מאמר שיטה

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט

13.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54586

⸱

17 בספטמבר 2016

 , 
1Institute for Molecular Plant Sciences, University of Edinburgh

במאמר זה

סיכום

השעון הביולוגי מווסת כשליש של transcriptome ארבידופסיס, אך אחוז הגנים המזינים בחזרה מדידת זמן נותר עלום. כאן אנו להמחיש שיטה להעריך פנוטיפים יממה במהירות בכל קו מוטציה של ארבידופסיס באמצעות הדמיה זורחת של עיתונאי יממה הביע זמני ב פרוטופלאסט.

תקציר

השעון הביולוגי של הצמח מאפשר ציפייה לשינויים יומיומיים בסביבה. ציפייה זו מסייעת לתגובות למתח ביוטי וא-ביוטי צפוי מבחינה זמנית. לעומת זאת, שיבוש בשעון הביולוגי פוגע קשות בבריאות הצמח ומפחית את תפוקת היבולים החקלאיים. לכן הכרחי שנבין את הוויסות המורכב של מקצבים צירקדיים בצמחים, כולל הגורמים המשפיעים על תנועת שעון השעתוק עצמו.

בדיקת פגמים צירקדיים בצמח המודל Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) כרוכה באופן מסורתי בחציית קווים מוטנטיים ספציפיים לקו המבטא באופן ריתמי לוציפראז גחלילית ממקדם גן שעון ביולוגי. גישה זו מייגעת, גוזלת זמן, ועלולה להיות חסרת תועלת אם למוטציה אין פנוטיפ צירקדי. המתודולוגיה המוצגת כאן מאפשרת הערכה ראשונית מהירה של פנוטיפים צירקדיים. פרוטופלסטים שמקורם בארבידופסיס מוטנטי ובר מבודדים, עוברים טרנספטציה עם מדווח זוהר המתבטא בקצב, ומצולמים בתנאי אור קבועים למשך 5 ימים. עקבות זוהרות יחשפו ישירות אם תקופת הריצה החופשית של צמחים מוטנטיים שונה מצמחים מסוג בר. היתרון של השיטה הוא שניתן לסנן ביעילות כל קו Arabidopsis, ללא צורך ביצירת קו סמן שעון זוהר טרנסגני יציב באותו רקע מוטנטי.

מבוא

רוב היצורים החיים להחזיק שעון נוכחות אנדוגני כדי לסייע במשא ומתן יעיל של שינויים יומיים לסביבה. שעון נוכחות זה, השעון הביולוגי, מסדיר היבטים רבים של חילוף החומרים והפיזיולוגיה של אורגניזם לצפות שינויים צפויים בסביבה החיצונית. בצמחים למשל, לקראת התקפות הפתוגן או אוכלי עשב צפוי ובזמן בתוקף מפחית את הרגישות הכוללת 1 - 4. מטבוליזם עמילן מוסדר בחוזקה על ידי השעון הביולוגי על מנת להבטיח כי עתודות עמילן האחרון עד עלות השחר אם גדל בתנאי יום ארוך או קצר 5. ואכן, צמחים עם שעוני יממה התאמתו שיעורי צמיחה מוגברות סביבה 24 שעות מופע, שיעורי קיבוע פחמן ושיעורי הישרדות לעומת צמחים מפעיל שעון של תקופה תואמת 6. ההשפעה הנרחבת של מקצבי יממה בכל התהליכים הללו נובעת במידה רבה מן הרגולציה הקצבית של עד שליששל transcriptome הכולל ארבידופסיס 7. מוצרי גנים קצביים אלה מעורבים במגוון רחב של תהליכים תאיים כולל מסלולים מטבוליים, איתות הורמון, ותגובות לחץ 7. נוסף על כך, תקנת יממה ישירה של תפקוד חלבון היא הוקמה על ידי רגולצית יממה של זירחון 8 ו שלאחר translational שינויים אחרים ככל הנראה (PTMs).

