הגירה ו מהירות Phagosome נמדד המקרופאגים אדם מן המעלה הראשונה חי עם HIV-1

מקרופאגים ממלאים תפקיד מרכזי במערכת החיסון המולדת ובהומאוסטזיס. הם פגוציטים מקצועיים המפנימים ומחסלים פתוגנים ופסולת בתהליך הנקרא פגוציטוזיס ^1,2. הפאגוזום, התא הסגור שנוצר לאחר בליעת חומר חלקיקי, עובר סדרה של אירועי היתוך וביקוע עם תאים אנדוציטיים, מה שמוביל לתא מתפרק הנקרא פגוליזוזום. לתא זה יש pH חומצי, עקב רכישת v-ATPases השואבים פרוטונים, מכיל אנזימים הידרוליטיים ומועשר בחלבוני ממברנה הקשורים לליזוזומלית (LAMPs). התבגרותם של פגוזומים מלווה בנדידתם על מיקרו-צינורות ^3,4 לכיוון מרכז התא כדי להגיע למיקום פרי-גרעיני בו מצטברים ליזוזומים.

פתוגנים רבים דווחו כחוטפים את התבגרות הפגוזום, כולל חיידקים בעלי אורח חיים תוך-תאי המשנים את סביבת הוואקאולר שבה הם שוכנים ⁵. נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV)-1 מכוון למקרופאגים בנוסף לתאי T. מכיוון שמקרופאגים עמידים להשפעות הציטופתיות של הנגיף, בניגוד לתאי T, הם יכולים להיחשב כמאגר לנגיף. בנוסף, מקרופאגים הנגועים ב-HIV-1 מראים תפקודים פגוציטים פגומים ותורמים להופעתן של מחלות אופורטוניסטיות. בפרט, מחלת סלמונלה פולשנית חמורה שאינה טיפואידית הנגרמת על ידי סלמונלה טיפימוריום ST313 נפוצה בשלושת העשורים האחרונים בקרב ילדים או מבוגרים מאפריקה שמדרום לסהרה שנדבקו ב-HIV ⁶. ההערכה היא שהסיכון לפתח שחפת גדול פי 20 בקרב אנשים החיים עם HIV מאשר בקרב אלה ללא זיהום ב-HIV.

מכל הסיבות הללו, חשוב להגדיר טוב יותר את המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפגמים הפגוציטים במקרופאגים נגועים ב-HIV. הראינו כי ספיגת חומר חלקיקי, חלקיקים אופסוניים, חיידקים או פטריות, עוכבה במקרופאגים נגועים ב-HIV ⁷. בהתחשב בכך שעיכוב זה הוא חלקי, יצאנו לנתח את גורלם של הפאגוזומים המופנמים במקרופאגים אנושיים נגועים ב- HIV ⁸. מכיוון שהבשלת הפגוזומים קשורה קשר הדוק להגירה למרכז התא והיתוך עם ליזוזומים, פגם בהתבגרות הפגוזומלית יכול לנבוע משינויים באופני הסחר בתא הנגוע. השיטה המתוארת כאן משתמשת בתאי דם אדומים של כבשים (IgG-SRBCs) כמודל להתמקדות בפגוציטוזיס בתיווך קולטנים ובפרט קולטנים לחלק ה-Fc של אימונוגלובולינים (FcR). חלקיקים אלה קלים יותר לצילום בשדה בהיר (BF) מאשר חרוזי לטקס מכיוון ש-SRBCs חוץ-תאיים ותוך-תאיים מראים תכונות שבירה שונות ⁹. כדי למדוד את מהירות הפגוזומים שנעים לעבר הגרעין במקרופאגים נגועים ב-HIV, השתמשנו בווירוס פלואורסצנטי ¹⁰ והגדרנו שיטת מעקב ידנית פשוטה המתוארת כאן. השיטה אינה דורשת תכנות מתקדם ופשוט משתמשת ב-ImageJ. הוא ניתן לתאים דבקים ולכל סוג של חלקיק או פתוגן שניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר או עם הדמיה פלואורסצנטית.

