מאמר שיטה

יישומים של pHluorin עבור כמותי, קינטי וניתוח תפוקה גבוהה של אנדוציטוזה שמרים הנצה

DOI:

10.3791/54587

⸱

23 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The Johns Hopkins University, 2Department of Biological Sciences, Duquesne University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כימות מדויק של אירועי סחר בשלפוחית מספק לעתים קרובות תובנות מפתח לגבי תפקידים של חלבונים ספציפיים והשפעות של מוטציות. מאמר זה מציג שיטות לשימוש ב-pHluorin סופר-אקליפטי, וריאנט GFP רגיש ל-pH, ככלי לכימות אירועים אנדוציטיים בתאים חיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותי וציטומטריית זרימה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על גירסאותיה משמשים כלים נרחב ללימוד לוקליזציה חלבון ודינמיקה של אירועים כגון שיפוץ cytoskeletal וסחר שלפוחי בתאים חיים. מתודולוגיות כמותיות באמצעות התכת GFP כימרי פותחו עבור יישומים רבים; עם זאת, GFP הוא מעט עמיד proteolysis, ובכך הקרינה שלה נמשכת ליזוזום / vacuole, אשר יכול לעכב כימות של סחר המטען במסלול endocytic. שיטה חלופית לכימות אנדוציטוזה ופוסט endocytic אירועים סחר עושה שימוש superecliptic pHluorin, וריאנט pH רגיש של GFP כי הוא הרווה בסביבה חומצית. היתוך Chimeric של pHluorin לזנב cytoplasmic של תוצאות חלבונים מטען הטרנסממברני בתוך ריסון של הקרינה על ההתאגדות של המטען לתוך הגוף multivesicular (MVBs) והסעה לבית לומן ליזוזום / vacuole. לכן, מרווה הקרינה vacuolar מקלה quantifiקטיון של אנדוציטוזה ואירועים מוקדם מסלול endocytic. מאמר זה מתאר שיטות באמצעות מטענים מתויגים pHluorin כימות של אנדוציטוזה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כמו גם מבחנים מבוססי אוכלוסייה באמצעות cytometry זרימה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סחר שלפוחי ממלא תפקיד חשוב בשמירה על הזהות אברון ותפקוד בתאים איקריוטיים, והוא מכשיר מרכזי להסדרת הרכב חלבונים בממברנה של תאים סלולריים הפרט. על הממברנה הפלזמה, שילוב של שלפוחית ​​exocytic מספק חלבונים וממברנות חדשים אל פני השטח של התא, ואילו שלפוחית ​​שנוצרה באמצעות אנדוציטוזה להסיר קרום וחלבונים מפני השטח למחזור עקב או מיקוד אל ליזוזום. לפיכך, אנדוציטוזה חשוב ספיגת חומרים מזינה ועל תגובות הסביבה התאית. Exocytosis ו אנדוציטוזה מאוזנים להסדיר שטח הממברנה, וכדי לאפשר מחזור של חלבונים פגומים.

עיונים שמרים בתאי יונקים זיהו מספר רב של חלבונים המעורבים אנדוציטוזה, כמו גם מסלולים endocytic מרובים שמקדמים הפנמה של מטענים ספציפיים או מעשה שיש בהם בתגובה במגוון enתנאים סביבתיים. מסלול-למד הכי טוב הוא אנדוציטוזה מתווכת clathrin (CME), שבו clathrin אביזר cytosolic חלבונים להרכיב למבנה מעיל לייצב את שלפוחית ​​endocytic המתהווה. הניסויים cerevisiae Saccharomyces שמרים ניצני הניבו תובנות חשובות על הדינמיקה והסדר של גיוס חלבונים endocytic רבים 1-3. יש לציין, כי מכונה CME הוא שמור ביותר בתהליך האבולוציה כזה שרוב החלבונים הקשורים CME בשמרים יש orthologs אדם; וכך, נבגי שמרים כבר כלי חשוב להבנת המנגנונים של אנדוציטוזה כי הם משומר אאוקריוטים גבוה. לדוגמא, מחקרים באמצעות שמרי ניצנים נקבעו כי היווצרות והתבגרות של מבני CME (המכונה טלאים יקטינו קליפת מוח כמו שמרים) כרוך הגיוס הרציף של חלבונים רבים, החל clathrin וחלבוני מתאם מחייב למשא ואחריו גיוס של אבזר endocytic נוסף חלבונים,הפעלת Arp2 / פילמור אקטין 3 בתיווך, וגיוס של חלבונים המעורבים 1,2 scission שלפוחית. גיוס של חלבונים מכונים CME כדי קליפת מוח טלאים יקטינו הוא תהליך הורה מאוד וסטריאוטיפי, ואת הסדר המדויק של גיוס חלבונים רבים כבר נקבע ביחס לרכיבים אחרים של מכונות CME. חשוב לציין, מחקרים שנעשו לאחרונה אישרו צו דומה של גיוס חלבונים CME בבורות מצופה clathrin בתאי יונקים 4.

בנוסף CME, סוגי תאים רבים להחזיק אחד או יותר מסלולי endocytic עצמאי-clathrin (CIE) המסתמכים על מנגנונים חלופיים לקדם היווצרות שלפוחית והפנמה מן קרום הפלזמה 5-7. בשמרים, אנו לאחרונה זיהינו מסלול CIE אשר מנצל את Rho1 GTPase הקטן גורם חליפי נוקלאוטיד גואנין ההפעלה שלה (GEF), Rom1 8,9. Rho1 מפעיל את formin Bni1 לקדם פילמור אקטין 10,11, אשר נדרש עבור סוג זה של אנדוציטוזה עצמאית-clathrin בשמרים 12. יתר על כן, המשפחה-arrestin α של חלבונים לגייס את האנזים היוביקוויטין Rsp5 לקדם ubiquitination מטען והפנמה עוקבות דרך CME 13-17, וגם לקדם הפנמה מטענים דרך מסלול CIE, ואולי באמצעות אינטראקציה ישירה עם חלבונים המעורבים CIE 18. מגוון מסלולי CIE קיים גם בתאי יונקים, כוללים מסלולי clathrin-עצמאי phagocytic המסתמכים על ortholog Rho1, RhoA 9,19. תפקידו של RhoA ב יונקים CIE הוא הבין היטב; לכן, מחקרים בשמרי ניצנים עשויים לספק תובנות מכניסטית נוספים החלימו על CIE היונק.

