הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1

7.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54568

⸱

5 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Inserm U1016, Institut Cochin, CNRS UMR 8104, Université Paris Descartes, Sorbonne Paris Cité

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה למדידת מהירות הפגוזומים הנעים לעבר מרכז התא בתאים חיים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) מסוג 1 או בלעדיו, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי של דיסק מסתובב לזיהוי תאים נגועים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופ שדה בהיר לזיהוי פגוזומים.

תקציר

מקרופאגים הם תאים פגוציטים הממלאים תפקיד מרכזי בצומת הדרכים בין חסינות מולדת לחסינות ספציפית. הם יכולים להידבק בנגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1 ובגלל עמידותם להשפעותיו הציטופתיות הם יכולים להיחשב כמאגרים נגיפיים מתמידים. בנוסף, מקרופאגים נגועים ב- HIV מציגים תפקודים פגומים התורמים להתפתחות מחלות אופורטוניסטיות.

המנגנון המדויק שבאמצעותו HIV-1 פוגע בתגובה הפגוציטית של מקרופאגים לא היה ידוע. הראינו בעבר כי ספיגת חלקיקים שונים על ידי מקרופאגים עוכבה כאשר הם נדבקו ב-HIV-1. עיכוב זה היה חלקי בלבד ופאגוזומים אכן נוצרו בתוך מקרופאגים נגועים ב-HIV. לכן, התמקדנו בניתוח גורלם של הפאגוזומים האלה. התבגרות הפגוזומים מלווה בנדידה של תאים אלה לכיוון מרכז התא, שם הם מתמזגים עם ליזוזומים, ויוצרים פגוליזוזומים, האחראים על השפלה של החומר הנבלע. השתמשנו בתאי דם אדומים של כבשים שעברו IgG כמטרה לפגוציטוזה. כדי למדוד את מהירות התנועה הצנטריפטלית של פגוזומים במקרופאגים בודדים הנגועים ב-HIV, השתמשנו בשילוב של שדה בהיר ומיקרוסקופיה קונפוקלית פלואורסצנטית. יצרנו שיטה לחישוב המרחק של פגוזומים לעבר הגרעין, ולאחר מכן לחישוב מהירות הפאגוזומים. תאים נגועים ב-HIV זוהו הודות לנגיף המבטא GFP, אך השיטה ישימה לתאים לא נגועים או לכל סוג של זיהום או טיפול.

מבוא

מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי במערכת החיסון המולדת ובהומאוסטזיס. הם פגוציטים מקצועיים המפנימים ומחסלים פתוגנים ופסולת בתהליך הנקרא פגוציטוזיס 1,2. הפאגוזום, התא הסגור שנוצר לאחר בליעת חומר חלקיקי, עובר סדרה של אירועי היתוך וביקוע עם תאים אנדוציטיים, מה שמוביל לתא מתפרק הנקרא פגוליזוזום. לתא זה יש pH חומצי, עקב רכישת v-ATPases השואבים פרוטונים, מכיל אנזימים הידרוליטיים ומועשר בחלבוני ממברנה הקשורים לליזוזומלית (LAMPs). התבגרותם של פגוזומים מלווה בנדידתם על מיקרו-צינורות 3,4 לכיוון מרכז התא כדי להגיע למיקום פרי-גרעיני בו מצטברים ליזוזומים.

פתוגנים רבים דווחו כחוטפים את התבגרות הפגוזום, כולל חיידקים בעלי אורח חיים תוך-תאי המשנים את סביבת הוואקאולר שבה הם שוכנים 5. נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1 מכוון למקרופאגים בנוסף לתאי T. מכיוון שמקרופאגים עמידים להשפעות הציטופתיות של הנגיף, בניגוד לתאי T, הם יכולים להיחשב כמאגר לנגיף. בנוסף, מקרופאגים הנגועים ב-HIV-1 מראים תפקודים פגוציטים פגומים ותורמים להופעתן של מחלות אופורטוניסטיות. בפרט, מחלת סלמונלה פולשנית חמורה שאינה טיפואידית הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום ST313 נפוצה בשלושת העשורים האחרונים בקרב ילדים או מבוגרים מאפריקה שמדרום לסהרה שנדבקו ב-HIV 6. ההערכה היא שהסיכון לפתח שחפת גדול פי 20 בקרב אנשים החיים עם HIV מאשר בקרב אלה ללא זיהום ב-HIV.