הפרוטוקול צריכה להתבצע בהתאם קפדן עם חקיקה לאומית ובינלאומית ולתקנות מקומיות. דם מתורמים בריאים כי נתנו את הסכמתם לתרום דם למטרות המחקר כבר המתקבל מרכזי עירוי דם שבה מוסדות חתמו הסכם. הגנות מיוחדות יש לנקוט בעת מדמם של בני האדם. ניסויים עם HIV-1 חייבים להתבצע ברמת בטיחות ביולוגית 3 או 2 (BSL-3 או 2) מעבדה על פי תקנות מקומיות.

1. הכנת האדם מונוציטים הנגזרות המקרופאגים (hMDMs) לפי צפיפות Gradient צנטריפוגה בחירה על ידי הדבקה

1. התחל עם דם טרי מתורמים בריאים (9 מ"ל). לדלל את כל נפח של דם טרי עם בופר פוספט 1x סטרילי (PBS) ללא Ca ^{2 +} ו Mg ²⁺ להשיג נפח סופי של 70 מ"ל בעדינות להוסיף את דם מדולל לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל (35 מ"ל לכל צינור) , על גבי 15 מ"ל שלeutral, מסועף מאוד, גבוה המוני, פוליסכריד הידרופילי בתמיסה כבר בצינור אחד.
2. צנטריפוגה שני צינורות דם ב 537 XG במשך 20 דקות ב 20 ° C ללא בלם. ואז לאסוף את התאים דם היקפיים mononuclear (PBMCs) הכלול טבעת תא מעונן בממשק ולהעביר אותם לתוך צינור חדש 50 מ"ל המכיל 15 מ"ל של 1x PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+.
3. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו resuspend גלולה ב 45 מ"ל של PBS 1x ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+.
4. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, resuspend גלולה ב 10 מ"ל של 1x PBS ללא Ca ^{2 +} ו Mg ^2+, ולספור את התאים על ידי דילול לדילול הסופי של 1/200 ב Trypan כחול.
5. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 ° C ו resuspend גלולה ב RPMI (מכון ממוריאל פארק Roswell) בינוני 1640 בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין ו 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​penicillin סטרפטומיצין יש 7 x 10 ⁶ PBMCs לכל היטב 2 מ"ל של מדיום בכל טוב של צלחת גם 6.
6. דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ על 2 hr. אחרי שעה 2 מונוציטים יהיה דבקו פלסטיק.
7. כדי לאפשר מונוציטים טרי-מבודד להתמיין hMDMs, לשאוב את המדיום ולהחליף אותו עם 2 מ"ל hMDM בינוני (RPMI 1640, 10% decomplemented עוברית עגל בסרום (FCS), 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1% פניצילין, סטרפטומיצין) בתוספת המושבה Macrophage אנושי רקומביננטי פקטור מגרה (RHM-CSF) בריכוז סופי של 10 ng / ml.
8. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ עבור 11 ימים (איור 1).
9. באותו יום 11 להסיר את בינוני לשטוף 2 פעמים עם 2 מ"ל של מדיום hMDM קר לכל טוב. הבא לשטוף היטב כל 2 פעמים עם 1 מ"ל של PBS 1x קר.
10. כדי לנתק hMDMs הבדיל באופן מלא, לשטוף היטב בכל פעם 1 עם 1 מ"ל של PBS 1x קר עם 2 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetatic (EDTA) דגירה התאים 2 מ"ל של PBS 1x קר עם 2 מ"מ EDTA לכל טוב עבור 15-60 דקות ב 4 °.
    הערה: שיטות חלופיות כדי לנתק את התאים קיימים (למשל, טריפסין או פעילויות כמו טריפסין) שעשוי לתת תוצאות טובות ^11.
11. לאחר ניתוק (הושלמה על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה הבאר), לאסוף את התאים ולשים אותם בתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח המכיל 10 מ"ל של מדיום hMDM קר.
12. צנטריפוגה התאים ב 218 XG במשך 5 דקות ב 20 מעלות צלזיוס, resuspend גלולה ב 10 מ"ל של מדיום hMDM קר, ולספור את התאים על ידי דילול 1/20 ב Trypan כחול.
13. זרעי התאים ב 1 x 10 ⁶ hMDMs לכל צלחת תחתית זכוכית כיתת מיקרוסקופיה 35 מ"מ ו דגירת הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ עבור 1 יום.