במרכז השעון הביולוגי שמניע תכנות מחדש תעתיק יומי זה טמון רשת של תעתיק / משוב translational לולאות (TTFLs), כולל גנים הביע הבוקר היממה שעון מיזמים 1 (CCA1) ומאוחר מוארך HYPOCOTYL (LHY) כי לדכא את הביטוי עיתוי גנים הערב של הקבינה 1 (TOC1), GIGANTEA (GI) ואת חברי מורכבים הערב (EC); LUX ARRHYTHMO (LUX), אפשרות הפריחה 3 (ELF3), ו ELF4 9 - 11. שנינות יחדh -genes וסת RESPONSE פסאודו (PRR3, 5, 7, ו -9), TOC1 מדחיק CCA1 / ביטוי LHY ואילו EC פועלת כרגולטור חיובי 12 - 14. נוספת למנגנוני משוב, שלאחר תעתיק ופוסט translational הסדרת מרכיבי רשת TTFL ממלאת תפקיד חשוב במקצב פעילות כוונון. נכון להיום, PTM הנפוץ ביותר שזוהה על חלבוני שעון ביולוגיים הוא זירחון 15. זירחון של CCA1 ידי קזאין קינאז 2 (CK2) משפיעה שלה מחייב למקד היזמים 16 והיא חשובה עבור פיצוי טמפרטורה של השעון הביולוגי 17. חלבוני PRR הם פוספורילציה דיפרנציאלי על מחזור היממה, ו זרחון של TOC1 משפיע אינטראקציה עם הרגולטור השלילי שלה, ZEITLUPE רכיב שעון בהדרגה-הערב (ZTL) 18. דוגמאות אלה ממחישות כיצד PTMs אינטראקציות חלבון-חלבון לכוון את רשת TTFL לתוך 24 שעותמתנד תעתיק. לקבלת מבוא מפורט יותר לרשת שעון התעתיק והרגולציה שלה, סקירות אחרונות מעולות זמינות (למשל התייחסות 15).

עם זאת, מה נשאר פחות ברור הוא המידה שבה תהליכים מוסדרים בקצב והיבטים אחרים של חילוף חומרים תאיים להאכיל חזרה לתוך מנגנון המדידה הזמן עצמו. הקרנה נרחבת של מוטציות ארבידופסיס למומי שעון יוכל לקבל הבנה נוספת מהם המנגנונים או מסלולי איתות יכולים להיות מעורבים ההדור של 24 מקצבי hr מרשת TTFL. לשם כך, קים סומרס שפורסמו בעבר שיטה פריצת דרך עבור ניתוח מהיר ויעיל של פונקציית השעון בכל קו ארבידופסיס 19. בהתבסס על השימוש בביטוי חולף פרוטופלאסט, מתודולוגיה זו עולה צורך הקווים מהונדסים יציבים או חוצת קווי סמן שעון זורחים. כאן, אנו לחזות isolatio פרוטופלאסט גבוהה מניבשיטת n 20 בשילוב עם פרוטוקול אופטימיזציה להקרין פגמי יממה על ידי הדמיה זורחת של סמני שעון הביעו זמני ב קורא צלחת 96-היטב.

נשווה ארבידופסיס wild-type col- 0 עד מוטנטים השעון היטב מאופיין כדי לאשר את המתודולוגיה המתוארת כאן בהצלחה מזהה מקצבי היממה שינו. פרוטופלאסט נגזר שורות אלו טרנספקציה עם לבנות כתב המבטא בלוציפראז גחלילית מן האמרגן CCA1 היממה; CCA1pro: 19 לוק. בלוציפראז מזרז את התגובה הרבה השלבים שבו luciferin מומר נרגשות אלקטרוני oxyluciferin פולט 21 אור, אשר צלם לאורך זמן כדי להעריך את התקופה, המשרעת והפאזה של מקצבי תעתיק פרוטופלאסט אלה.

הפרוטוקול מורכב משלושה חלקים עיקריים; לבודד את פרוטופלאסט, transfecting פרוטופלאסט עם הפלסמיד הכתב, ו- IM זורחהְזדַקְנוּת. אלה שלושה חלקים תמיד צריכות להתבצע ביום אחד, באמצעות מאגרים ריאגנטים וטריים. גידול צמחים וטיהור כמות מספקת של פלסמיד הכתב צריך להתבצע מראש ואינם דמיינו בפרוטוקול זה.

פרוטוקול

הערה: בפרוטוקול זה, ריאגנטים כרכים תארו באים לידי ביטוי בכל שורת ארבידופסיס כי הוא נבדק, יגרמו שש בארות לשכפל עבור גנוטיפ זה. הכפל את החומרים עם מספר השורות להיות מנותח בניתוח יותר משורה אחת. בסרטון, ארבידופסיס wild-type יושוו אל ztl קו מוטציה השעון הביולוגי (למרות תוצאות נציג קווים נוספים יינתנו בהמשך).