מכל הסיבות הללו, חשוב להגדיר טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפגמים הפגוציטים במקרופאגים נגועים ב-HIV. הראינו כי ספיגת חומר חלקיקי, חלקיקים אופסוניים, חיידקים או פטריות, עוכבה במקרופאגים נגועים ב-HIV 7. בהתחשב בכך שעיכוב זה הוא חלקי, יצאנו לנתח את גורלם של הפאגוזומים המופנמים במקרופאגים אנושיים נגועים ב- HIV 8. מכיוון שהבשלת הפגוזומים קשורה קשר הדוק להגירה למרכז התא והיתוך עם ליזוזומים, פגם בהתבגרות הפגוזומלית יכול לנבוע משינויים באופני הסחר בתא הנגוע. השיטה המתוארת כאן משתמשת בתאי דם אדומים של כבשים (IgG-SRBCs) כמודל להתמקדות בפגוציטוזיס בתיווך קולטנים ובפרט קולטנים לחלק ה-Fc של אימונוגלובולינים (FcR). חלקיקים אלה קלים יותר לצילום בשדה בהיר (BF) מאשר חרוזי לטקס מכיוון ש-SRBCs חוץ-תאיים ותוך-תאיים מראים תכונות שבירה שונות 9. כדי למדוד את מהירות הפגוזומים שנעים לעבר הגרעין במקרופאגים נגועים ב-HIV, השתמשנו בווירוס פלואורסצנטי 10 והגדרנו שיטת מעקב ידנית פשוטה המתוארת כאן. השיטה אינה דורשת תכנות מתקדם ופשוט משתמשת ב-ImageJ. הוא ניתן לתאים דבקים ולכל סוג של חלקיק או פתוגן שניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או עם הדמיה פלואורסצנטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הפרוטוקול צריכה להתבצע בהתאם קפדן עם חקיקה לאומית ובינלאומית ולתקנות מקומיות. דם מתורמים בריאים כי נתנו את הסכמתם לתרום דם למטרות המחקר כבר המתקבל מרכזי עירוי דם שבה מוסדות חתמו הסכם. הגנות מיוחדות יש לנקוט בעת מדמם של בני האדם. ניסויים עם HIV-1 חייבים להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית 3 או 2 (BSL-3 או 2) מעבדה על פי תקנות מקומיות.

1. הכנת האדם מונוציטים הנגזרות המקרופאגים (hMDMs) לפי צפיפות Gradient צנטריפוגה בחירה על ידי הדבקה