כימות מדויק של אירועי endocytic יכול לספק מידע חשוב על התפקידים של חלבונים ספציפיים בויסות אנדוציטוזה, והוא יכול לחשוף את ההשפעות של מוטציות על הפנמת מטען או progression דרך מסלול endocytic. לשם כך, בשיטות ביוכימיות יכולות להיות מנוצלות כדי לפקח ספיג ליגנד או כדי למדוד את שיעורים של פירוק של חלבוני מטען endocytic. בתאים חיים, שילוב של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) על גרסותיה כדי מטעני עניין מאפשר הדמיה ישירה של כלי רכב כבדים. עם זאת, מטענים מתויג GFP הם של שימוש מוגבל כימות של אנדוציטוזה כי GFP הוא עמיד בפני פירוק בתוך ליזוזום (או vacuole בשמרים). יתר על כן, GFP הקרינה היא רק רגיש באופן חלקי לשינויים ב- pH, ונשאר לזיהוי בתוך vacuole לומן 20,21. כתוצאה מכך, הקרינה של תג ה- GFP נמשכת vacuole הרבה אחרי שאר המטען כבר מושפלת, ושלמי כימותים מבוססי תאים של עוצמת מטען עשויים להיות לא מדויקים בשל קרינת GFP לטווח ארוכה של vacuole.

על מנת להתגבר על החסרונות של GFP הקרינה vacuolar, אנחנו קודם לכן עשו שימוש pH supereclipticluorin, וריאנט רגיש-pH של GFP כי מאיר במאור ב- pH נייטרלי, אבל מאבד הקרינה בסביבה חומצית כגון לומן של vacuole / ליזוזום 20,22,23. הצבת תג pHluorin על הזנב cytoplasmic של מטענים endocytic היתרי להדמיה של מטענים על קרום פלזמה על endosomes מוקדם, שבו תג pHluorin נשאר חשוף אל הציטופלסמה (איור 1 א). כפי endosomes מוקדם להתבגר, במתחם מיון endosomal הנדרש להובלה (ESCRT) מטענים משטח-מקומי חבילות מכונות לתוך שלפוחית כי ניצן לתוך לומן של אנדוזום, יצירת גופים multivesicular (MVBs) 24. עבור מטענים כי שולבו שלפוחית ​​MVB פנימית, תג pHluorin פונה כלפי לומן השלפוחית. שלפוחית ​​MVB הפנימית acidified; וכך, מטענים מתויגים pHluorin לאבד קרינה על endosomes מוקדם כשהם מתבגרים לתוך MVBs 20. ההיתוך הבא של MVB עם vacuole מספק את תוכן luminal MVBהשפלה, ותגיות pHluorin נשארים הרווה בסביבה החומצית של לומן vacuole.

מאמר זה מספק תיאורים מפורטים של מבחני endocytic כמותית באמצעות מטענים עם תגי pHluorin ציטופלסמית בשמרים. זנים להביע מטענים מתויג pHluorin יכול לשמש מבחני קינטית ו / או נקודות קצה, בהתאם להתנהגות נכסים וסחר של מטענים ספציפיים. בנוסף, כמה מטענים מתויג pHluorin ניתנים שיטות ניתוח תפוקה גבוהה, כולל זרימת cytometry. חשוב לציין כי תג pHluorin הוא כלי תכליתי עבור חוקר ענייני endocytic בתאים חיים, המאפשר כימות של אנדוציטוזה והשוואה של פונקציה endocytic ב wild-type ו זנים מוטנטים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. פתרונות ומדיה

