מאמר שיטה

שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים

DOI:

10.3791/54555

⸱

23 באוקטובר 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Department of Bioengineering, University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Medicine, Division of Cardiology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיוציטים צומת Sinoatrial (Sams) לשמש כמנהל הקוצבים הטבעיים של הלב, לביצוע כל לב הכה על ידי יצירת פוטנציאל פעולה ספונטני (APS). נקודות גישה הקוצבות אלה משקפים את הפעילות המתואמת של זרמי קרום רבים ורכיבה על אופני סידן תוך תאים. עם זאת המנגנון המדויק אשר מוביל פעילות קוצב ספונטנית סאמס להישאר חמקמק. סאמס מבודדים בחריפות מהווים הכנה הכרחית ניסויים כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של pacemaking הלב. עם זאת, לא בוררת את האנטומיה, microdissection המורכב, ותנאי עיכול אנזימטי בררנים מנעו שימוש נרחב של סאמס בחריפות המבודדת. בנוסף, שיטות לא היו זמינות עד לאחרונה להתיר תרבות לטווח הארוך של סאמס ללימודי ביטוי חלבון. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול ווידאו הפגנה למען בידודה של סאמס מעכברים בוגרים. שיטה מודגמת גם לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה עבור expressiעל חלבונים אקסוגניים באמצעות זיהום adenoviral. בחריפות מבודדים סאמס תרבותי מוכן באמצעות שיטות אלה מתאימים מגוון רחב של מחקרים אלקטרו הדמיה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיוציטים קוצבים צומת sinoatrial של הלב (myocytes sinoatrial, "סאמס") ליצור פוטנציאל פעולה ספונטני, אומנותי (APS) כי להפיץ דרך שריר הלב ליזום כל לב. ניסויים באמצעות סאמס מבודד בחריפויות ממינים רבים היו חיוניים לגיבוש מבהיר המנגנונים לתרום לדור של פעילות קוצבת. סאמס הוא מאוד cardiomyocytes מיוחד שונה באופן מהותי מן עמיתיהם שריר לב הפרוזדורים חדרית מבחינת מורפולוגיה, פונקציה, ביטוי חלבון. המאפיין העיקרי של נקודות גישה ספונטנית סאמס היא שלילת קוטביות ספונטנית במהלך דיאסטולה שמניע את פוטנציאל הממברנה אל סף כדי לעורר את הבא AP 1,2. זה "פוטנציאל קוצב לב" תלוי בפעילות המתואמת של זרמי קרום שונים כולל "הנוכחי המצחיק" (אני F), T-וזרמי סידן L-סוג, ואת curr מחליף נתרן-סידןאף אוזן גרון (אני NCX), אשר מונע על ידי שחרור 2 + Ca מן הרטיקולום sarcoplasmic 3,4.

בעוד סאמס העכבר מבודדים בחריפות מהווים הכנה ניסיוני חיוני לחקר pacemaking, בידודה של סאמס מעכברים יכולה להיות שיטה מאתגר לאמץ בגלל האנטומיה ברור וגודל קטן של SAN העכבר דורש microdissection ניואנסים ואת האנזימטית בשילוב מכני דיסוציאציה של תאים דורש אופטימיזציה זהיר.

אנו מספקים כאן הפגנת וידאו מפורטת של פרוטוקול נוצל בהצלחה לבודדת סאמס מעכברים בוגרים עבור צמד תיקון הקלטות 5-8. למיטב ידיעתנו, אין הפגנה ויזואלית כגון זמינה מכל מקור אחר. בנוסף, שיטה חדשה מודגמת שבודד סאמס מעכברים בוגרים יכול להישמר במבחנה במשך מספר ימים, ובכך לאפשר הכניסה של חלבונים, מקודד גנטימולקולות כתב או RNAi באמצעות זיהום adenoviral 9.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קמפוס רפואי קולורדו אנשוץ. הפרוטוקול הסטנדרטי להלן עבר אופטימיזציה באמצעות זכר C57BL / 6J של 2-3 חודשים של גיל.

1. הכין מניות ואספקת פתרון מראש של ניסויים

הערה: עיין ב חומרי שולחן ציוד ואספקת צורך.