פתרון אנזים
cellulase 0.5% (w / v)
Pectinase R10 0.25% (w / v)
D-מניטול 400 מ"מ
CaCl 2 10 מ"מ
KCl 20 מ"מ
שור סרום אלבומין 0.1% (w / v)
MES, pH 5.7 20 מ"מ
פתרון W5
NaCl 150 מ"מ
CaCl 2 125 מ"מ
KCl 5 מ"מ
MES, pH 5.7 2 מ"מ
גלוקוז 5 מ"מ
פתרון MMG
MES, pH 5.7 4 מ"מ
D-מניטול 400 מ"מ
MgCl 2 15 מ"מ
פתרון PEG
PEG4000 40% (w / v)
D-מניטול 200 מ"מ
CaCl 2 100 מ"מ
פתרון הדמיה
פתרון W5 כדי לנפח סופי
בסרום שור עובר 5% (v / v)
luciferin 1.2 מ"מ
אמפיצילין 50 מ"ג / מ"ל

טבלה 1: רשימת פתרונות.

1. הכנת חומרים חוצצים

  1. חומרים צמחיים
    1. שמור ארבידופסיס Col -0 הזרעים במים צינור 1.5 מ"ל ב 4 ° C בחושך במשך ארבעה ימים. פיפטה את הזרעים על אדמת בסיר ולהעביר לתנאי יום ארוך (כהה 16 שעות אור 8 שעות) בשעה 21 מעלות צלזיוס למשך 7 ימים. השאר מכסה על הסיר במשך השלושה הימים הראשונים כדי להבטיח לחות גבוהה. השתלת שישה שתילים לסיר 8 ס"מ x 13 ס"מ x 5 ס"מ חדש ולהמשיך את מגמת הצמיחה הצמחים באותם תנאים עבור anothאה 21 ימים. ודא הקרקע לחה לאורך.
  2. פלסמיד Reporter
    1. לטהר את CCA1pro: פלסמיד כתב לוק 19 מהתרבות חיידקים מראש, באמצעות ערכת בידוד ה- DNA על פי הוראות היצרן.
      הערה: 20 מיקרוגרם פלסמיד הכתב נדרש (10 μl ב -2 מיקרוגרם / μl ב DH 2 O) עבור transfection.
  3. פתרונות
    הערה: עבור פרוטוקול זה חמישה פתרונות נדרשים: פתרון אנזימים, לשטוף 5 (W5) פתרון, מניטול-מגנזיום (MMG) פתרון, פוליאתילן גליקול (PEG) פתרון, ופתרון הדמיה (טבלה 1). כן אלה לפני שנמשיך לשלב בידוד פרוטופלאסט.
    1. הכן 10 מ"ל של תמיסת אנזים לפי טבלה 1, הוספת אנזימים האחרון, ולסנן לעקר את הפתרון דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.
    2. הכן את הפתרונות שנותרו הכרכים הבאים: 15 מ"ל W5 פתרון, 10 מ"ל MMG solution, 1 מ"ל פתרון PEG פתרון הדמיה 1.5 מ"ל לפי טבלה 1.
      הערה: חשוב כי הפתרון PEG מוכן לא פחות שעות לפני transfection על מנת להבטיח כי PEG נמס לחלוטין. סנן לעקר את פתרון ההדמיה דרך פילטר מזרק 0.22 מיקרומטר.

figure-protocol-1

איור 1:. בידוד פרוטופלאסט העלים של צמחים ארבידופסיס מבוגרים (א) הם קבועים בקלטת חיטוי עם שכבת אפידרמיס התחתונה פונה כלפי מעלה (B). (C) קלטת הקסם נלחץ בעדינות על שכבת האפידרמיס התחתונה עם קצה צינור חרוטי 15 מ"ל. (ד) קלטת קסם מוסר לחשוף את התאים mesophyll (E). (F) רצועות של נייר דבק חיטוי עם חופשהs המחוברים צף על cellulase המכיל פתרון האנזים pectinase, שחרור פרוטופלאסט לתוך התמיסה. (G) העלה שלדים להישאר בקלטת חיטוי לאחר עיכול אנזים והם נמחקים, עוזבים את פרוטופלאסט בתמיסת אנזים (H). (I) סופי וכתוצאה פרוטופלאסט mesophyll (סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. בידוד פרוטופלאסט