2. הפקה וכימות של HIV-1 מניות ויראלי

הערה: NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) נושא מעטפה R5-טרופי, מתנה מ Schindlאה ¹⁰ משמש להדביק מאקרופאגים לראות תאים נגועים בזמן אמת.

1. תוצרת מניות ויראלי על ידי transfection של תאים 293T כליה עובריים אנושיים (2 x 10 ⁶ בצלחת מ"מ 100) עם 6 מיקרוגרם של ה- DNA proviral המתאים באמצעות מגיב transfection מסחרי.
2. לכמת את ההדבקה של המניות וירוס באמצעות תאים אינדיקטור הלה TZM-bl (הנושאת את הגן SS-galactosidase בשליטת HIV-1 LTR) באמצעות דילולים סדרתי של מניות ויראלי ואחריו צבע SS-galactosidase של תאים ועוד היד נטויה של כחול תאי ^12.

זיהום 3. hMDMs עם HIV-1

1. מוסיפים את הנגיף על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) 0.02-0.03 ב 1 מ"ל של מדיום hMDM כדי hMDMs (תאים מצופה ב 1.13). כדי לשלוט בארות להוסיף רק 1 מ"ל של מדיום hMDM דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ על 2 ימים (איור 1).
2. באותו יום 2 לשטוף את התאים עם hMDM medium 3 פעמים ולהוסיף 1 מ"ל של מדיום hMDM טריים לכל צלחת. דגירת התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ עבור 6 ימים (איור 1).

4. Opsonization של כדוריות דם אדומות כבשים

1. להכנת 7 x 10 ⁶ SRBCs לכל צלחת, לשטוף את SRBCs שתי פעמים 100 μl של תמיסה המכילה 0.1% שור סרום אלבומין (BSA) ב 1x PBS עם צנטריפוגה ב 600 XG למשך 4 דקות.
2. Resuspend את SRBCs לרחוץ 500 μl 1x PBS / BSA 0.1% עם ארנב IgG אנטי SRBCs בריכוז תת-agglutinating לכל 5 μl של SRBCs דגירה עם סיבוב ב RT במשך 30 דקות.
   הערה: כדי לקבוע את הריכוז תת-agglutinating של IgG אנטי SRBCs, להכין דילולים הסידורי של IgG (ריכוז המניה ב 13.1 מ"ג / מ"ל) מ 1/50 ל -1 / 25,600 ב 20 μl בצלחת 96-היטב. להוסיף 2 x 10 ⁶ SRBCs ב 20 μl בכל טוב ולשים את הצלחת בחדר חשוך במשך כמה שעות. הריכוז תת-agglutinating הואדילול של הבאר רק לפני הבאר עם ההתלכדות (IgG + SRBCs ויצרה רשת).
3. לאחר הסיבוב, בצנטריפוגה IgG-opsonized-SRBCs ב 600 XG למשך 4 דקות ולשטוף עם 100 μl של PBS 1x / BSA 0.1% עם צנטריפוגה ב 600 XG למשך 4 דקות.
4. Resuspend את IgG-opsonized-SRBCs במדיום מראש חימם פנול אדום ללא RPMI בתוספת 2 מ"מ L- גלוטמין ו -1%, סטרפטומיצין פניצילין (1 מ"ל / צלחת).