  1. התחל עם דם טרי מתורמים בריאים (9 מ"ל). לדלל את כל נפח של דם טרי עם בופר פוספט 1x סטרילי (PBS) ללא Ca 2 + ו Mg 2+ להשיג נפח סופי של 70 מ"ל בעדינות להוסיף את דם מדולל לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל (35 מ"ל לכל צינור) , על גבי 15 מ"ל שלeutral, מסועף מאוד, גבוה המוני, פוליסכריד הידרופילי בתמיסה כבר בצינור אחד.
  2. צנטריפוגה שני צינורות דם ב 537 XG במשך 20 דקות ב 20 ° C ללא בלם. ואז לאסוף את התאים דם היקפיים mononuclear (PBMCs) הכלול טבעת תא מעונן בממשק ולהעביר אותם לתוך צינור חדש 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של 1x PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+.
  3. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו resuspend גלולה ב 45 מ"ל של PBS 1x ללא Ca 2 + ו Mg 2+.
  4. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, resuspend גלולה ב 10 מ"ל של 1x PBS ללא Ca 2 + ו Mg 2+, ולספור את התאים על ידי דילול לדילול הסופי של 1/200 ב Trypan כחול.
  5. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו resuspend גלולה ב RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני 1640 בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​penicillin סטרפטומיצין יש 7 x 10 6 PBMCs לכל היטב 2 מ"ל של מדיום בכל טוב של צלחת גם 6.
  6. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 על 2 hr. אחרי שעה 2 מונוציטים יהיה דבקו פלסטיק.
  7. כדי לאפשר מונוציטים טרי-מבודד להתמיין hMDMs, לשאוב את המדיום ולהחליף אותו עם 2 מ"ל hMDM בינוני (RPMI 1640, 10% decomplemented עוברית עגל בסרום (FCS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) בתוספת המושבה Macrophage אנושי רקומביננטי פקטור מגרה (RHM-CSF) בריכוז סופי של 10 ng / ml.
  8. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 11 ימים (איור 1).
  9. באותו יום 11 להסיר את בינוני לשטוף 2 פעמים עם 2 מ"ל של מדיום hMDM קר לכל טוב. הבא לשטוף היטב כל 2 פעמים עם 1 מ"ל של PBS 1x קר.
  10. כדי לנתק hMDMs הבדיל באופן מלא, לשטוף היטב בכל פעם 1 עם 1 מ"ל של PBS 1x קר עם 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) דגירה התאים 2 מ"ל של PBS 1x קר עם 2 מ"מ EDTA לכל טוב עבור 15-60 דקות ב 4 °.
    הערה: שיטות חלופיות כדי לנתק את התאים קיימים (למשל, טריפסין או פעילויות כמו טריפסין) שעשוי לתת תוצאות טובות 11.
  11. לאחר ניתוק (הושלמה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה הבאר), לאסוף את התאים ולשים אותם בתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח המכיל 10 מ"ל של מדיום hMDM קר.
  12. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, resuspend גלולה ב 10 מ"ל של מדיום hMDM קר, ולספור את התאים על ידי דילול 1/20 ב Trypan כחול.
  13. זרעי התאים ב 1 x 10 6 hMDMs לכל צלחת תחתית זכוכית כיתת מיקרוסקופיה 35 מ"מ ו דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 1 יום.

2. הפקה וכימות של HIV-1 מניות ויראלי

הערה: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) נושא מעטפה R5-טרופי, מתנה מ Schindlאה 10 משמש להדביק מאקרופאגים לראות תאים נגועים בזמן אמת.

  1. תוצרת מניות ויראלי על ידי transfection של תאים 293T כליה עובריים אנושיים (2 x 10 6 בצלחת מ"מ 100) עם 6 מיקרוגרם של ה- DNA proviral המתאים באמצעות מגיב transfection מסחרי.
  2. לכמת את ההדבקה של המניות וירוס באמצעות תאים אינדיקטור הלה TZM-bl (הנושאת את הגן SS-galactosidase בשליטת HIV-1 LTR) באמצעות דילולים סדרתי של מניות ויראלי ואחריו צבע SS-galactosidase של תאים ועוד היד נטויה של כחול תאי 12.

זיהום 3. hMDMs עם HIV-1

  1. מוסיפים את הנגיף על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 0.02-0.03 ב 1 מ"ל של מדיום hMDM כדי hMDMs (תאים מצופה ב 1.13). כדי לשלוט בארות להוסיף רק 1 מ"ל של מדיום hMDM דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 על 2 ימים (איור 1).
  2. באותו יום 2 לשטוף את התאים עם hMDM medium 3 פעמים ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום hMDM טריים לכל צלחת. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 עבור 6 ימים (איור 1).