  1. הכן 1 ליטר כל אחד מהפתרונות הבאים כמצוין בטבלה 1: של Tyrode השלם, נמוך Ca 2 + / Mg 2+ Tyrode של, השתנה קראפט-Brühe (KB) פתרון, ואת שור סרום אלבומין (BSA) פתרון. ultrapure השתמש מסוננים מים ללא יונים עבור כל פתרונות. מחלקים כל פתרון לתוך aliquots ולאחסן 50 מ"ל ב 20 מעלות צלזיוס למשך עד שישה חודשים. להפשיר aliquots הפרט מיד לפני ניסויים, ולאחסן עד שבוע ב 46; C.
  2. הכן 50 מ"ל של 10 מ"מ NaCl ו -1.8 מ"מ CaCl 2 פתרון הסתגלות ידי המסת NaCl ו CaCl 2 במים deionized מסונן ultrapure (טבלה 1). אחסן בטמפרטורת החדר למשך עד שישה חודשים.
  3. הכן 4.75 יחידת פעילות האנזים (U) aliquots של אלסטט ידי pipetting לתוך צינורות microfuge. חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
  4. הכן 375 מיקרוגרם aliquots (ב ultrapure H 2 O) של תערובת אנזים collagenase-פרוטאז ידי pipetting לתוך צינורות microfuge. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שלושה חודשים.
  5. הכינו שתי טפטפות פסטר אש מלוטש, אחד עבור העברת רקמות (~ 1.5 מ"מ קוטר הפתח הסופי; איור 1Aiv ואיור 1C) ואחד עבור דיסוציאציה (~ 2 מ"מ קוטר; איור 1Aiii ואיור 1C).
    1. טפטפות ציון פסטר עם חתכי זכוכית ולהצמיד יחד את התוצאה ל לייצר פתח מעט גדול יותר בגודל הרצוי. אֵשׁ-פולנית לסוף חתך של כל פיפטה עבור ~ 30-60 שניות על אש קטנה על מבער בונזן לייצר קיר עבה מלוטשים פתח בקוטר הרצוי. ודא פתיחת האש המלוטשת נקיה מכל סדקים או קצוות מחוספסים.
  6. הכינו שתי מנות לנתיחה על ידי הוספת ~ 25 מ"ל אלסטומר סיליקון מעורב על פי הוראות היצרן לכל צלחת פטרי 100 מ"מ (איור 1Ai ואיור 1B). אפשר לרפא בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות.
  7. עבור התרבות היחידה: להכין 25-50 מ"ל כל בינוני ציפוי ותרבות בינוני לפי טבלה 2 חנות עד שבועיים ב 4 ° C...

2. הכינו פתרונות כדי לשמש על יום של בידוד תא

הערה: הסכומים הבאים לבידוד תרמי של מיוציטים sinoatrial מעכבר אחד.

  1. להוסיף 2.5 מ"ל של נמוך Ca 2 + / Mg 2+ של Tyrode (pH 6.9) לכל אחת משלוש צינור תרבות קטן, עגול תחתיתים. מקום צינורות באמבט מים 35 ± 1 ° C.
  2. להוסיף 2.5 מ"ל של נמוך Ca 2 + / Mg 2 + של Tyrode אחד צינור תרבות גדול עגול תחתית. כדי צינור זה, להוסיף 1 aliquot (4.75 U) אלסטט ו aliquot אחד (375 מיקרוגרם) תערובת אנזימים פרוטאז collagenase. מערבולת לערבב. צינור מקום ב 35 ± 1 ° C אמבט מים.
  3. להוסיף 2.5 מיליליטר של KB בינוני עד שלושה צינורות תרבות קטנים נוספים, עגולים תחתיים ואחד צינור תרבות גדול נוסף, עגול תחתי. מקום צינורות באמבט מים 35 ± 1 ° C.
  4. הוסף ~ 7 מ"ל של תמיסת BSA לאחד צינור תרבות תחתית גדול. שמור צינור זה בטמפרטורת החדר.
  5. מניחים 20-40 מ"ל של תמיסת של השלם Tyrode בכוס 50 מ"ל (איור 1Aii). הוסף 10 הפרין USP / מ"ל, מערבולת לערבב, ומניחים את הכוס באמבט מים 35 ± 1 ° C.