  1. הכן את המניות, מדיה צלחות הבאות:
    1. כדי להכין 10x YNB, לפזר 67 גרם של בסיס שמרים חנקן חסר חומצות אמינו ב 1 ליטר של מים. לעקר על ידי סינון דרך פילטר nitrocellulose 0.22 מיקרומטר.
    2. כן בינוני YNB באמצעות YNB 1x (מ 10x מלאה) עם 2 דקסטרוז% (מתוך 50% סטרילי w / מניית v) תערובת חומצות אמינו 1x / מזין (מ 100x מניות, ראה שלב 1.1.4). לקבלת מבחר פלסמיד, להשמיט חומצות אמינו בודדות או חומרים מזינים לפי הצורך. לזירוז הביטוי Mup1, גם להשמיט מתיונין מתערובת חומצות אמינו / מזין.
    3. כן צלחות YNB באמצעות YNB 1x (מ 10x מלאה), 2% דקסטרוז (מתוך 50% סטרילי w / מניית v), 0.7 גר '/ ל אמינו תערובת חומצות / מזין (ראה שלב 1.1.5) ו -2.5% אגר. הכן בינוני הצלחת על ידי מעוקר 25 גרם של אגר ו -0.7 גרם של תערובת חומצות אמיניות / מזין לכל 860 מ"ל מים. אפשר לתערובת להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 100 מ"ל של 10x YNB ו -40 מ"ל oגלוקוז ו 50%. יוצקים צלחות (כ 30 מ"ל של מדיום לכל 10 צלחת ס"מ), לאפשר את המדיום כדי לחזק בטמפרטורת החדר, וצלחות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    4. כן פתרון מניות חומצה / מזין אמינו 100x (עבור במדיום נוזלי) על ידי המס את הדברים הבאים 100 מ"ל מים ללא יונים: 0.1 גרם L-מתיונין, 0.3 גרם כל אחד L-לאוצין ו- L ליזין, ו -0.2 גרם כל אחד L-היסטידין , L- טריפטופן, אדנין ו אורציל (חומצות אמינו וחומרים מזינים אחרים עשויים להיכלל כנדרש עבור זנים ספציפיים). השתמש חום עדין במידת הצורך לפזר, לעקר דרך פילטר nitrocellulose 0.45 מיקרומטר. אחסן בטמפרטורת חדר עם הגנה מפני אור. לקבלת מבחר פלסמיד, להכין פתרונות מניות חסרי רכיבים ספציפיים לפי צורך.
    5. הכן חומצה אמינו / תערובת מזין (עבור צלחות) על ידי שילוב של הבאים: 0.5 גר 'אדנין, 4 גרם של-לאוצין L, ו -2 גרם כל אחד היסטידין L, L ליזין, L- מתיונין, L- טריפטופן, L- טירוזין אורציל. טוחנים עם ובמכתש, ולאחסן עם פרוtection מן האור. לקבלת מבחר פלסמיד, להכין תערובות חסרות רכיבים ספציפיים לפי צורך, ולהשתמש 0.7 גרם של תערובת חומצות אמינו לליטר בינוני צלחת (ראה שלב 1.1.3).
  2. כן שקופיות קאמריות 8 היטב במיקרוסקופ על ידי ציפוי פני השטח של שקופית עם concanavalin (ConA). זה טוב של השקופית קאמרית, להוסיף 25 μl של 2 מ"ג / מ"ל ​​ConA מומס במים. בעזרת קצה פיפטה, להפיץ את ConA על פני השטח התחתון של הבאר, ואז לאפשר את השקופית אוויר יבש בטמפרטורת החדר למשך לפחות 4-8 שעות. באופן אידיאלי, להשתמש שקופיות קאמריות תוך 24 שעות של ציפוי ConA.
  3. צור זני שמרים עם התכה בתוך המסגרת של GFP או pHluorin למטען endocytic עניין באמצעות תגובת שרשרת פולימרז (PCR) שיטת אינטגרציה מבוססת מתואר Longtine et al. ו גולדשטיין McCusker 25,26.
    הערה: פלסמידים המכילים pHluorin תיוג קלטות עם גנים התנגדות עבור kanamycin (KANMX6) ו nourseothricin ( NATMX4) תוארו בעבר 20.
    1. להגביר קלטות GFP או pHluorin המכילות סמנים לבחירה עם פריימרים המכילים רצפים נוספים ספציפיים לאתר של אינטגרציה הגנומי 20,25.
    2. להפוך את מוצר PCR שנוצר לתוך זן שמרים הרצוי בשיטה תצטט ליתיום 27.
    3. בחר לשילוב של הקלטת על ידי גידול תאים על צלחות YPD המכילות את התרופה המתאימה. כדי להכין צלחות, תמצית שמרים החיטוי 10 גרם, 20 גרם peptone, טריפטופן 0.1 גרם ו 25 אגר גרם 960 מ"ל מים. לפני לשפוך צלחות, לאפשר לתערובת להתקרר עד 55 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן להוסיף 40 מ"ל של 50% גלוקוז או G418 לריכוז סופי של 200 מיקרוגרם / מ"ל לבחירה KANMX6, או nourseothricin לריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל עבור מבחר NATMX4.
    4. אשר שילוב של GFP או תג pHluorin במושבות הפרט על ידי PCR ו / או המערבי סופג באמצעות נוגדנים אנטי GFP,כמו גם על ידי זיהוי של חלבון מתויג על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 20.
      הערה: זני שמרים ספציפיים פלסמידים השתמשו במחקר זה מפורטים בלוחות 1 ו -2, בהתאמה.

2. Assay Endpoint של קרינה יציבה של מטעני constitutively הפנים endocytic

  1. לחסן תאים (~ 3 מושבות קטנות) ב 5 מיליליטר של מדיום YNB חסר חומצות או חומרים מזינים האמין כנדרש לצורך תחזוקת פלסמיד (אם זה אפשרי). לגדל תאים במשך 16-24 שעות באינקובטור רועד מסלולית ב 30 מעלות צלזיוס, עם 250 סל"ד רועד. לחלופין, פס ~ 1-2 מושבת מ"מ של תאים על גבי צלחת YNB חסר חומצות אמינו או חומרי הזנה עבור מבחר פלסמיד, ולגדול תאי הלילה ב 30 מעלות צלזיוס.
  2. מדוד את הצפיפות (OD 600) של כל תרבות הלילה באמצעות ספקטרופוטומטר. הכן דילול 5 מ"ל ב 0.35-0.4 OD 600 מ"ל / במדיום YNB חסר חומצות אמינו או חומרי הזנה עבור PLAתחזוקת סמיד, ולגדול במשך כ 3 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד. אם תאים באמצעות מפוספסים על צלחת, לדלג על שלב זה ולהמשיך עם שלב 2.4 (ראה להלן).
  3. מדוד את צפיפות (OD 600) של תאים, אשר אמור להיות עכשיו בין 0.6-1.0 OD 600 / מ"ל. העבר 1.5 מ"ל של התרבות לצינור microfuge, ותאי גלולה ב 8000 סל"ד (6,800 XG) במשך 2 דקות. הסר 1,475 μl של supernatant.
  4. תביא לתאים מיקרוסקופ פלואורסצנטי. לפני הדמית מדגם זה, להכין שקופיות על ידי resuspending התאים במדיום הנותר, ו הר 3 μl של השעית תא תחת להחליק את מכסה. לחלופין, להכין שקופיות קאמריות 8-גם כמתואר להלן פרוטוקול 3, באמצעות מדיום YNB בהתאם מבחר פלסמיד. באופן אידיאלי, תאי תמונה עם 100X, 1.4 או צמצם מספרי גבוהה (NA) עדשה אובייקטיבית טבילה שמנה, מצלמת 12 או 16 סיבית, ומסנני עירור / פליטה מותאם במיוחד GFP קרינה.
    הערה: אם תאים באמצעות גדלת פסי oצלחת נה, להכין את השקופית על ידי הנחת 3 μl של המדיום YNB טרי על להחליק את המכסה. בעזרת קצה פיפטה, לאסוף מושבה קטנה של תאים מהצלחת, לפזר את התאים לתוך מדיום YNB, ולעגן את ההשעיה וכתוצאה בשקופית זכוכית מייד לפני ההדמיה.
  5. תמונה 4-6 שדות אקראיים של תאים עבור כל תנאי, באמצעות אותם פרמטרי הרכישה (כלומר, מערכות סינון וזמן חשיפה) עבור כל התמונות במסגרת ניסוי.
    הערה: גביית brightfield או תמונה DIC עבור כל שדה יכול להיות מועיל עבור תאים שבהם האות pHluorin הוא הרווה ב MVB ותאים vacuolar.
  6. לכמת עוצמת קרינה של לפחות 30-50 תאים עבור כל תנאי (ראה פרוטוקול 5).

