיטת סטנפורדSAM 4.0 (ניתוח מובהקות של מיקרו-מערכים)
DNA PBS מכשירים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naparstek, Y., Plotz, P. H. The role of autoantibodies in autoimmune disease. Annu Rev Immunol. 11, 79-104 (1993).
  2. Damoiseaux, J., Andrade, L. E., Fritzler, M. J., Shoenfeld, Y. Autoantibodies 2015: From diagnostic biomarkers toward prediction, prognosis and prevention....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Antigen MicroarrayAutoantibody DetectionTwo color DetectionIgG IgM DetectionMicroarray PrintingSerum ProbingFluorescent ScanningPBS BlockingSecondary AntibodySlide Alignment

Related Articles