4. Opsonization של כדוריות דם אדומות כבשים

  1. להכנת 7 x 10 6 SRBCs לכל צלחת, לשטוף את SRBCs שתי פעמים 100 μl של תמיסה המכילה 0.1% שור סרום אלבומין (BSA) ב 1x PBS עם צנטריפוגה ב 600 XG למשך 4 דקות.
  2. Resuspend את SRBCs לרחוץ 500 μl 1x PBS / BSA 0.1% עם ארנב IgG אנטי SRBCs בריכוז תת-agglutinating לכל 5 μl של SRBCs דגירה עם סיבוב ב RT במשך 30 דקות.
    הערה: כדי לקבוע את הריכוז תת-agglutinating של IgG אנטי SRBCs, להכין דילולים הסידורי של IgG (ריכוז המניה ב 13.1 מ"ג / מ"ל) מ 1/50 ל -1 / 25,600 ב 20 μl בצלחת 96-היטב. להוסיף 2 x 10 6 SRBCs ב 20 μl בכל טוב ולשים את הצלחת בחדר חשוך במשך כמה שעות. הריכוז תת-agglutinating הואדילול של הבאר רק לפני הבאר עם ההתלכדות (IgG + SRBCs ויצרה רשת).
  3. לאחר הסיבוב, בצנטריפוגה IgG-opsonized-SRBCs ב 600 XG למשך 4 דקות ולשטוף עם 100 μl של PBS 1x / BSA 0.1% עם צנטריפוגה ב 600 XG למשך 4 דקות.
  4. Resuspend את IgG-opsonized-SRBCs במדיום מראש חימם פנול אדום ללא RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1%, סטרפטומיצין פניצילין (1 מ"ל / צלחת).

5. תא חי Assay המיקרוסקופית וידאו Phagocytosis

  1. השתמש במערכת הדמיה confocal כגון מערכת דיסק מסתובב מצויד בתא חימום על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 עובר דרך בקבוק עם מים עבור humidification.
  2. הפעילו את תא חימום לפני הניסוי לקבל את הבמה מיקרוסקופ על 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת assay phagocytosis. הפעל מיקרוסקופ ומחשב, ולטעון את תוכנת ההדמיה.
  3. מטב את הגדרות הדמיה כגון מהירות סריקה, מגניפיקטיון, רזולוציה, וכו 'יש תא אחד לפחות לכל שדה וכדי מסגרת תמונה אחת בכל דקה בין 60 עד 120 דקות.
    הערה: כאן, המדגם הוא צלם מסגרת אחת בכל דקה במהלך 60 דקות עם 63X עדשה.
  4. מניחים את צלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ. התאם את המיקוד ואת המיקום למצוא רק אחת שלם מקרופאג נגוע ב- HIV-1 בתחום. השתמש בהגדרות עירור מתאימות / פליטה המבוססות על מערכת ההדמיה המשומשת חללית. כלול ערוץ שדה (BF) בהיר להתבונן phagosomes (איור 1ii). מטב את המראה של תמונות בערוץ השונות על ידי התאמת אחוז זמן אור וחשיפה המשודרת.
    הערה: כאן, NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP היה נרגש באמצעות לייזר 491 ננומטר עם 50 msec החשיפה זמן עם 20% של לייזר (איור 1i).
  5. מוציאים את המאפה הדמיה ולהוסיף 1 מ"ל של השעיה SRBC ב -7 x 10 6 SRBCs / ml כדי בצלחת (איור 1).
  6. צנטריפוגה XG ב 500 עבור2 דק 'ב RT לסנכרן phagocytosis, ולהקליט את הזמן בסוף צנטריפוגה זה ולהחזיר את הצלחת על הבמה.
  7. מטב את GFP המיקוד ללכוד תמונות BF בערימות-Z (לכל העובי של התא, תוך שמירת מרחק-צעד של 0.3 מיקרומטר - בדרך כלל 20 מטוסים) כל דקה במשך שעה 1 לפחות. שמור את זמן לשגות וידאו בקובץ בפורמט יליד מערכת הדמיה בשימוש.
    הערה: כאן, סרטים זמן לשגות שנשמרו בתבנית המקורית, * קבצי .stk.