  1. לייבל בצלחת פטרי ולהוסיף 10 מ"ל פתרון Enzyme-מעוקרים הסינון.
  2. תקן ארבע רצועות של סרט חיטוי עם הצד הדביק למעלה על משטח מעבדה נקי, ולסמן את גודל צלחת פטרי על הרצועות.
  3. חותכים עלים של צמחים בן 4 שבועות (איור 1 א), ולחץ על האפידרמיס העליון על הקלטת החיטוי (כלומר פני השטח אפידרמיס התחתון פונה כלפי מעלה ( באיור 1b)).
  4. לחץ בעדינות רצועות של סרט קסם על פני שטח אפידרמיס הנמוכים באמצעות צינור חרוטי 15 מיליליטר. תשמור על עצמך לא לרסק את רקמת העלה (איור 1 ג '). משוך בזהירות את הקלטת קסם את להפשיט את האפידרמיס התחתון (איור 1D) ולחשוף את התאים mesophyll (1e איור).
  5. חותכים את הקלטת החיטוי כדי להתאים את צלחת פטרי, פינצטה שימוש כדי להעביר את הקלטת לתוך צלחת פטרי ולצוף על הפתרון אנזים (איור 1F), משאיר פונה כלפי מטה. סובב ב 60 סל"ד על שייקר פלטפורמה עבור 60 דקות, שבמהלכן פרוטופלאסט ישוחררו לתוך התמיסה.
  6. להשתמש בפינצטה כדי להסיר ולסלק את רצועות של סרט החיטוי (1G איור) ו פיפטה פתרון המכיל את פרוטופלאסט (1h איור) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל. השתמש קצה פיפטה רחב נשא (כגון טיפ P5000 או טיפ P1000 עם סוף לנתק).
  7. צנטריפוגה פרוטופלאסט ב 100 xגרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant עם טפטפת. תשמור על עצמך, כמו הגלולה היא רופפת מאוד.
  8. הוסף 10 מ"ל פתרון W5 אל פרוטופלאסט ו resuspend ידי מתערבל בעדינות את הצינור.
  9. הנח את פרוטופלאסט על קרח למשך 30-60 דקות. במהלך שלב זה, להעריך תשואה על ידי ספירת פרוטופלאסט בתוך hemocytometer (איור 1i).
  10. אסוף את פרוטופלאסט על ידי צנטריפוגה ב 100 x גרם במשך 3 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant עם טפטפת. תשמור על עצמך, כמו הגלולה היא רופפת מאוד.
  11. Resuspend את פרוטופלאסט לריכוז של 5 x 10 מ"ל 5 פרוטופלאסט / בתמיסה MMG.

3. פרוטופלאסט Transfection

  1. הוסף 10 פלסמיד הכתב μl (2 מיקרוגרם / μl) כדי צינור חרוטי 15 מ"ל.
  2. להוסיף 400 פרוטופלאסט μl אל הצינור.
  3. להוסיף נפח אחד (410 μl) הפתרון PEG ומערבבים על ידי צינור היפוך בעדינות 12 פעמים כדי transfect פרוטופלאסט.
  4. לאחר 8-15 דקות incubation בטמפרטורת החדר, לדלל את התערובת פרוטופלאסט-DNA-PEG עם ארבעה כרכים (1640 μl) הפתרון W5 ומערבבים על ידי היפוך כפול שש בעדינות.
  5. אסוף את פרוטופלאסט transfected על ידי צנטריפוגה ב 100 XG במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר להסיר את supernatant עם טפטפת. שוב, לטפל, כמו הגלולה היא רופפת מאוד.
  6. Resuspend את פרוטופלאסט בתמיסת הדמית 1,250 μl.
  7. Aliquot 200 μl לשש לשכפל בארות צלחת 96-היטב, למלא כל בארות ריקות עם פתרון W5, ולאטום את הצלחת עם מכסה ברור דבק מתאים הדמיה זורחת.

4. הדמיה

  1. מעביר את הצלחת לכל התקנת הדמיה זורחת מתאימה הדמית צמח. שנה את העפעפיים הדבקים על 10-15 דקות הצלחות לאחר העברה כדי למנוע הבדלי עיבוי ולחץ בקרב הבארות, ולאחר מכן להתחיל הדמיה. קרא את הצלחת כל דקות ~ 45 (3 שניות לכל טוב) במשך חמישה ימים בטמפרטורת החדר.
    הערה:תדירות צלחת קורא הזמן לקרוא לכל טוב עשוי להשתנות בהתאם התקנת ההדמיה.