3. הכינו פתרונות וחומרים נוספים עבור תאים בתרבית (דלגו אלה צעדי תאים מבודדים בחריפות)

  1. במנדף בתרבית רקמה סטרילית, הנח שתי 12 מ"מ coverslips זכוכית עגולה לכל עכבר לתוך בארות בודדות של צלחת 24 באר.
    הערה: הצלחת גם 24 משמשת כי הבארות הן בגודל נוח, אשר ממשמש כדי להגביל את עוצמת הקול עבור זיהומים נגיפיים שלאחר מכן.
  2. פיפטה כ 200 μl של פתרון 100 ng / ml של laminin עכבר מדולל בופר פוספט סטרילית (PBS) על כל coverslip.
  3. דגירה coverslips עם laminin למשך הבידוד (לפחות שעה 1) באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
  4. טרום חמים הבינוני הציפוי ותרבות הבינונית (מ שלב 1.7 ולוח 3) עד 37 מעלות צלזיוס.

4. בידוד צומת Sinoatrial

  1. במנדף כימי קטר, למקם עכבר בתא אחד של קופסת שני קאמרית להרדים עם ~ 200 μl isoflurane נוזלי הציג באמצעות מקלון צמר גפן לתוך תא אחר. אשר הרדמה (בדרך כלל תוך ~ 30-60 שניות) עם קמצוץ הבוהן. להרדיםהעכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
    הערה: תיבת קצה פיפטה ריק 1 מ"ל ניתן להשתמש כדי ליצור את תיבת שני קאמרית; להפוך את מתלה במהופך בתיבת ליצור תא נפרד עבור isoflurane כדי למנוע את העכבר מן ההתקשרות עמה ישירות.
  2. סור פרווה מחזה עם כלוב מספרי חתך צלע לחשוף את חלל החזה באמצעות מלקחי רקמות חיצוניים (איור 1Aviii) ומספרי דיסקציה (איור 1Avix). לרחוץ את חלל החזה עם ~ 2 מ"ל חימם השלם Tyrode של עם הפרין בעזרת פיפטה ההעברה.
    הערה: המשך חלל החזה רחצה בעת הצורך, אינם מאפשרים הכנה להתייבש.
  3. תחת מיקרוסקופ לנתח, להסיר בזהירות את הריאות התימוס באמצעות מספריים פנימיים (איור 1Avi) מלקחי דיסקציה (איור 1Avii).
  4. תוך כדי לחיצה על הקודקוד בעדינות של הלב עם מלקחיים דיסקציה פנימי, לחתוך בזהירות את הווריד הנבוב נחות אאורטה עם המספריים הפנימיים כדי להסיר את לב מחלל החזה. מעבירים את הלב אחת המנות סיליקון לנתיחה להתרחץ עם ~ 4 מ"ל חימם heparinized השלם Tyrode של בעזרת פיפטה ההעברה.
  5. אוריינט בלב כגון שהכלים האחוריים גלויים ומופנה כלפי מעלה, עם העלייה הימנית של החיה על אטריום על ימין ועל שמאל של הנסיין על השמאלי של הנסיין. לאחר אוריינטציה, לשתק את הלב על ידי מצמיד דרך איפקס לתוך צלחת סיליקון לנתיחה.
  6. אתר את החריץ בין החדרים ואת הפרוזדורים (הטבעת ברורה מעל החדרים).
  7. בעזרת המספריים לנתיחה הפנימיים, עושה חתך בחלק הגרוב, שמירה קרובה החדרים מ הפרוזדורים. שטוף את חריץ חתך עם Tyrode השלם נוסף חמם heparinized כמו של נדרש כדי לאפשר תצוגה ברורה של הפרוזדורים ואת השסתומים. המשך לחתוך לאורך החריץ להפריד בין הפרוזדורים מן החדרים.
  8. העברת רקמות פרוזדורים אל המנה השנייה סיליקון לנתיחה להתרחץ עם ~ 3 מ"ל חימם heparinized השלם Tyrode של.
  9. אוריינט הרקמה כך אטריום ימין של החיה הוא עכשיו על השמאל הנסיין, ואת אטריום שמאל נמצא בצד ימין.
    הערה: אטריום ימין הוא יותר שקוף, תוך הפרוזדור השמאלי יש יותר של בטון אדום כהה.
  10. הצמד את הרקמה דרך cavae הנבוב הנח המעולה ובזכות נספחי פרוזדורי שמאל, מתיחה הכנה בעדינות. הסר את כל רקמת שומן או אחרת הנותרים כדי לאפשר תצוגה ברורה של התכשיר (להיזהר לא לחתוך לתוך קיר הפרוזדורים, כצומת sinoatrial היא עדינה למדי, יכולה להיפגע בקלות).
  11. פתח את הקיר הקדמי של הפרוזדורים ידי חיתוך דרך cavae venae. Re-למקם את הסיכות כמו צורך לדמיין מחץ interatrial.
  12. חותכים לאורך מחצה interatrial להסיר אטריום שמאל. Re פינים הכנה, מתיחה בעדינות.
  13. הסר tהוא צודק פרוזדורים תוספת ולשחרר את הצומת sinoatrial ידי חיתוך לאורך terminalis cristae, אשר נראה כמו פס כתום כהה הגובל תוספת פרוזדורים.
  14. Re פינים הרקמה קטרי ופצע אותו רוחבית (בניצב terminalis crista) לייצר שלוש רצועות שוות בגודלן.