3. Assay קינטי עבור כימות של אנדוציטוזה של מטענים העוברים אנדוציטוזה מווסת

  1. לחסן 2-3 מושבות של תאים שמרים (כ -2 מ"מ קוטר לכל מושבה) ב 5 מ"ל של מדיום YNB חסר מתיונין ולהוסיףחומצות אמינו או חומרים מזינים itional לשמירת מבחר פלסמיד. לגדול תרבויות במשך 16-24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס עם רעד.
    הערה: במאמר זה, פרוטוקולים ללימוד חלבוני מטען endocytic מוסדרים יעשו שימוש של מתיונין permease, Mup1. מטענים אחרים אשר עוברים אנדוציטוזה מוסדרת מתאימים גם עבור תיוג עם pHluorin (למשל, אורציל permease Fur4 אשר נערם על הממברנה הפלזמה בהעדר אורציל, ומפנה בתגובה לשימוש חיצוני אורציל); עבור מטענים אלה, צריכים להיות שונים תנאי תקשורת על מנת לשקף את הביטוי המבוקש, תנאי אינדוקציה והפנמה עבור מטען.
  2. מדוד את הצפיפות (OD 600) של כל תרבות הלילה כ 3 שעות לפני ההדמיה. הכן דילול 5 מ"ל ב 0.35-0.4 OD 600 / מ"ל במדיום YNB חסר מתיונין אמינו נוספות חומצות או חומרים מזינים עבור תחזוקה פלסמיד, ולצמוח בקצב של 30 ° C עם רעד.
  3. טרום לאזן את microsלהתמודד קאמרי או שלב מחומם סביבתיים (אם קיימים) עד 30 מעלות צלזיוס במהלך דגירת 3 השעות של שלב 3.2.
  4. העברת 1 מ"ל של תרבית תאים לצינור microfuge, ותאי גלולה ב 8000 סל"ד (6,800 XG) במשך 2 דקות. הסר 975 μl של supernatant.
  5. כן שקופית קאמרית ConA שטופלה, 8-גם עם רצפת זכוכית הדמיה (פרוטוקול 1.2).
  6. הוסף 200 μl של מדיום YNB חסר מתיונין אמינו נוסף חומצות או חומרים מזינים לבחירה פלסמיד זה טוב. Resuspend התא גלולה משלב 3.4 ב supernatant הנותרים, ושחרר 2.5 μl של השעיה התא לתוך במרכז כל טוב. לפזר תאים על פני השטח של הבאר ידי pipetting למעלה ולמטה, ולאפשר לתאים להסתפק 5-10 דקות.
  7. מניח את השקף הקאמרי על מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההפוך equilibrated עד 30 ° C (ראה שלב 3.3). אתר בתחום של תאים באמצעות תאורה brightfield.
  8. הוסף 50 μl של המדיום YNB המכיל מתיונין 100 מיקרוגרם / מ"ל(מחומם מראש ל 30 מעלות צלזיוס) עד 200 μl של בינוניים הבאר כדי להשיג ריכוז מתיונין סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל. למנוע שיבוש בינוני הבאר על מנת למנוע את התאים מפני צף מלמטה.
  9. אפשר התאים לאזן במשך 2 דקות לפני תחילת הדמיה. מייד לפני צילום התמונה הראשונה, להתאים את מיקרוסקופ כדי במישור המוקד הרצוי (בדרך כלל, מטוס מוקדים משווני עובד הכי טוב).
  10. רוכשת GFP ו brightfield (או DIC) תמונות ב 5 מרווחי דקות במשך 45-60 דקות, באמצעות פרמטרי רכישה זהים עבור כל התמונות בתוך סדרה עתית (למשל, טבילה אובייקטיבית שמן 100X 1.4 NA ו -500 זמן רכישת msec באמצעות מסנן GFP, 100 זמן רכישה msec באמצעות מסנן DIC).
    הערה: אם של הבמה מיקרוסקופ ותוכנת הדמיה לא לאפשר תיקון אוטומטי של סחיפת מישור מוקד, ייתכן שיהיה צורך להתקין מחדש את הפוקוס באופן ידני לפני כל זמן הדמית נקודה. יתר על כן, פעמי רכישהלהשתנות בין מיקרוסקופים בשל הבדלי תאורה וכן מסננים, צריכים להיקבע תנאים אופטימליים לפני ידני תחילת הניסוי. אם מטען endocytic מלבד Mup1 משמש, זה עשוי להיות נחוץ כדי לשנות את מרווחי רכישת זמן הדמיה, כמו גם את משך הניסוי, על מנת לשקף את קינטיקה הפנים כי מטען.
  11. לכמת עוצמת הקרינה של תאים בודדים בכל נקודת זמן (ראה פרוטוקול 5), ולהביע את הערכים כאחוז עוצמת הראשונית של התמונה הראשונה.