6. ניתוח של זמן לשגות סרטים

  1. עבור עריכת וידאו, לחץ על התפריט הנפתח 'יישומים' בכרטיסייה "נתונים רב מימדי לבדיקה" תוכנת עריכת וידאו.
    1. כדי לפתוח את הקובץ, לחץ על "קובץ מאגר בחר" ואז על "בחר Directory". ב "ערכות נתונים", סמן את הרכישה לנתח (בפורמט .nd) ולחץ על "תצוגה". הנתונים מיוצגים בטבלה עם זמן הטורד Z-תוכנית בקו.
    2. כדי לייצג את הזיהום בהיטל-Z (איור 2, לוחות שמאל), בחר 491 ננומטר אורך גל בתיבת "אורכי הגל" ולחץ על כרטיסיית "הקרנת Z" עם "כל המטוסים".
    3. כדי לנתח רצף זמן, בחר אורך גל BF בתיבת "אורכי גל" ולבחור את המטוס האופטימלי על ציר ה- Z להבחין SRBCs החיצוני (איור 2, חץ אדום), SRBCs הפנימי (איור 2, עיגול אדום) ואת הגרעין ( איור 2, כחול מעגל).
    4. כדי לשמור את מצרפי וידאו, לחץ על "בחירה [של X]" כרטיסייה ולאחר מכן על "טען תמונה (ים)". לבסוף, לשמור את התמונות הטעונות .tif בפורמט ולפתוח אותם באים על תוכנת ImageJ.
  2. השתמש תוסף "מעקב ידני" על התוכנה ImageJ כדי למדוד את המיקום של הגרעין לבין phagosomes התחלואה הנצפים בערוץ BF (איור 3).
    1. דאוnload התוסף "מעקב ידני" באתר האינטרנט ImageJ. ביום ImageJ, לפתוח את התוסף, רצף התמונה להיות מנותח (איור 3, שלב 1 ו -2).
    2. הזן את ההגדרות כגון "מרווח זמן" מייצג משך הזמן בין מסגרות סמוכות, ואת "הכיול x / y" אשר מייצג את המרחק לפיקסל (איור 3, שלב 3).
      הערה: כאן, להציל את התמונה ברצף עם מרווח זמן של 1 דק 'בין כל מסגרת ו- x / y כיול של 0.205 מיקרומטר משום זום 63X ומצלמה עם פיקסל בגודל של 6.45 x 6.45 מיקרומטר 2 משמשים.
    3. כדי להפעיל את המעקב, לחץ על "הוסף מסלול" (איור 3, שלב 4) ולחץ על מרכז SRBC במועד הראשון כאשר הוא הפנים. הפריים הבא מופיע אוטומטית.
    4. המשך ללחוץ על מרכז SRBC בכל המסגרות יש עמדות שונות במהלך הזמן (איור 3, שלב 6 ב תיבה אדומה).
      1. התחל לעקוב אחר לגרעין יש את עמדתה בכל המסגרות ידי לחיצה על במרכזו. בואו לעקוב אחר phagosomes (על ידי לחיצה על במרכזו) אחד אחרי השני בזמן (מסגרת) של ההפנמה שלהם, שונה בתפקוד של SRBCs. לנוחיותכם לראות SRBC בערוץ BF, השתמש "בהירות וחדות" החלון במהלך המעקב (איור 3, שלב 5).
    5. בין כל מעקב SRBC, לחץ על "הוסף מסלול" (איור 3, שלב 4) יש מסלול חדש. מספר מעקב ישונה בעמודה השנייה, "מסלול n °" של טבלת התוצאות (איור 3, שלב 6).
    6. שמור את הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי להמשיך לשלב הבא של הניתוח.
  3. השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המרחק של phagosomes המכיל SRBCs כלפי הגרעין לבין המהירות של phagosomes במהלך 5 דקות הראשונות לאחר הפנמת SRBCs (אלחוטיאיור 4).
    1. פתח את שולחן גיליון אלקטרוני קובץ גיליון אלקטרוני חדש. העבר לתוך קובץ חדש זה הפרמטרים הבאים בלבד, זמן, x ו- y- לתאם של הגרעין וכל SRBCs (איור 4 א).
    2. כדי לחשב את המרחק בין SRBCs ואת הגרעין עם רק את הקואורדינטות שלהן, לשקול את גרעין וכן SRBC במטוס XY לתאם (איור 4B).
      הערה: המרחק בין שתי נקודות הוא אורך הנתיב חיבורם. במטוס, המרחק בין SRBC ואת הגרעין ניתן על ידי משפט פיתגורס.
      1. אם ג (המרחק בין הגרעין לבין SRBC) מציין את אורך האלכסון ו A ו- B מציין את אורכי שתי הצלעות האחרות, לבטא משפט פיתגורס כפי משוואת פיתגורס:
        figure-protocol-1
        הערה: במקביל, על orthonormal, המרחק האופקיa הוא (גרעין x -x SRBC) ואת b המרחק האנכי הוא (גרעין y -y SRBC).
      2. לפיכך, לחשב את המרחק בין הגרעין לבין SRBC (איור 4 א, ​​מלבן סגול) על ידי:
        figure-protocol-2
        הערה: להכפיל את ערך המרחק שהושג (בפיקסלים) על ידי x / y כיול כדי לקבל את המרחק ב מיקרומטר. כאן, x / y הכיול הוא 0.205 מיקרומטר.
      3. בכל זמן, להפחית את המרחק בין הגרעין לבין SRBC למרחק הראשוני (איור 4C).
      4. מגרש את המדידה נגד הזמן עבור 5 הדקות הראשונות. למרוח (איור 5 א) ליניארי מגמה אונליין לעלילה ולקבוע את השיפוע של מגמה אונליין ליניארי המייצג את מהירות phagosome כלפי הגרעין במהלך 5 הדקות הראשונות לאחר הפנמת SRBC.
      5. איסוף הנתונים לחישוב טעות הממוצעת וסטטיסטית שלהערכים מהירות ואת העלילה אותם בצורה הולמת באמצעות התוכנה המתאימה (איור 5).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