5. תא חי Assay המיקרוסקופית וידאו Phagocytosis

1. השתמש במערכת הדמיה confocal כגון מערכת דיסק מסתובב מצויד בתא חימום על 37 מעלות צלזיוס עם CO ₂ עובר דרך בקבוק עם מים עבור humidification.
2. הפעילו את תא חימום לפני הניסוי לקבל את הבמה מיקרוסקופ על 37 מעלות צלזיוס לפני תחילת assay phagocytosis. הפעל מיקרוסקופ ומחשב, ולטעון את תוכנת ההדמיה.
3. מטב את הגדרות הדמיה כגון מהירות סריקה, מגניפיקטיון, רזולוציה, וכו 'יש תא אחד לפחות לכל שדה וכדי מסגרת תמונה אחת בכל דקה בין 60 עד 120 דקות.
   הערה: כאן, המדגם הוא צלם מסגרת אחת בכל דקה במהלך 60 דקות עם 63X עדשה.
4. מניחים את צלחת הדמיה על הבמה מיקרוסקופ. התאם את המיקוד ואת המיקום למצוא רק אחת שלם מקרופאג נגוע ב- HIV-1 בתחום. השתמש בהגדרות עירור מתאימות / פליטה המבוססות על מערכת ההדמיה המשומשת חללית. כלול ערוץ שדה (BF) בהיר להתבונן phagosomes (איור 1ii). מטב את המראה של תמונות בערוץ השונות על ידי התאמת אחוז זמן אור וחשיפה המשודרת.
   הערה: כאן, NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP היה נרגש באמצעות לייזר 491 ננומטר עם 50 msec החשיפה זמן עם 20% של לייזר (איור 1i).
5. מוציאים את המאפה הדמיה ולהוסיף 1 מ"ל של השעיה SRBC ב -7 x 10 ⁶ SRBCs / ml כדי בצלחת (איור 1).
6. צנטריפוגה XG ב 500 עבור2 דק 'ב RT לסנכרן phagocytosis, ולהקליט את הזמן בסוף צנטריפוגה זה ולהחזיר את הצלחת על הבמה.
7. מטב את GFP המיקוד ללכוד תמונות BF בערימות-Z (לכל העובי של התא, תוך שמירת מרחק-צעד של 0.3 מיקרומטר - בדרך כלל 20 מטוסים) כל דקה במשך שעה 1 לפחות. שמור את זמן לשגות וידאו בקובץ בפורמט יליד מערכת הדמיה בשימוש.
   הערה: כאן, סרטים זמן לשגות שנשמרו בתבנית המקורית, * קבצי .stk.