4. Assay Endpoint של כימות מטעני endocytic שעוברים אנדוציטוזה מווסת

  1. כן תאי הדמיה כמתואר בפרוטוקול 3 (שלבי 3.1 דרך 3.6).
  2. תמונה 4-5 שדות אקראיים של תאים עבור כל תנאים מייד לפני הוספת מתיונין, באמצעות ערכות brightfield ו- GFP מסננים.
  3. הוסף 50 μl של המדיום YNB המכיל מתיונין 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​(לפני המלחמהmed עד 30 מעלות צלזיוס) עד 200 μl של בינוניים הבאר כדי להשיג ריכוז מתיונין סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל. למנוע שיבוש בינוני הבאר על מנת למנוע את התאים מפני צף מלמטה.
  4. תמונת 4-5 שדות אקראיים של תאים 30 דקות אחרי תוספת של מתיונין, באמצעות אותם פרמטרי הרכישה עבור נקודת זמן 0 דקות (שלב 4.2).
  5. לכמת עוצמת קרינה של לפחות 30-50 תאים עבור כל נקודת זמן (ראה פרוטוקול 5). ערכים אקספרס כאחוז Mup1-pHluorin הפנימו לאחר 30 דקות באמצעות הנוסחה: [Mean עוצמת ב 0 דק '- Mean עוצמת ב 30 דק'] / [Mean עוצמת ב 0 דקות] x 100%.
    הערה:. אפשר לבצע בו זמנית לשמונה מבחני נקודות קצה על ידי מזעזע את שעת ההתחלה של כל assay טבלה 3 מספק עבודה למשל במשך שמונה מבחני סימולטני.

5. לאחר רכישת ניתוח

  1. יצוא תמונות מתוכנת רכישה כהצגת 16 סיבי פורמט קובץ דימוי מתויג (.tif או .tiff).
    הערה: פורמטים של קבצים אחרים עשויים גם להיות מתאימים, ורצוי להשתמש אלגוריתמי דחיסה lossless. תמונות 8 סיביות הן בדרך כלל אינן מתאימות למטרות כימות.
  2. פתיחת קבצים באמצעות תוכנת ImageJ (זמינה באופן חופשי בהתאם לשיקול 'פתח' בתפריט 'הקובץ'. השתמשו תמונת קרינת כימות, ותמונת brightfield / דסק"ש כהתייחסות לזהות את המיקום של תאים שלא לכלול תאים מתים (אם קיים ), אשר מופיעים כהה יותר תאים חיים כאשר נצפים על ידי דסק"ש והם autofluorescent כאשר צפו עם מסנני עירור GFP / פליטה.
  3. בצע רקע חיסור על תמונת הקרינה. לקבלת תמונות עם אות רקע אחיד, להשתמש באלגוריתם "חיסור רקע 'נמצא' תפריט התהליך '. השתמש הגדרת ברירת המחדל (מתגלגל רדיוס כדור של 50 פיקסלים), וזה מספיק בדרך כלל למטרות כימות.
    הערה: כרטיס backgro חלופישיטת חיסור und עבור תמונות עם רקע אחיד המתואר בשלב 5.3.1.-5.3.2; עם זאת, השיטה הנ"ל פועלת גם עבור רקע אחיד.
    1. לקבלת תמונות עם רקע אחיד (כלומר, עוצמת רקע היא כ קבועה בכל בקצוות במרכז התמונה), לבצע חיסור רקע ידני. לחץ על הכפתור 'הבחירות חופשיות' נמצא בחלון ImageJ הראשי, ובחר 3-5 אזורים אקראיים בתוך התמונה שאינו מכיל תאים.
    2. פתח את הפונקציה 'מדידות הגדר' ממוקם בתפריט 'ניתוח', לבחור את הפרמטר "Mean גריי ערך ', ולמדוד ערכי העוצמה באמצעות הפונקציה' מדוד '(נמצא גם בתפריט' ניתוח '). חשב את הערך הממוצע 3-5 האזורים נמדד, ולחסר מכל המידות הבאות באותו דימוי.
  4. עבור כימות של מבחני הקינטית (פרוטוקול 3), ליצור תמונה אחת, מוערמים על timסדרת ה. פתח את התמונות הקרינה מן כל נקודת זמן בסדר כרונולוגי, וליצור ערימות באמצעות 'תמונות כדי סטאק' פונקציה (שנמצאת בתפריט 'תמונה', תחת תפריט המשנה סטאקס).
  5. מיתאר תא באמצעות כלי הבחירה ביד חופשית, והקפד לכלול את כל התא אך שטח קטן כמו החיצוני של התא ככל האפשר.
  6. מדוד את הפרמטרים הבאים: 'ישיבה, צפיפות משולבת' ו 'ערך הממוצע גריי ". פרמטרים בחרו באמצעות הפונקציה 'מדידות גדר ", הממוקמת בתפריט' ניתוח '.
    הערה: הצפיפות משולבת תואמת את הסכום של כל עוצמות פיקסל בתוך האזור הנבחר, ולהתכוון גריי ערך מקביל [משולב צפיפות / Area], מתקנת ערכים עוצמים עבור גודל תא.
  7. פתח את 'מנהל ROI' ממוקם בתפריט 'ניתוח', תחת תפריט המשנה 'כלים'. בחלון מנהל ROI, לחץ על הכפתור "הוסף" כדי להיכנס Regio המודגשתn כאזור חדש של (ROI) ריבית.
  8. חזור על שלבים 5.4 דרך 5.6 עבור התאים הנותרים בתמונה. אל תכלול את כל תאים מתים לפי הערכת brightfield / דסק"ש קרינה (תאים מתים להופיע כהים בתמונות DIC, ויש אות ציטופלסמית autofluorescent כאשר צפו עם / פליטת עירור GFP, ראו האיור 2F), וכל תאים לגעת בשולים של התמונה. שמור את ROIs נבחרים כקובץ .zip על ידי לחיצה על כפתור 'עוד' בחלון 'מנהל ROI', ולייצא כל המדידות לגיליון אלקטרוני או תוכנת ניתוח סטטיסטי.
  9. עבור כימות של מבחני הקינטית (פרוטוקול 3), מתאר ולמדוד תא מנקודת זמן הראשונית כמתואר בשלבים 5.4 ו -5.5. השתמש ROI אותו למדידה בכל נקודות הזמן שלאחר מכן בניסוי.
  10. עבור מבחני סיום (פרוטוקולים 2 ו -4), למדוד מינימום של 30-50 תאים עבור כל תנאי. בצע כימות במשך 2-3 תמונות לפחות, וכוללים את כל התאים בכלתמונה עומדת בקריטריונים המפורטים בשלב 5.8 בניתוח.
  11. הערכה מובהקת סטטיסטי בין דגימות באמצעות ANOVA חד-כיווני, ואחריו מבחן ההשוואה הנפוץ של Tukey לניתוח פוסט הוק.