FCR בתיווך phagocytosis על ידי HIV-1-נגוע hMDMs הלא נגועים מתואר כאן על ידי שימוש SRBCs IgG-opsonized כמטרות מודל (איור 1). השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הכנת hMDMs ואת ההדבקה ב- HIV-1. ואכן, התפוקה והאיכות של מקרופאגים בדיל משתנים בין תורמים, כמו גם את שיעור ההדבקה עם יעילות בטווח של 10-40%. בנוסף, הכנת IgG-opsonized-SRBCs חשוב גם כדי למנוע נזק אריתרוציטים, כי זה יכול לגרום הכרתם ספיגת כמו פסולת במקום על ידי phagocytosis בתיוו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

יש טכניקה זו יש כמה שלבים קריטיים. ראשית, הכנת hMDMs והזיהום שלהם על ידי HIV-1 הוא קריטי מאחר ואחוז הזיהום הוא תורם תלוי. ראוי לציין, החלטנו להשתמש מקרופאגים שאינם מקוטבים במבחנה לפני ההדבקה, כי מעמדה של מקרופאגים נתקלו באופן פוטנציאלי על ידי הנגיף in vivo לא התאפיינה טוב עד כה. בדקנו את הביטוי של סמנים משטח מספר, המציין כי מקרופאגים אינם M1 ולא M2, ואישר את הביטוי של CD4 ו CCR5. שיעורי הזיהום הנם משתנה נעים בין 10 ל -40%, ולפעמים נמוכים יותר. שיעור ההדבקה משתנה ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