6. ניתוח של זמן לשגות סרטים

1. עבור עריכת וידאו, לחץ על התפריט הנפתח 'יישומים' בכרטיסייה "נתונים רב מימדי לבדיקה" תוכנת עריכת וידאו.
   1. כדי לפתוח את הקובץ, לחץ על "קובץ מאגר בחר" ואז על "בחר Directory". ב "ערכות נתונים", סמן את הרכישה לנתח (בפורמט .nd) ולחץ על "תצוגה". הנתונים מיוצגים בטבלה עם זמן הטורד Z-תוכנית בקו.
   2. כדי לייצג את הזיהום בהיטל-Z (איור 2, לוחות שמאל), בחר 491 ננומטר אורך גל בתיבת "אורכי הגל" ולחץ על כרטיסיית "הקרנת Z" עם "כל המטוסים".
   3. כדי לנתח רצף זמן, בחר אורך גל BF בתיבת "אורכי גל" ולבחור את המטוס האופטימלי על ציר ה- Z להבחין SRBCs החיצוני (איור 2, חץ אדום), SRBCs הפנימי (איור 2, עיגול אדום) ואת הגרעין ( איור 2, כחול מעגל).
   4. כדי לשמור את מצרפי וידאו, לחץ על "בחירה [של X]" כרטיסייה ולאחר מכן על "טען תמונה (ים)". לבסוף, לשמור את התמונות הטעונות .tif בפורמט ולפתוח אותם באים על תוכנת ImageJ.
2. השתמש תוסף "מעקב ידני" על התוכנה ImageJ כדי למדוד את המיקום של הגרעין לבין phagosomes התחלואה הנצפים בערוץ BF (איור 3).
   1. דאוnload התוסף "מעקב ידני" באתר האינטרנט ImageJ. ביום ImageJ, לפתוח את התוסף, רצף התמונה להיות מנותח (איור 3, שלב 1 ו -2).
   2. הזן את ההגדרות כגון "מרווח זמן" מייצג משך הזמן בין מסגרות סמוכות, ואת "הכיול x / y" אשר מייצג את המרחק לפיקסל (איור 3, שלב 3).
      הערה: כאן, להציל את התמונה ברצף עם מרווח זמן של 1 דק 'בין כל מסגרת ו- x / y כיול של 0.205 מיקרומטר משום זום 63X ומצלמה עם פיקסל בגודל של 6.45 x 6.45 מיקרומטר ² משמשים.
   3. כדי להפעיל את המעקב, לחץ על "הוסף מסלול" (איור 3, שלב 4) ולחץ על מרכז SRBC במועד הראשון כאשר הוא הפנים. הפריים הבא מופיע אוטומטית.
   4. המשך ללחוץ על מרכז SRBC בכל המסגרות יש עמדות שונות במהלך הזמן (איור 3, שלב 6 ב תיבה אדומה).
      1. התחל לעקוב אחר לגרעין יש את עמדתה בכל המסגרות ידי לחיצה על במרכזו. בואו לעקוב אחר phagosomes (על ידי לחיצה על במרכזו) אחד אחרי השני בזמן (מסגרת) של ההפנמה שלהם, שונה בתפקוד של SRBCs. לנוחיותכם לראות SRBC בערוץ BF, השתמש "בהירות וחדות" החלון במהלך המעקב (איור 3, שלב 5).
   5. בין כל מעקב SRBC, לחץ על "הוסף מסלול" (איור 3, שלב 4) יש מסלול חדש. מספר מעקב ישונה בעמודה השנייה, "מסלול n °" של טבלת התוצאות (איור 3, שלב 6).
   6. שמור את הנתונים בגיליון אלקטרוני כדי להמשיך לשלב הבא של הניתוח.
3. השתמש בתוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המרחק של phagosomes המכיל SRBCs כלפי הגרעין לבין המהירות של phagosomes במהלך 5 דקות הראשונות לאחר הפנמת SRBCs (אלחוטיאיור 4).
   1. פתח את שולחן גיליון אלקטרוני קובץ גיליון אלקטרוני חדש. העבר לתוך קובץ חדש זה הפרמטרים הבאים בלבד, זמן, x ו- y- לתאם של הגרעין וכל SRBCs (איור 4 א).
   2. כדי לחשב את המרחק בין SRBCs ואת הגרעין עם רק את הקואורדינטות שלהן, לשקול את גרעין וכן SRBC במטוס XY לתאם (איור 4B).
      הערה: המרחק בין שתי נקודות הוא אורך הנתיב חיבורם. במטוס, המרחק בין SRBC ואת הגרעין ניתן על ידי משפט פיתגורס.
      1. אם ג (המרחק בין הגרעין לבין SRBC) מציין את אורך האלכסון ו A ו- B מציין את אורכי שתי הצלעות האחרות, לבטא משפט פיתגורס כפי משוואת פיתגורס:
         
         הערה: במקביל, על orthonormal, המרחק האופקיa הוא _(גרעין x -x _SRBC) ואת b המרחק האנכי הוא _(גרעין y -y _SRBC).
      2. לפיכך, לחשב את המרחק בין הגרעין לבין SRBC (איור 4 א, ​​מלבן סגול) על ידי:
         
         הערה: להכפיל את ערך המרחק שהושג (בפיקסלים) על ידי x / y כיול כדי לקבל את המרחק ב מיקרומטר. כאן, x / y הכיול הוא 0.205 מיקרומטר.
      3. בכל זמן, להפחית את המרחק בין הגרעין לבין SRBC למרחק הראשוני (איור 4C).
      4. מגרש את המדידה נגד הזמן עבור 5 הדקות הראשונות. למרוח (איור 5 א) ליניארי מגמה אונליין לעלילה ולקבוע את השיפוע של מגמה אונליין ליניארי המייצג את מהירות phagosome כלפי הגרעין במהלך 5 הדקות הראשונות לאחר הפנמת SRBC.
      5. איסוף הנתונים לחישוב טעות הממוצעת וסטטיסטית שלהערכים מהירות ואת העלילה אותם בצורה הולמת באמצעות התוכנה המתאימה (איור 5).