ניתוח אוכלוסייה 6. Mup1-pHluorin אנדוציטוזה ידי cytometry זרימה

  1. לחסן 2-3 מושבות של תאי שמרים (כ -2 מ"מ קוטר לכל מושבה) ב 0.5 מיליליטר של מדיום YNB חסר מתיונין וחומצות אמינו נוספים או חומרים מזינים לשמירת מבחר פלסמיד. לגדל תאים 5 מ"ל צינורות מסביב לתחתית במשך 16-24 שעות ב 30 מעלות צלזיוס על תוף הרים.
  2. הוסף 1.5 מיליליטר של מדיום YNB חסר מתיונין אמינו נוסף חומצות או חומרים מזינים עבור תחזוקת פלסמיד, ולצמוח בקצב של 30 מעלות צלזיוס למשך שעה 3 נוספת על תוף הרים.
  3. העברת 1 מ"ל של תאים לתוך כל אחד משני 5 מ"ל מסביב לתחתית צינורות. להוסיף 0.25 מ"ל של מדיום YNB -Met אל הצינור הראשון (מצב -Met), ו -0.25 מ"ל של מדיום YNB המכיל 100 מיקרוגרם/ מ"ל ​​מתיונין אל הצינור השני לתת הריכוז מתיונין סופי של 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​(+ מצב Met). דגירת תאים ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות על תוף הרים.
  4. לנתח את התאים על ידי זרימה cytometry, בחירת קדימה פיזור (FS) כמדד גודל התא, ועוצמת הקרינה Mup1-pHluorin מתוך isothiocyanate והעמסת (FITC) מסנן כמדד הפנמה המטען.
  5. השתמש בלחצני המחוון כדי להתאים את המתח של FS וערוצי FITC לייעל גילוי עוצמת מגוון הקרינה גודל התאים שמרים בשימוש (לניסויים אלה, הגדרות השתמשו היו 50 V עבור FS ו -400 V עבור FITC).
    הערה: מתח עבור שני הערוצים ישתנה בהתאם cytometer את הזרימה בשימוש. צעד זה צריך להיעשות לפני או במהלך הטיפול 45 דקות עם מתיונין (שלב 6.3).
  6. מדוד FS ועוצמת קרינה עבור 10,000 תאים מכל מצב, באמצעות הגדרת קצב זרימה הגבוהה. צור עלילת פיזור של FS נגד fluorescence עוצמת: לחץ על 'להוסיף גרף', בחר FITC (ציר x) ו FS (ציר y), ונקודות גרף 1,000 (התוכנה תציג ערכים עבור 1,000 תאים, למרות 10,000 תאים נמדדו).
    הערה: לקבלת עקביות מקסימלי, לאבחון תאים 45-50 דקות אחרי תוספת של מתיונין; עבור ניסויים מעורבים מספר רב של דגימות, להתנודד תוספת של מתיונין כדי להתאים את הזמן הנדרש לניתוח cytometry זרימה.
  7. כלול תנאי -Met ו + Met עבור wild-type (WT) תאים כביקורת. שימוש בפונקציה השער, להקצות השער אנכי באמצעות התנאי Met WT +, כך כ 5% מכלל התאים הבהירים ליפול בצד ימין של השער. השתמש gating זה עבור כל יתר התנאים בניסוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לוקליזציה וכימות יציבים של חלבון מטען endocytic הפנים constitutively Ste3

על מנת להוכיח כי מטענים מתויג pHluorin יכול להיות מנוצל עבור כימות של אנדוציטוזה בתאים חיים, לוקליזציה של ה- GFP כימרי ו התכה pHluorin עם הזנב C- מסוף cytoplasmic של Ste3, הקולטן פרומון א-גורם בשמרים, הושוו. Ste3 הוא קולטן המצומד לחלבון G (GPCR) כי מועבר cons...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