ניתוח 5. נתונים

  1. לנתח את תוצאות ההארה באמצעות כל תוכנת ניתוח (למשל, מערכת תוכנת ניתוח מקצבים ביולוגית (פליז) 22). השווה את קו מוטציה לבקרות wild-type לחשוף פגמים היממה.

תוצאות

פרוטופלאסט של wild-type ארבידופסיס הושווה מוטציות השעון הידועות cca1 / lhy (מוטצית תקופה קצרה 2), ztl (מוטצית תקופה ארוכה 23), וקו ביטוי יתר CCA1 -OX (בקצב לא סדיר 24). כולם היו transfected זמני עם CCA1pro: כתב LUC צלמו באור קבוע על קורא צלחת ב -5 ימים.

כאן אנו מראים כי מוטצית cca1 / lhy, התקופה החופשית פועל של ביטוי גני יממה שבשליטה מתקצרת (איור 2 א), עולה בקנה אחד עם התקופה שפורסמה ונותחה על ידי ביטוי מהונדס יציב של שעון זורח סמני 2,9. תקופת תנודות היממה פרוטופלאסט של מוטציה ztl ארוכה מאשר סוג בר (איור 2b), בהתאם לתוצאות שפורסמו מן השתילים, ההשעיה תא cultuמיל ו פרוטופלאסט 19,23,25.

התבטאות יתר של CCA1 נועל את השעון בבוקר פאזיים ותעתיק הגלובלי הופך 24 בקצב לא סדיר. באופן עקבי, צפינו שום תנודות CCA1pro: ביטוי לוק ב פרוטופלאסט CCA1 -OX (איור 2 ג).

figure-results-1
איור 2: פרוטופלאסט היממה מקצבים פרוטופלאסט של col- 0, cca1 / lhy, ztl, ו CCA1 -OX זמניים שהוסבו עם CCA1pro: לוק לבנות ומקצבי יממת ההארה היו צלמו במשך 5 ימים (א '- ג'). (ד) ערכות תקופת יממה מבוססות על עקבות הארת Col -0, cca1 / lhy ו ztl (A - B). לִי± SEM, n = 3-5, מבחן t p-value כמצוין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

גנוטיפ תקופה (פרוטופלאסט) תקופה (מהונדס) דווח על ידי: הפניות
col- 0 23.0 ± 0.21 24.4 ± 0.09 pCCA1: לוק ב Col -0 (2)
cca1 / lhy 20.6 ± 0.13 19.9 ± 0.11 pCCA1: לוק ב Col -0 (2)
~ 18 רנ"א רקע L אה (9)
ztl 25.1 ± 0.12 27.4 ± 0.5 CAB2: לוק ב אקוטיפ C24 (22)
CCA1 -OX בקצב לא סדיר בקצב לא סדיר pCCA1: לוק (נתוני LD בלבד) (2)
בקצב לא סדיר RNA וחלבון ברקע -0 Col (23)

טבלה 2: מקצבי יממה ב פרוטופלאסט בהשוואת טרנסגניים שתילי תקופת היממה של pCCA1:. ביטוי לוק ב פרוטופלאסט לעומת האורכים בתקופת הדוח ראשון עבור המוטציה, אם הוא זמין, עם pCCA1: ביטוי לוק ב Col -0.

דיון

כאן, אנו מציגים assay מהיר למסך פגמי תקופת יממה בקווים ארבידופסיס, כוללים בידוד פרוטופלאסט, transfection, והדמית luminecent. תקופת יממת wild-type ארבידופסיס ושעון מוטציות cca1 / lhy, ztl, ו CCA1 -OX חושב ממדידות של הארה מתוך CCA1pro: כתב לוק ומצא להיות עקבי עם נתונים שפורסמו שנוצרו מצמחים שלמים באמצעות עוד פעם רב גישות מהונדסות (טבלה 2). שימוש assay זה להקרין מוטציות ארבידופסיס ימנע את הדרישה הראשונית כדי ליצור קווי זורח מהונדסים, אשר זה זמן רב עלולים רק חושף כי מוטציה מסוימת מפגין מקצבי wild-type. יתרון ברור של פרוטוקול זה הוא, שכל קו ארבידופסיס יכול להיות מוקרן בזמן קצר עבור מקצבי תעתיק יממה שינו, אשר יסייעו בזיהוי גנים המשפיעים יותר מדידת זמן בצמחים.