5. עיכול צומת Sinoatrial

  1. בעזרת פיפטה אש מלוטש צר (איור 1Aiv), להעביר את שלוש רצועות של רקמת הצומת sinoatrial במכונית הראשונה מבין שלוש צינורית קטנה, עגול תחתית המכילה 2.5 מ"ל של נמוכה Ca 2 + / Mg 2+ Tyrode של ב -35 ± 1 ° C אמבט מים. דגירה במשך 5 דקות.
  2. העברת רקמות רצועות אל הצינור התחתון קטן, בסיבוב השני המכיל 2.5 מ"ל נמוך Ca 2 + / Mg 2+ Tyrode של באמבט מים 35 ± 1 ° C, תוך שימוש באותה פיפטה צר. שטוף את רצועות רקמה על ידי עדין מתערבל הצינור או על ידי pipetting עם פיפטה הצר בעדינות. האם לא Invert הצינור.
  3. העברת רצועות רקמה אל הצינור התחתון קטן, בסיבוב השלישי המכיל 2.5 מ"ל נמוך Ca 2 + / Mg 2+ Tyrode של, וחזור על השלב כביסה כמתואר בשלב 5.2.
  4. רצועות העברת לתוך הצינור עגול תחתית גדול המכיל 2.5 מ"ל של נמוכה Ca 2 + / Mg 2+ Tyrode של עם אנזימים (אלסטט בתוספת תערובת collagenase-פרוטאז) באמבט מים 35 מעלות צלזיוס. ודא שכל שלוש רצועות הרקמה נוכחות. דגירה של 10-15 דקות ב 35 ± 1 °. מערבבים כל 5 דקות על ידי מתערבל הצינור בעדינות. אין להפוך את הצינור.