FCR בתיווך phagocytosis על ידי HIV-1-נגוע hMDMs הלא נגועים מתואר כאן על ידי שימוש SRBCs IgG-opsonized כמטרות מודל (איור 1). השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם הכנת hMDMs ואת ההדבקה ב- HIV-1. ואכן, התפוקה והאיכות של מקרופאגים בדיל משתנים בין תורמים, כמו גם את שיעור ההדבקה עם יעילות בטווח של 10-40%. בנוסף, הכנת IgG-opsonized-SRBCs חשוב גם כדי למנוע נזק אריתרוציטים, כי זה יכול לגרום הכרתם ספיגת כמו פסולת במקום על ידי phagocytosis בתיווך FCR. opsonization אופטימלית תבטיח phagocytosis יעיל.

תנועת Phagosome לחיות מקרופאגים נגועים ב- HIV מנותח בזמן אמת עם ערוץ BF על מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב במעבדת BSL-3. ההגדרות של ערוץ BF הם לא קריטייםo לראות את הגרעין (איור 2, עיגול כחול) חדות-הבחנה החיצוני (איור 2, ראשי חץ אדום) מן SRBCs הפנימו (איור 2, עיגולים אדומים). מיקרוסקופיה BF נחשבת טכניקת תאורת מיקרוסקופיה אופטית הפשוטה מספיק לראות את phagosomes, שהן פחות refringent מאשר SRBCs החיצוני.

הצעד הראשון לאחר רכישת רצפי תמונה הוא מעקב ידני על תוכנת ImageJ (איור 3). נקודה זו יכולה להיות במיוחד ארוכה ומייגעת, כי עדיף לעקוב אחר כל phagosome, אחד אחד לכל רצפי התמונה והיא נחשבת כי ניסויים צורכים לחזור עם 3 תורם לפחות לכל מצב כדי להגיע לגודל מדגם מספיק גדול עבור ניתוח סטטיסטי (לפחות 30 phagosomes עם 3 תורמים שונים).

הצעד השני הוא הניתוח ב תוכנת גיליון אלקטרוני כדי לחשב את המהירות phagosome במהלך הפנמה 5 דקות לאחר הראשון עבור כל SRBCs הפנימו (איור 4). לשם כך, אנו מתווים לכל phagosome המרחק שעובר במהלך 5 הדקות הראשונות נגד הזמן. דוגמא נציג הוצג hMDMs הלא נגוע על איור 5 א. הבא נקבל את המהירות של phagosome, המהווה את שיפוע עקום רגרסיה ליניארית. מהירות של 0.5384 מיקרומטר / min נמצאה phagosome זה.

מן ראוי לציין כי, אפשר לנתח את מהירות phagosome במהלך הדקות הראשונות לאחר הפנמה, כמתואר כאן או ב Dumas et al. 8, או מאוחר יותר על ידי ניתוח המהירות על לוחות זמנים עוד. במחקר שלנו, צפינו כי מהירות phagosome במהלך 5 הדקות הראשונות לאחר ההפנמה ב hMDMs הנגוע ב- HIV היא נמוכה לעומת hMDMs שאינם נגועים (איור 5).

ילדה = "jove_content" FO: keep-together.within-page = "1">
הכנה איור 1. שליטה hMDMs עם HIV הדמיה phagocytosis. מונוציטים הם מטוהרים על ידי הדבקה (1) הבדיל לתוך מקרופאגים במשך 11 ימים עם M-CSF (2). לאחר מכן, hMDMs נגועים NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP i) בשעה משרד הפנים בין 0.02 ו 0.03 עבור 8 ימים עם כביסה ביום 2 (3). (4) SRBCs-opsonized IgG מתווספים על hMDMs עבור phagocytosis במהלך שעה 1. Phagosomes המכיל SRBCs ניתנים לזיהוי על תמונות BF (עיגול אדום, ii). תמונות ממסד נתוני תמונות servier. בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. רכישת בזמן אמת במהלךphagocytosis ידי שליטה יציגים ונוגעים hMDMs עם HIV. hMDMs ערוכים נגוע כמתואר באיור 1. התאים הנגועים NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP מזוהים עם לייזר 491 ננומטר. Z-ערימות של תמונות confocal דיסק מסתובב נרכשות ונותחו באמצעות שתי תוכנת רכישת מיקרוסקופ ImageJ (פנלים משמאל). גלריות של תמונות BF מייצגים (לוחות עליונים מתאימים סרט 1) שאינם נגוע וכן (לוחות תחתונים מתאימים Movie 2) NLR4.3 HIV-1Gag-iGFP נגוע תא במהלך רכישת 45 דקות (46 תמונות עם זמן מצוין כפי hh : מ"מ). קרום התא (הקו שחור מנוקד), הגרעין (העיגול הכחול), את SRBCs החיצוני (חלקם הצביעו עם ראשי חץ אדומים) ואת SRBCs הפנימי (חלקם הצביעו עם עיגולים אדומים) ניתן לזיהוי על תמונות BF. בר = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