= "Jove_content"> בידוד של פרוטופלאסט יכול להיות מייגע, במיוחד אם קו המוטציה מציג פנוטיפ מתגמד. דיווח בעבר שיטות להפקת פרוטופלאסט לערב חיתוך עלים או שתילים לרצועות דקות ואקום שחדר רצועות עם פתרון האנזים לאפשר אנזימים להגיע קירות התא 26,27. העיכול שלאחר מכן דורש לפחות דגירת hr 3 בחושך כדי לשחרר את פרוטופלאסט לתוך תמיסת האנזים. כאשר חדירת אבק אינה מוחלת, זמן דגירה עד 18 שעות מומלצות. בפרוטוקול המובא כאן, חדירת אבק היא מיותר כי שכבת תאי אפידרמיס בלתי חדירה האנזימים הוסרה על ידי קלטת. בעת יצירת פרוטופלאסט ידי חיתוך חומר צמחי יש צורך פרוטופלאסט נפרד מן ההריסות דופן התא לאחר עיכול; זה בדרך כלל נעשה על ידי סינון הפתרון או לטיהור אותו על 27,26 שיפוע סוכר. כאן, כל רקמה מעוכלת תישאר בקלטת החיטוי לאחרעיכול, כך טיהור שיפוע סינון וסוכר של פרוטופלאסט ניתן להשמיט. יש סיכוי כי הלחץ הנובע נהלים protoplasting ממושך משפיע על כדאיות התא ואת השעון הביולוגי. שיטת protoplasting הסרט המבוסס על 20 מדמיין כאן מניבה מספר גבוה של פרוטופלאסט; ובהינתן הכדאיות של תאים על פני סדרה עתית היממה ואת אורכי תקופת ההתאמה של פרוטופלאסט ושתילים כולו (לוח 2), המתודולוגיה המתוארת כאן עדיפה על פני שיטות חלופיות כדי ליצור פרוטופלאסט.

צעד transfection של הפרוטוקול הוא שלב קריטי שמשפיע על יכולת הקיום של פרוטופלאסט. פתרון PEG מאפשר ה- DNA כדי להיות מועבר לתא, ושניהם זמן הדגירה בפתרון זה (שלב 3.4) ואחוז PEG צריך להיקבע באופן אמפירי. הריכוז הסטנדרטי הוא 20%, עם ריכוזים נמוכים הפחתת יעילות השינוי ומעלהריכוזי הפחתת כדאיות 28. זמן דגירה קצר ככל חמש דקות יכול להניב transfection היעיל של פרוטופלאסט 27.

פרוטופלאסט ניתן הדמיה על כל פלטפורמת הדמיה זורחת. בסרטון הזה, השתמשנו קורא צלחת הארה מצויד תאורה חיצונית (אדום נוריות כחולות, 630 ו 470 ננומטר, בהתאמה, בעצימות בשילוב של ~ 20 μE), אשר מאפשר הקרנת תפוקה גבוהה ומדידות תכופות. ציוד הדמיה אחר מאתר הארה, כגון קוראי צלחת חלופיים או setups מבוססים סביב מצלמת תשלום מצמידי מכשיר (CCD), יכול להיות מיושם באופן שווה גם כל עוד תאורה זמינה עבור פוטוסינתזה. היתרון של שימוש במצלמת CCD רכוב על ארון לשליטה הוא כי אור וטמפרטורה ניתן לתכנת. החיסרון הוא זמן ללכוד יותר, מציגה תקופות ממושכות של החושך שיכולים לגרום ללחץ על פרוטופלאסט בנוסף לטרודing מדידת זמן אנדוגני. לא משנה נבחר איזו פלטפורמה ניסיונית, התאמת הגדרות עשויה להיות נחוץ לעומת הגדרות עבור שתילים או צמחים בוגרים. מניסיוננו, הגדלה הריכוזית פלסמיד הכתב במהלך transfection ו / או luciferin למאגר ההדמיה עשויה לפתור כל מקצבים לא יציבים או במהירות ריסון שעלול להתרחש ניסויים ראשוניים.