6. Sinoatrial צומת Myocyte דיסוציאציה

  1. בעקבות עיכול אנזים, השתמש פיפטה אש מלוטש צר בעדינות להעביר את רצועות רקמה על צינור קטן, עגול תחתית הראשון המכיל פתרון 2.5 מ"ל KB ב 35 ± 1 ° C. לשטוף רקמות ידי מתערבל הצינור בעדינות.
    הערה: רצועות רקמות תופענה שקופות מעט ועשויות גוש ביחד בבית הנקודה. ידית בעדינות רבה לאחר עיכול אנזימטי כדי למנוע אובדן תאים.
  2. העברת הרקמה אל הצינור העגול תחתי הקטן הנוסף שהכיל 2.5 מיליליטר KB ב 35 ± 1 ° C. מערבולת בעדינות כדי לשטוף.
  3. העברת הרקמה אל הצינור העגול תחתי הקטן השלישי המכיל 2.5 מיליליטר KB ב 35 ± 1 ° C. מערבולת בעדינות כדי לשטוף.
  4. העברת הרקמה אל הצינור הגדול, העגול תחתי המכיל 2.5 מיליליטר KB ב 35 ± 1 ° C.
  5. בעזרת פיפטה האש מלוטשת הגדולה (האיור 1Aiii והאיור 1C), לנתק את התאים בצינור העגול תחתי הגדול על ידי טחינת דקה קבועה על כ 0.5-1 הרץ למשך 5-10 דקות, מקפיד לשמור על צינור דיסוציאציה שקוע בתוך 35 ± 1 ° C אמבט מים כדי למנוע החדרת בועות לתוך התמיסה.
    הערה: זמן טחינה דקה משתנה עם קוטר של פיפטה דיסוציאציה והכוח של pipetting. זמן צריך להיות מותאם כך את החלקים הנותרים רקמות בזמן tהוא סוף דיסוציאציה להופיע דק ושקוף ומדובלל. אם הרקמה נותרת עם השקעה כלשהי צבע, ניתוק צפוי להיות שלם. תדר (0.5-1 הרץ) נקבע על ידי יד.
  6. הסר צינור עגול תחתית המכיל ניתק סאמס מן האמבטיה במים לאזן בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.

7. Re-הסתגלות סידן צומת Sinoatrial (מבוצע בטמפרטורת חדר)

הערה: לקבלת סאמס המיועדים ניסויים תרבות, הליך כלשהו בסעיף הבא צריך להתבצע במנדף בתרבית רקמה סטרילית. אם סאמס הוא לשמש לניסויים חריפים, אין צורך לבצע את הפעולות הבאות בסביבת סטרילית.

  1. הוסף 75 μl של NaCl / CaCl 2 פתרון הסתגלות (טבלה 2). מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 5 דקות.
  2. להוסיף 160 μl של פתרון NaCl / CaCl 2 הסתגלות. מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 5 דקות.
  3. להוסיף 390 μl של סול BSAution (טבלה 2). מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 4 דקות.
  4. הוסף 1.25 מ"ל של תמיסת BSA. מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 4 דקות.
  5. להוסיף 4.37 מ"ל של תמיסת BSA. מערבולת בעדינות כדי לערבב דגירה במשך 4 דקות.
    הערה: הריכוז הסופי של סידן יהיה 1.8 מ"מ.
  6. בעקבות מחדש הסתגלות סידן, לאסוף סאמס בכך שהוא מאפשר להתיישב על ידי כוח המשיכה במשך ~ 10 דקות או על ידי צנטריפוגה ב ~ 2,000 XG במשך 3 דקות.
    1. עבור תאים מבודדים בחריפות, בעדינות להסיר ולסלק כ -5 מ"ל של supernatant בעזרת פיפטה פסטר זכוכית, משאיר תאים בנפח של ~ 2 מ"ל. אחסן תאים אלה בטמפרטורת החדר למשך עד ~ 8 שעות עבור הצמד תיקון הקלטות.
    2. עבור תאים בתרבית, להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר בעזרת פיפטה פסטר זכוכית סטרילית. גלולה תא גלולה ב 1 מ"ל מחומם מראש (37 ° C) ציפוי בינוני (טבלה 2).

ציפוי 8. והתרבות של Sinoatrial מיוcytes (דילוג עבור תאים מבודדים בחריפות)

  1. הסר פתרון laminin מ coverslips משלב 3.3 עם פיפטה פסטר. מיד זרע 500 μl (~ 50-100 תאים) על כל coverslip laminin מצופה (משלב 3).
    הערה: monoxime 2,3-butanedione מעכב התכווצות (BDM) נכלל בתקשורת ציפוי ותרבות למנוע התכווצות, הגורמת התשה של תאים 9.
  2. מחזירים את הצלחת 24-היטב המכיל סאמס זורעים החדש אל האינקובטור ולשמור על 37 מעלות צלזיוס באווירה של 95% אוויר / 5% CO 2. אפשר תאים לדבוק coverslips במשך 4-6 שעות ב מדיה ציפוי (טבלה 2).
  3. הוצא בעדינות בינוני ציפוי בעזרת פיפטה פסטר סטרילית. חלף עם 500 μl לכל גם מחומם מראש (37 ° C) בינוני תרבות (טבלה 2).