יישומים של pHluorin כימות של אירועי endocytic בתאי שמרים עושים שימוש מטענים הטרנסממברני שבו תג הניאון הוא קבע את זנב cytoplasmic של החלבון (איור 1 א). עבור המבחנים המתוארים כאן, מטענים הם פלורסנט במאור פנים כאשר תג pHluorin חשוף בסביבות ניטראליות, אבל להיות רווה כאשר תג pHluorin מפגשים בתנאים חומציים. לפיכך, מטען endocytic מתויג pHluorin מזוהה בקלות בפניו cytoplasmic של קרום פלזמה על endosomes מוקדם, אבל הופך "לעמעם" כאשר שולבו שלפוחית ​​MVB לומינל או עם...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברצוננו להודות ל-Gero Miesenböck ו-Tim Ryan על שיתוף pHluorin cDNA המשמש ליצירת ריאגנטים במחקר זה, לנתן רייט, ג'ואנה פופרובסקי ולידיה ניאסה על הסיוע הטכני המצוין, לחברי מעבדת וונדלנד על דיונים מועילים, ולמייקל מק'קאפרי וארין פרייס במרכז ההדמיה המשולב (ג'ונס הופקינס) על ייעוץ וסיוע במיקרוסקופיה וזרימה ציטומטרית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (ל-B.W., GM60979) והקרן הלאומית למדע (ל-B.W., MCB 1024818). ק.ו. נתמך בחלקו על ידי מענק הכשרה מהמכונים הלאומיים לבריאות (T32-GM007231). A.F.O. נתמך על ידי קרנות פיתוח מהמחלקה למדעי הביולוגיה באוניברסיטת Duquesne ומענק CAREER של הקרן הלאומית למדע 553143.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אדניןסיגמאA8626-25Gהשתמש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
Bacto-agarFisherBP1423-2השתמש להכנת אמצעי צלחת
BD Difco שמרים בסיס חנקן (ללא חומצות אמינו)BD291920השתמש להכנת מדיה נוזלית וצלחת
Concanavalin ASigmaC5275-5MGהשתמש לציפוי תא שקופיות
דקסטרוזפישרBP350-1שימוש להכנת חומר נוזלי וצלחת
L-HistidineFisherBP382-100שימוש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
L-LeucineAcros125121000שימוש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
L-ליזיןפישרBP386-100השתמש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
L-מתיוניןפישרBP388-100השתמש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
L-טריפטופןפישרBP395-100השתמש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
L-טירוזיןאקרוס140641000השתמש להכנת תערובת חומצות אמינו
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass ( 8-well)Thermo Scientific155411שימוש לבדיקות קינטיות ונקודות קצה של הפנמת Mup1-pHluorin
UracilSigmaU0750-100Gשימוש להכנת תערובת חומצות אמינו ותמיסת מלאי
Axiovert 200 מיקרוסקופ הפוךCarl ZeissCustom Build
100X/1.4 Plan-Apochromat Oil Immersion Lens CarlZeissהמטרה צריכה להיות 100X
SensicamCooke Corporationומעלה, צריכה להיות בעלת טווח דינמי של 12 סיביות ומעלה
X-Cite 120PC Q Illumination SourceExcelitas Technologies
Slidebook 5 softwareIntelligent Imaging Innovations
ImageJsoftware National Institutes of Healthhttp://imagej.nih.gov/ij/
מצלמת 1.4NA