בניסויים עתידיים, המתודולוגיה המתוארת כאן ניתן להחיל ללמוד את הפנוטיפ היממה של כל קו ארבידופסיס מוטציה. עם שינויים קלים, את ההשפעה של תרופות שונות כגון על מדידת זמן יכולה להיחקר התקנה זו. יתר על כן, transfection יכול להיות שונה כדי לכלול microRNA המלאכותי גן השתקת 19, נוסף בהרחבה הצדדית של פרוטוקול זה. פרוטוקולים ליצור פרוטופלאסט אורז ומבוססים 29 ופרוטוקול ההדמיה המוצג כאן יכול להיות מיושמים באופן שווה כדי לקדם u שלנוnderstanding של השעון בצמחי יבול monocot חשיבות כלכלית.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לפרופ' דיוויד סומרס ולד"ר ג'ונגסיק קים על הפלסמיד המדווח על לוציפראז ועל פיתוח השיטה הראשונית. פרופ' קארן האלידיי סיפקה באדיבות את כל הקווים המוטנטיים הביולוגיים ששימשו במחקר זה. מחקר זה נתמך על ידי מענקי מחקר של החברה המלכותית RS120372 ו-RS140275. GvO הוא עמית מחקר באוניברסיטת החברה המלכותית (UF110173).

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלוליזין צלולאז, Trichoderma viride  Merck Millipore219466
פקטינאז R10סיגמא אולדריץ'P2401
D-מניטולסיגמא אולדריץ'M4125 
CaCl2Sigma AldrichC4901
KClSigma AldrichP3911
סרום בקר אלבומיןסיגמא אולדריץ'A4503
MESAcros Organics327765000
NaClAcros Organics327300010
גלוקוזפישר סיינטיפיקG/0500/60
MgCl2Sigma AldrichM2670
פוליאתילן גליקול (PEG) 4000Acros Organics434630010
סרום בקר עוברי Sigma AldrichF4135
D-Luciferin, Firefly BiosynthAGL-8200ממיסים אבקת לוציפרין ב-0.1 M trisphosphate buffer pH 8.0 לריכוז של 50 מ"מ
AmpicillinSigma AldrichA9618
Compliance Steam Indicator Tape3M1222
Magic Tape3M819-1460
צלחותפטרימעבדה מדעית מספקתSLS2002
מיקרופלייט, 96 בארות, תחתית שטוחה,גריינר ביו-וואןלבן 655075
TopSeal-A, מכסי דבק לצלחות 96 בארות6050195פרקין אלמר
, 10 מ"ל, ללא מחטBD פלסטיפק302188
מסנן מזרק 0.22 ומיקרו; mMerck MilliporeSLGP033RS
מערכת תוכנה לניתוח מקצבים ביולוגיים (BRASS)להורדה בחינם ב amillar.org
QIAfilter Maxiprep KitQiagen12262
תא ספירה Fuch-Rosenthal שונה, תא כפולHawksleyAC6000
מיקרוסקופ שדה בהירמיקרוסקופים אופטיקהB-150POL-B
LB942 TriStar2 קורא מולטי-מוד, עם מודול זוהרBerthold Technologies Ltd57947/57948
מזרק