9. התמרה adenoviral של תרבויות Myocyte Sinoatrial למבוגרים (דילוג עבור תאים מבודדים בחריפות)

  1. הערכת מספר ceLLS לכל coverslip מייד לפני יישום אדנו ידי ספירת תאי שדה הראייה תחת מיקרוסקופ, תקנון ההגדלה. לספור את כל התאים, לא רק סאמס.
  2. לדלל אדנו ב בינוני 199 ולהתאים את דילול עבור כייל הנגיף כך שתחולת 1-10 μl נדרש כדי להשיג ריבוי הסופי של זיהום (משרד הפנים) של 100 יחידות ויראלי לכל תא. הוסף פתרון adenoviral באופן dropwise ישירות על גבי מצופה סאמס.
  3. דגירת תאים עם הלילה במדיום המכיל וירוס (~ 12-14 שעות). ואז להחליף עם מדיום תרבות טרי. שמור על תאי חממה, שינוי התרבות בינונית כל 48 שעות, עד ביטוי חלבון רצוי מתקבל.

10. הערכה תפקודית של סאמס המבודד או מתורבת בחריפות

הערה: הפרוטוקול להלן דוגמא של הערכות תפקודיות של סאמס מבודד באמצעות amphotericin המחורר-תיקון טכניקה להקליט הוא נקודות גישה ספונטניות ואני f מאותו התא (ראה התייחסות 9).

