שיטות הם הפגינו לבידוד של מיוציטים צומת sinoatrial (Sams) מעכברים בוגרים ללימודי electrophysiology צמד תיקון או הדמיה. תאים מבודדים ניתן להשתמש ישירות או יכול להישמר בתרבות להתיר ביטוי של חלבונים של עניין, כגון עיתונאים מקודדים גנטית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטות הבידוד, תרבות האפיון פונקציונלי של myocytes צומת Sinoatrial של עכברים בוגרים
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
מיוציטים צומת Sinoatrial (Sams) לשמש כמנהל הקוצבים הטבעיים של הלב, לביצוע כל לב הכה על ידי יצירת פוטנציאל פעולה ספונטני (APS). נקודות גישה הקוצבות אלה משקפים את הפעילות המתואמת של זרמי קרום רבים ורכיבה על אופני סידן תוך תאים. עם זאת המנגנון המדויק אשר מוביל פעילות קוצב ספונטנית סאמס להישאר חמקמק. סאמס מבודדים בחריפות מהווים הכנה הכרחית ניסויים כדי לנתח את הבסיס המולקולרי של pacemaking הלב. עם זאת, לא בוררת את האנטומיה, microdissection המורכב, ותנאי עיכול אנזימטי בררנים מנעו שימוש נרחב של סאמס בחריפות המבודדת. בנוסף, שיטות לא היו זמינות עד לאחרונה להתיר תרבות לטווח הארוך של סאמס ללימודי ביטוי חלבון. כאן אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול ווידאו הפגנה למען בידודה של סאמס מעכברים בוגרים. שיטה מודגמת גם לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה עבור expressiעל חלבונים אקסוגניים באמצעות זיהום adenoviral. בחריפות מבודדים סאמס תרבותי מוכן באמצעות שיטות אלה מתאימים מגוון רחב של מחקרים אלקטרו הדמיה.
מבוא
מיוציטים קוצבים צומת sinoatrial של הלב (myocytes sinoatrial, "סאמס") ליצור פוטנציאל פעולה ספונטני, אומנותי (APS) כי להפיץ דרך שריר הלב ליזום כל לב. ניסויים באמצעות סאמס מבודד בחריפויות ממינים רבים היו חיוניים לגיבוש מבהיר המנגנונים לתרום לדור של פעילות קוצבת. סאמס הוא מאוד cardiomyocytes מיוחד שונה באופן מהותי מן עמיתיהם שריר לב הפרוזדורים חדרית מבחינת מורפולוגיה, פונקציה, ביטוי חלבון. המאפיין העיקרי של נקודות גישה ספונטנית סאמס היא שלילת קוטביות ספונטנית במהלך דיאסטולה שמניע את פוטנציאל הממברנה אל סף כדי לעורר את הבא AP 1,2. זה "פוטנציאל קוצב לב" תלוי בפעילות המתואמת של זרמי קרום שונים כולל "הנוכחי המצחיק" (אני
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הנהלים כל חיה בוצעו בהתאם הפרוטוקולים שאושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קמפוס רפואי קולורדו אנשוץ. הפרוטוקול הסטנדרטי להלן עבר אופטימיזציה באמצעות זכר C57BL / 6J של 2-3 חודשים של גיל.
1. הכין מניות ואספקת פתרון מראש של ניסויים
הערה: עיין ב חומרי שולחן ציוד ואספקת צורך.
- הכן 1 ליטר כל אחד מהפתרונות הבאים כמצוין בטבלה 1: של Tyrode השלם, נמוך Ca ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הפרוטוקולים המתוארים כאן הועסקו בעבר לבודד ספונטני פעיל סאמס מעכברי בוגרים מתאימים מגוון רחב של מחקרי מהדק תיקון שונה 5-8. בנוסף, הפרוטוקולים מאפשרים סאמס מבודדים שאפשר לקיים בתרבות עד שבוע אחד. החדרת גנים לתוך תאים בתרבית יכול להתבצע באמצעות זיהום adenoviral 9. התוצאות המוצגות בסעיף זה נובעים מהעבודות הקודמות שלנו מוצגות כאן כדוגמות המאפיינים של בחריפות סאמס מבודד תרבותי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מאמר זה מציג פרוטוקולים מפורטים עבור הבידוד וההתרבות של מיוציטים צומת sinoatrial בדיל באופן מלא מעכברים בוגרים. פרוטוקול הבידוד באופן מהימן מייצר סאמס עכבר פעיל באופן ספונטני מתאים לניתוח אלקטרו מיידי או תרבות שלאחר מכן. פרוטוקולים דומים דווחו על ידי קבוצות רבות אחרות (למשל, לראות את הפניות 11,12,10,13-17). עם זאת, הפרוטוקול שלנו לשמירה על סאמס עכבר בוגר במבחנה משמר את המורפולוגיה האופיינית, פעילות ספונטנית, ואת תכונות אלקטרו של התא ומאפשר למסירת adenoviral של .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תודות
אנו מודים לד"ר כריסטיאן ריקרט על הקריאה הביקורתית של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הלאומי ללב, ריאות ודם (R01-HL088427) ל-CP. EJS נתמך על ידי 5T32-AG000279 מהמכון הלאומי להזדקנות. התוכן הוא באחריות המחברים בלבד ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ערכת סילגרוארד/אלסטומר | דאו קורנינג | 184 SIL ELAST KIT 0.5 ק"ג | |
| בורוסיליקט 9 אינץ' פיפטות פסטור | פישר סיינטיפיק | 13-678-20C | |
| צינורות תרבית קטנים ועגולים עם תחתית | פישר סיינטיפיק | 352059 | |
| צינורות תרבית גדולים ועגולים עם תחתית | קורנינג | 14-959-11B | |
| אלסטאז | וורת'ינגטון LS002279 | ||
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | תמיסת דיסוציאציה של רקמות |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| עכבר למינין | קורנינג | CB-354232 | |
| כיסויי זכוכית עגולים 12 מ"מ | פישר | 12-545-80 | |
| צלחת תרבית 24 בארות | פישר | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | וקטור Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | וקטור Biolabs | 1060 | |
| פלסטיק, פיפטת העברה חד פעמית | פישר סיינטיפיק | ||
| 17-467-496 | |||
| דומונט #4 מלקחיים | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| רקמות מלקחיים | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| ניתוח איריס מספריים | WPI, Inc. | ||
| Dissecting Pins | Fine Science | Tools 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| גלוקוז | סיגמא | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| טאורין | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-גלוטמט | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO< sub>4 | Sigma | M7506 | |
| קריאטין | סיגמא | C0780 | |
| EGTA | סיגמא | E3889 | |
| Mg-ATP | סיגמא | A9187 | |
| אמפוטריצין-B | פישר סיינטיפיק | 1397-89-3 | |
| איזופרוטרנול | קלביוכימיה | 420355 | |
| Media199 | סיגמא | M4530 | |
| 2,3-בוטנדיון מונוקסימה (BDM) | סיגמא | B0753 | |
| סרום בקר עוברי (FBS) | סיגמא | SH30071 | |
| סרום בקר אלבומין (BSA) | סיגמא | A5611 | |
| אינסולין | סיגמא | I3146 | |
| טרנספרין | סיגמא | I3146 | |
| סלניום | סיגמא | I3146 | |
| פניצילין | GE Healthcare | SV30010 | |
| סטרפטומיצין | היקלון | SV30010 |
מקורות
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D. Pacemaker mechanisms in cardiac tissue. Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).
- Mangoni, M., Nargeot, J.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