מקורות

  1. Goodspeed, D., Chehab, E. W., Min-Venditti, A., Braam, J., Covington, M. F. Arabidopsis synchronizes jasmonate-mediated defense with insect circadian behavior. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (12), 4674-4677 (2012).
  2. Zhang, C., et al. Crosstalk between the circadian clock and innate immunity in Arabidopsis. PLoS Pathog. 9 (6), 1003370(2013).
  3. Hevia, M. A., Canessa, P., Müller-Esparza, H., Larrondo, L. F. A circadian oscillator in the fungus Botrytis cinerea regulates virulence when infecting Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (28), 8744-8749 (2015).
  4. Bhardwaj, V., Meier, S., Petersen, L. N., Ingle, R. A., Roden, L. C. Defence responses of Arabidopsis thaliana to infection by Pseudomonas syringae are regulated by the circadian clock. PLoS One. 6 (10), 26968(2011).
  5. Graf, A., Schlereth, A., Stitt, M., Smith, A. M. Circadian control of carbohydrate availability for growth in Arabidopsis plants at night. Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (20), 9458-9463 (2010).
  6. Dodd, A. N., et al. Plant circadian clocks increase photosynthesis, growth, survival, and competitive advantage. Science. 309 (5734), 630-633 (2005).
  7. Covington, M. F., Maloof, J. N., Straume, M., Kay, S. A., Harmer, S. L. Global transcriptome analysis reveals circadian regulation of key pathways in plant growth and development. Genome Biol. 9 (8), 130(2008).
  8. Choudhary, M. K., Nomura, Y., Wang, L., Nakagami, H., Somers, D. E. Quantitative Circadian Phosphoproteomic Analysis of Arabidopsis Reveals Extensive Clock Control of Key Components in Physiological, Metabolic, and Signaling Pathways. Mol. Cell. Proteomics. 14 (8), 2243-2260 (2015).
  9. Mizoguchi, T., et al. LHY and CCA1 Are Partially Redundant Genes Required to Maintain Circadian Rhythms in Arabidopsis. Dev. Cell. 2 (5), 629-641 (2002).
  10. Kikis, E. A., Khanna, R., Quail, P. H. ELF4 is a phytochrome-regulated component of a negative-feedback loop involving the central oscillator components CCA1 and LHY. Plant J. 44 (2), 300-313 (2005).
  11. Lu, S. X., et al. CCA1 and ELF3 Interact in the Control of Hypocotyl Length and Flowering Time in Arabidopsis. Plant Physiol. 158 (2), 1079-1088 (2012).
  12. Nakamichi, N., et al. PSEUDO-RESPONSE REGULATORS 9, 7, and 5 are transcriptional repressors in the Arabidopsis circadian clock. Plant Cell. 22 (3), 594-605 (2010).
  13. Dixon, L. E., et al. Temporal repression of core circadian genes is mediated through EARLY FLOWERING 3 in Arabidopsis. Curr. Biol. 21 (2), 120-125 (2011).
  14. Gendron, J. M., et al. Arabidopsis circadian clock protein, TOC1, is a DNA-binding transcription factor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (8), 3167-3172 (2012).
  15. Hsu, P. Y., Harmer, S. L. Wheels within wheels: the plant circadian system. Trends Plant Sci. 1, 1-10 (2013).
  16. Daniel, X., Sugano, S., Tobin, E. M. CK2 phosphorylation of CCA1 is necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (9), 3292-3297 (2004).
  17. Portolés, S., Más, P. The functional interplay between protein kinase CK2 and CCA1 transcriptional activity is essential for clock temperature compensation in Arabidopsis. PLoS Genet. 6 (11), e1001201(2010).
  18. Fujiwara, S., et al. Post-translational regulation of the Arabidopsis circadian clock through selective proteolysis and phosphorylation of pseudo-response regulator proteins. J. Biol. Chem. 283 (34), 23073-23083 (2008).
  19. Kim, J., Somers, D. E. Rapid assessment of gene function in the circadian clock using artificial microRNA in Arabidopsis mesophyll protoplasts. Plant Physiol. 154 (2), 611-621 (2010).
  20. Wu, F. -H., et al. Tape-Arabidopsis Sandwich - a simpler Arabidopsis protoplast isolation method. Plant Methods. 5, 16(2009).
  21. Baldwin, T. O. Firefly luciferase: the structure is known, but the mystery remains. Structure. 4 (3), 223-228 (1996).
  22. Edwards, K. D., et al. Quantitative analysis of regulatory flexibility under changing environmental conditions. Mol. Syst. Biol. 6 (424), 424(2010).
  23. Somers, D. E., Schultz, T. F., Milnamow, M., Kay, S. A. ZEITLUPE Encodes a Novel Clock-Associated PAS Protein from Arabidopsis. Cell. 101 (3), 319-329 (2000).
  24. Wang, Z. -Y., Tobin, E. M. Constitutive Expression of the CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1 (CCA1) Gene Disrupts Circadian Rhythms and Suppresses Its Own Expression. Cell. 93 (7), 1207-1217 (1998).
  25. Kim, W. -Y., Geng, R., Somers, D. E. Circadian phase-specific degradation of the F-box protein ZTL is mediated by the proteasome. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100 (8), 4933-4938 (2003).
  26. Zhai, Z., Jung, H. -I., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. , e15-e17 (2009).
  27. Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
  28. Damm, B., Schmidt, R., Willmitzer, L. Efficient transformation of Arabidopsis thaliana using direct gene transfer to protoplasts. Mol. Gen. Genet. 217 (1), 6-12 (1989).
  29. Zhang, Y., et al. A highly efficient rice green tissue protoplast system for transient gene expression and studying light/chloroplast-related processes. Plant Methods. 7 (1), 30(2011).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ניתוח מהיר של פנוטיפים היממה ארבידופסיס פרוטופלאסט טרנספקציה עם כתבת שעון פלורסנט
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.