  1. הכינו פתרונות ההקלטה כמתואר בטבלה 3.
  2. כן פתרון מניות של 20 מ"ג / מיליליטר amphotericin-B ב DMSO טרי ביום ההקלטה. שמור המניות בטמפרטורת החדר ולהגן מפני אור. לדלל מניות amphotericin-B פתרון תאי לריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מיליליטר רק לפני השימוש. שמירה על פתרון פיפטה הסופי על הקרח להגן מפני אור.
    הערה: פיפטה המכיל amphotericin פתרון ניסויים צריך להיות מוכן טרי מדי שעה על ידי דילול aliquot של פתרון המניות לתוך התמיסה התאית vortexing דקות לפחות 1.
  3. העבר aliquot של בחריפות ניתק ההשעיה תא SAM או שבר זכוכית coverslip נושאות סאמס תרבותי אל חדר הקלטה המכיל פתרון של Tyrode ב 35 ± 1 ° C. Perfuse תאים עם פתרון של Tyrode לפחות 2 דקות לפני recordin אלקטרוgs כדי להסיר כל BDM שיורית שנותר מן התרבות בינונית.
    הערה: התכווצויות ספונטניות צריכות להיות ברורות מייד עם העברת הפתרון של Tyrode. סאמס להקלטה ניתן לזהות על ידי שילוב של תכונות, כולל פעילות התכווצות ספונטנית, מורפולוגיה אופיינית (למשל., איור 2), חוסר תלמים, ביטוי של חלבון HCN4, בנוכחות הנוכחי אני F, קיבול הממברנה <50 pF, ואת נקודות גישה ספונטנית עם גל הכוללות שלב שלילת קוטביות הדיאסטולי ו upstroke איטי.
  4. באמצעות טפטפות זכוכית בורוסיליקט עם התנגדויות של 1.5-3.0 MΩ, למלא את הקצה עם פתרון תאי חסר amphotericin על ידי טבילה למשך 10-30 שניות. לאחר מכן חזרה למלא את פיפטה עם תמיסה המכילה-amphotericin. חותם GΩ מצורף תא יש לקבל כמה שיותר מהר. אם ההיווצרות חותמת קשה, להאריך את משך זמן טיפ-מילוי.
    הערה: התנגדות הגישה צריכה להיות באופן רציףהפיקוח הבא היווצרות של החותם מצורף התא, והקלטות יש להתחיל לאחר קבלת התנגדות גישה יציבה רק של <10 MΩ.
  5. כדי להקליט נקודות גישה ספונטניות, לעבור את המגבר למצב נוכחי מהדק מהיר ללא הזרקה נוכחית.
    הערה: 1 ננומטר isoproterenol נכלל הפתרון של Tyrode תאי בעת הקלטת נקודות גישה על מנת לייצב את קצב הירי, כפי שדווח בעבר 10.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקולים המתוארים כאן הועסקו בעבר לבודד ספונטני פעיל סאמס מעכברי בוגרים מתאימים מגוון רחב של מחקרי מהדק תיקון שונה 5-8. בנוסף, הפרוטוקולים מאפשרים סאמס מבודדים שאפשר לקיים בתרבות עד שבוע אחד. החדרת גנים לתוך תאים בתרבית יכול להתבצע באמצעות זיהום adenoviral 9. התוצאות המוצגות בסעיף זה נובעים מהעבודות הקודמות שלנו מוצגות כאן כדוגמות המאפיינים של בחריפות סאמס מבודד תרבותי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים עבור הבידוד וההתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial בדיל באופן מלא מעכברים בוגרים. פרוטוקול הבידוד באופן מהימן מייצר סאמס עכבר פעיל באופן ספונטני מתאים לניתוח אלקטרו מיידי או תרבות שלאחר מכן. פרוטוקולים דומים דווחו על ידי קבוצות רבות אחרות (למשל, לראות את הפניות 11,12,10,13-17). עם זאת, הפרוטוקול שלנו לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה משמר את המורפולוגיה האופיינית, פעילות ספונטנית, ואת תכונות אלקטרו של התא ומאפשר למסירת adenoviral של ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר כריסטיאן ריקרט על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01-HL088427) ל-CP. EJS נתמך על ידי 5T32-AG000279 מהמכון הלאומי להזדקנות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ערכת סילגרוארד/אלסטומרדאו קורנינג184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג
בורוסיליקט 9 אינץ' פיפטות פסטורפישר סיינטיפיק13-678-20C
צינורות תרבית קטנים ועגולים עם תחתיתפישר סיינטיפיק352059
צינורות תרבית גדולים ועגולים עם תחתיתקורנינג14-959-11B
אלסטאזוורת'ינגטון LS002279
Liberase TMRoche5401119001תמיסת דיסוציאציה של רקמות
HeparinSAGENT Pharmaceuticals NDC 25021-400-10
עכבר למיניןקורנינגCB-354232
כיסויי זכוכית עגולים 12 מ"מפישר 12-545-80
צלחת תרבית 24 בארותפישר08-772-1
Ad-mCherryוקטור Biolabs1767
Ad-eGFPוקטור Biolabs1060
פלסטיק, פיפטת העברה חד פעמיתפישר סיינטיפיק
17-467-496
דומונט #4 מלקחייםRoboz InstrumentsRS-4904
רקמות מלקחייםRoboz InstrumentsRS-8164
ניתוח איריס מספרייםWPI, Inc.
Dissecting PinsFine ScienceTools 26002-20
NaClSigma71376
KClSigma60128
KH2PO4Sigma60353
HEPESSigma54457
גלוקוזסיגמאG0350500
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC1016
טאוריןSigmaT0625
BSASigmaA2153
K-גלוטמטSigmaG1501
K-aspartateSigmaA6558
MgSO< sub>4SigmaM7506
קריאטיןסיגמאC0780
EGTAסיגמאE3889
Mg-ATPסיגמאA9187
אמפוטריצין-Bפישר סיינטיפיק1397-89-3
איזופרוטרנולקלביוכימיה420355
Media199סיגמאM4530
2,3-בוטנדיון מונוקסימה (BDM)סיגמאB0753
סרום בקר עוברי (FBS)סיגמאSH30071
סרום בקר אלבומין (BSA)סיגמאA5611
אינסולין   סיגמאI3146
טרנספריןסיגמאI3146
סלניוםסיגמאI3146
פניציליןGE HealthcareSV30010
סטרפטומיציןהיקלוןSV30010
ביוכימי מיקרו מספריים פישר סיינטיפיק 501264

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
  2. DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
  3. Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
  4. Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
  5. Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
  6. Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
  7. Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
  8. St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
  9. St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
  10. Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
  11. Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
  12. Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
  13. Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
  14. Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
  15. Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652(2012).
  16. Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633(2013).
  17. Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
  18. Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
  19. Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
  20. Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Patch Clamp

מאמרים קשורים