אנו מודים לד"ר ג'מיל ג'וברייל על קריאת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-CNRS, Inserm, Université Paris Descartes, Agence Nationale de la Recherche (2011 BSV3 025 02), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ20130326518 כולל מלגת דוקטורט ל-GLB) וה-Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales (ANRS, כולל מלגת פוסט-דוקטורט לתקליטור) ל-FN. A. Dumas נתמך על ידי מלגות דוקטורט מאוניברסיטת פריז דקארט ו-Sidaction.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Falcon 100 מ"מ TC-Treated Cell CultureCorning353003לייצור ויראלי
כלי תחתית זכוכית 35 מ"מ לא מצופה 1.5תאגיד MatTekP35G-1.5-14-C מארזלרכישה
צלחות תרבית רקמות פלקון 6 בארותThermo Fischer ScientificCorning. Inc. 353934למקרופאגים אנושיים שמקורם במונוציטים
Ficoll-Plaque PLUSDominique Dutscher17-1440-03פוליסכריד הידרופילי ניטרלי, מסועף מאוד, בעל מסה גבוהה, בתמיסה לצנטריפוגה בצפיפות
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםThermo Fischer Scientific14190-094
RT Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x, נוזלי (גלוקוז גבוה)GIBCO, בדיקות מולקולריות31966-021נשמר ב-4 מעלות; C ; לתרבית תאי HEK
RPMI 1640 בינוני GLUTAMAX  תוסף טכנולוגיות חיים61870-010נשמר ב-4 מעלות; C; עבור תרבית hMDMs
Fœ סרום עגל טל (FCS) EurobioCVFSVF0001נשמר ב-20 מעלות; C ;
פניצילין-סטרפטומיצין ללא השלמה (10,000 יח'/מ"ל)Thermo Fischer Scientific15140-122נשמר ב-20 מעלות; C ; לתרבית hMDMs
RPMI 1640 בינוני, ללא פנול אדום (10x 500 מ"ל)Life technologies11835-105חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש; לבדיקת פגוציטוזיס
FuGENE6 מגיב טרנספקציהPromegaE2692נשמר ב -4 מעלות; C ; לייצור ויראלי
תאי דם אדומים של כבשים (SRBCs)EurobioDSGMTN00-0Qנשמר במאגר אלסבר ב-4 מעלות; C לפני השימוש
תאי דם אדומים נגד כבשים IgGMP Biomedicals55806נשמר ב-4 מעלות;
C סרום בקר אלבומין מקטע הלם חום, pH 7, ≥ 98% סיגמאA7906נשמר ב-20 מעלות; C
מיקרוסקופ הפוך DMI600Leica
דיסק מסתובב קונפוקלי  CSU-X1M1לייזר
491 ננומטר 50 mW לייזרCOBOLT CALYPSO
HCX PL APO CS ObjectifLeicaעדשת אובייקטיבי; הגדלה 100X ; צמצם מספרי 1.40 ; שמן טבילה
CoolSnap HQ2 (FireWire) מצלמהפוטומטריתגודל פיקסל 6.45 ומיקרו; M x 6.45 ומיקרו; m ; הגדרה 1,392 x 1,040 ; קידוד התמונה בתוכנת 14 Bit
Metamorph 7.7.5מולקולרייםלשליטה במיקרוסקופ
GraphPad Prismלניתוח סטטיסטי
יחידת התקנים תוכנת

מקורות

  1. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  2. Niedergang, F. Encyclopedia of Cell Biology. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).
  3. Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. A role for microtubule dynamics in phagosome movement. J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).
  4. Blocker, A., et al. Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules. J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).
  5. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  6. Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa. Lancet. 379, 2489-2499 (2012).
  7. Mazzolini, J., et al. Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments. Blood. 115, 4226-4236 (2010).
  8. Dumas, A., et al. The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking. J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).
  9. Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages. J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).
  10. Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies. J Virol. 86, 2826-2836 (2012).
  11. Gartner, S. The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies. Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).
  12. Wei, X., et al. Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy. Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).
  13. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP. Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  14. Toyohara, A., Inaba, K. Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

HIV 1GFPZ Stack
הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.