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kaksonen, M., Sun, Y., Drubin, D. G. A pathway for association of receptors, adaptors, and actin during endocytic internalization. Cell. 115 (4), 475-487 (2003).
  2. Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A modular design for the clathrin- and actin-mediated endocytosis machinery. Cell. 123 (2), 305-320 (2005).
  3. Boettner, D. R., Chi, R. J., Lemmon, S. K. Lessons from yeast for clathrin-mediated endocytosis. Nat Cell Biol. 14 (1), 2-10 (2012).
  4. Taylor, M. J., Perrais, D., Merrifield, C. J. A High Precision Survey of the Molecular Dynamics of Mammalian Clathrin-Mediated Endocytosis. PLoS Biol. 9 (3), e1000604(2011).
  5. Hansen, C. G., Nichols, B. J. Molecular mechanisms of clathrin-independent endocytosis. J Cell Sci. 122 (11), 1713-1721 (2009).
  6. Sabharanjak, S., Sharma, P., Parton, R. G., Mayor, S. GPI-anchored proteins are delivered to recycling endosomes via a distinct cdc42-regulated, clathrin-independent pinocytic pathway. Dev Cell. 2 (4), 411-423 (2002).
  7. Radhakrishna, H., Klausner, R. D., Donaldson, J. G. Aluminum fluoride stimulates surface protrusions in cells overexpressing the ARF6 GTPase. J Cell Biol. 134 (4), 935-947 (1996).
  8. Prosser, D. C., Drivas, T. G., Maldonado-Báez, L., Wendland, B. Existence of a novel clathrin-independent endocytic pathway in yeast that depends on Rho1 and formin. J Cell Biol. 195 (4), 657-671 (2011).
  9. Prosser, D. C., Wendland, B. Conserved roles for yeast Rho1 and mammalian RhoA GTPases in clathrin-independent endocytosis. Small GTPases. 3 (4), 229-235 (2012).
  10. Kohno, H., et al. Bni1p implicated in cytoskeletal control is a putative target of Rho1p small GTP binding protein in Saccharomyces cerevisiae. EMBO J. 15 (22), 6060-6068 (1996).
  11. Evangelista, M., et al. a Yeast Formin Linking Cdc42p and the Actin Cytoskeleton During Polarized Morphogenesis. Science. 276 (5309), 118-122 (1997).
  12. Kübler, E., Riezman, H. Actin and fimbrin are required for the internalization step of endocytosis in yeast. EMBO J. 12 (7), 2855-2862 (1993).
  13. Lin, C. H., MacGurn, J. A., Chu, T., Stefan, C. J., Emr, S. D. Arrestin-Related Ubiquitin-Ligase Adaptors Regulate Endocytosis and Protein Turnover at the Cell Surface. Cell. 135 (4), 714-725 (2008).
  14. Nikko, E., Sullivan, J. A., Pelham, H. R. B. Arrestin-like proteins mediate ubiquitination and endocytosis of the yeast metal transporter Smf1. EMBO Rep. 9 (12), 1216-1221 (2008).
  15. Nikko, E., Pelham, H. R. B. Arrestin-Mediated Endocytosis of Yeast Plasma Membrane Transporters. Traffic. 10 (12), 1856-1867 (2009).
  16. O'Donnell, A. F., McCartney, R. R., Chandrashekarappa, D. G., Zhang, B. B., Thorner, J., Schmidt, M. C. 2-Deoxyglucose impairs Saccharomyces cerevisiae growth by stimulating Snf1-regulated and α-arrestin-mediated trafficking of hexose transporters 1 and 3. Mol Cell Biol. 35 (6), 939-955 (2015).
  17. O'Donnell, A. F., Huang, L., Thorner, J., Cyert, M. S. A calcineurin-dependent switch controls the trafficking function of α-arrestin Aly1/Art6. J Biol Chem. 288 (33), 24063-24080 (2013).
  18. Prosser, D. C., Pannunzio, A. E., Brodsky, J. L., Thorner, J., Wendland, B., O'Donnell, A. F. α-Arrestins participate in cargo selection for both clathrin-independent and clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 128 (22), 4220-4234 (2015).
  19. Lamaze, C., Dujeancourt, A., Baba, T., Lo, C. G., Benmerah, A., Dautry-Varsat, A. Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Mol Cell. 7 (3), 661-671 (2001).
  20. Prosser, D. C., Whitworth, K., Wendland, B. Quantitative analysis of endocytosis with cytoplasmic pHluorin chimeras. Traffic. 11 (9), 1141-1150 (2010).
  21. Bokman, S. H., Ward, W. W. Renaturation of green-fluorescent protein. Biochem Biophys Res Commun. 101 (4), 1372-1380 (1981).
  22. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  23. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  24. Katzmann, D. J., Babst, M., Emr, S. D. Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex. ESCRT-I. Cell. 106 (2), 145-155 (2001).
  25. Longtine, M. S., et al. Additional modules for versatile and economical PCR-based gene deletion and modification in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 14 (10), 953-961 (1998).
  26. Goldstein, A. L., McCusker, J. H. Three new dominant drug resistance cassettes for gene disruption in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 15 (14), 1541-1553 (1999).
  27. Ausubel, F. M. Curr Prot Mol Biol. , John Wiley & Sons. New York. (1991).
  28. Urbanowski, J. L., Piper, R. C. Ubiquitin sorts proteins into the intralumenal degradative compartment of the late-endosome/vacuole. Traffic. 2 (9), 622-630 (2001).
  29. Newpher, T. M., Smith, R. P., Lemmon, V., Lemmon, S. K. In Vivo Dynamics of Clathrin and Its Adaptor-Dependent Recruitment to the Actin-Based Endocytic Machinery in Yeast. Dev Cell. 9 (1), 87-98 (2005).
  30. Maldonado-Báez, L., Dores, M. R., Perkins, E. M., Drivas, T. G., Hicke, L., Wendland, B. Interaction between Epsin/Yap180 adaptors and the scaffolds Ede1/Pan1 is required for endocytosis. Mol Biol Cell. 19 (7), 2936-2948 (2008).
  31. Aguilar, R. C., et al. Epsin N-terminal homology domains perform an essential function regulating Cdc42 through binding Cdc42 GTPase-activating proteins. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (11), 4116-4121 (2006).
  32. Isnard, A. D., Thomas, D., Surdin-Kerjan, Y. The study of methionine uptake in Saccharomyces cerevisiae reveals a new family of amino acid permeases. J Mol Biol. 262 (4), 473-484 (1996).
  33. Wendland, B., McCaffery, J. M., Xiao, Q., Emr, S. D. A novel fluorescence-activated cell sorter-based screen for yeast endocytosis mutants identifies a yeast homologue of mammalian eps15. J Cell Biol. 135 (6), 1485-1500 (1996).
  34. Alvaro, C. G., et al. Specific Alpha-Arrestins Negatively Regulate Saccharomyces cerevisiae Pheromone Response by Down-Modulating the G-Protein-Coupled Receptor Ste2. Mol Cell Biol. 34 (14), 2660-2681 (2014).
  35. Ghaddar, K., Merhi, A., Saliba, E., Krammer, E. M., Prevost, M., Andre, B. Substrate-Induced Ubiquitylation and Endocytosis of Yeast Amino Acid Permeases. Mol Cell Biol. 34 (24), 4447-4463 (2014).
  36. Becuwe, M., Léon, S. Integrated control of transporter endocytosis and recycling by the arrestin-related protein Rod1 and the ubiquitin ligase Rsp5. eLife. 3, (2014).
  37. Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Zhao, Y., Emr, S. D. The Endosomal Sorting Complex ESCRT-II Mediates the Assembly and Architecture of ESCRT-III Helices. Cell. 151 (2), 356-371 (2012).
  38. Nickerson, D. P., Russell, M. R. G., Lo, S. -Y., Chapin, H. C., Milnes, J. M., Merz, A. J. Termination of Isoform-Selective Vps21/Rab5 Signaling at Endolysosomal Organelles by Msb3/Gyp3. Traffic. 13 (10), 1411-1428 (2012).
  39. Nickerson, D. P., Merz, A. J. LUCID: A Quantitative Assay of ESCRT-Mediated Cargo Sorting into Multivesicular Bodies. Traffic. 16 (12), 1318-1329 (2015).
  40. Dulic, V., Egerton, M., Elguindi, I., Raths, S., Singer, B., Riezman, H. Yeast endocytosis assays. Methods Enzymol. 194, 697-710 (1991).
  41. Silve, S., Volland, C., Garnier, C., Jund, R., Chevallier, M. R., Haguenauer-Tsapis, R. Membrane insertion of uracil permease, a polytopic yeast plasma membrane protein. Mol Cell Biol. 11 (2), 1114-1124 (1991).
  42. Miliaras, N. B., Park, J. -H., Wendland, B. The Function of the Endocytic Scaffold Protein Pan1p Depends on Multiple Domains. Traffic. 5 (12), 963-978 (2004).
  43. Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128 (5), 779-792 (1995).
  44. Toshima, J. Y., Toshima, J., Kaksonen, M., Martin, A. C., King, D. S., Drubin, D. G. Spatial dynamics of receptor-mediated endocytic trafficking in budding yeast revealed by using fluorescent alpha-factor derivatives. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103 (15), 5793-5798 (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Fluorescence MicroscopyFlow CytometryYeast CellsVesicular TraffickingGFP FusionMethionine TreatmentTime lapse ImagingFluorescence Quantification

מאמרים קשורים