צעדים הוראה איור 3. לניתוח תמונה עם תוסף מעקב ידני על ImageJ. לאחר פתיחת תוסף "מעקב ידני" (1) וטעינה של וידאו זמן לשגות בערוץ BF (2), להזין את הפרמטרים של הרכישה (3). לחץ על "הוסף המסלול" (4) ולהתחיל מדידת מעקב על ידי לחיצה על phagosome אחד (5) להשיג חלון חדש עם עמדות X ו- Y של phagosome שנבחר (6, תיבה אדומה). מי שעוקב אחר phagosome על רצף הזמן לנוחיותכם, לשנות את הבהירות והניגודיות (5 '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דמות 4. צעדים הוראה לניתוח נתונים של מהירות הגירה phagosome ב תוכנת גיליון אלקטרוני. (א) הרכיבו את X ו- Y של הגרעין וכל phagosome (תיבה אדומה) בטבלה גיליון אלקטרוני. במאמר נוסף (מלבן סגול), לחשב את המרחק בין phagosome ואת הגרעין עם משפט פיתגורס כאשר c מייצג את האורך בין הגרעין לבין SRBC ו A ו- B אורכי שתי הצלעות האחרות של משולש ישר זווית ( B). (ג) לבסוף, לחשב את המרחק שעובר phagosomes בכל זמן (קופסא ירוקה) על ידי הפחתת המרחק בין SRBC ואת הגרעין בכל זמן נתון מהמרחק הראשוני בשלב 0. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

p_upload / 54,568 / 54568fig5.jpg "/>
איור 5. כימות של מהירות הגירה phagosome בשליטה עם HIV hMDMs. (א) עבור כל SRBC ופשוט לאחר הפנמה SRBC, המרחק כלפי הגרעין נמדדת זממו נגד הזמן. מהירותו במהלך 5 דקות הראשונות מחושבת באמצעות רגרסיה ליניארית תוכנת גיליון אלקטרוני. ניסוי נציג מוצג (להלן SRBC הפנימי של איור 3-4). (ב) כל המהירויות במהלך 5 הדקות הראשונות נמדדות עבור 66 phagosomes ב (תורם 5) שאינם נגועים ו -60 phagosomes בתאים נגועים ב- HIV (4 תורמים). הנתונים מייצגים את ממוצע ± SEM (מבחן Student t מזווג עם תיקון של וולש; **, P <0.01). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

גיל = "1">
סרט 1: תנועת Phagosome ב מקרופאג הלא נגוע נציג. . (קליק ימני להוריד) התנועה של תאי דם אדומים opsonized זוהתה ערוץ BF במהלך 45 דקות של phagocytosis עם תמונה אחת לדקה (46 תמונות עם זמן המצוין כפי hh: mm). בר = 10 מיקרומטר.

סרט 2: תנועת Phagosome ב מקרופאג החיים עם HIV נציג. (קליק ימני להוריד). HIV-1 (NLR4.3 HIV-1 Gag iGFP) -infected מקרופאגים זוהו אחרי ההארה עם לייזר 491. התנועה של תאי דם אדומים opsonized זוהתה ערוץ BF במהלך 45דקות של phagocytosis עם תמונה אחת לדקה (46 תמונות עם הזמן המצוין כפי hh: mm). בר = 10 מיקרומטר.

למחברים אין מה לחשוף.