מאמר שיטה

10.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54592

⸱

8 בדצמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University Hospital Münster, 2Institute of Biochemistry, University of Münster

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים מודל עכברי במבחנה של מחסום הדם-מוח העושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, תוך התמקדות בהשלכות על שלמות תאי האנדותל וחדירות באינטראקציה עם תאי T מופעלים.

תקציר

פירוק מחסום הדם-מוח (BBB) הוא שלב קריטי בהתפתחות מחלות אוטואימוניות כגון טרשת נפוצה (MS) ודלקת המוח האוטואימונית הניסיונית (EAE). תהליך זה מאופיין בהעברה של תאי T מופעלים על פני תאי אנדותל במוח (ECs), המרכיבים העיקריים של ה-BBB. עם זאת, ההשלכות על תפקוד EC במוח על אינטראקציה עם תאי T כאלה אינן ידועות ברובן. כאן אנו מתארים בדיקה המאפשרת הערכה של תפקוד EC מיקרו-וסקולרי ראשוני במוח העכבר (MBMEC) ושלמות המחסום במהלך האינטראקציה עם תאי T לאורך זמן. הבדיקה עושה שימוש בספקטרוסקופיה של תאי עכבה, כלי רב עוצמה לחקר שלמות וחדירות EC חד-שכבתית, על ידי מדידת שינויים בהתנגדות החשמלית הטרנסאנדותל (TEER) ובקיבול שכבת התא (Ccl). במגע ישיר עם ECs, תאי T מגורים אך לא נאיביים מסוגלים לגרום לתפקוד לקוי של EC חד-שכבתי, כפי שמוצג על ידי ירידה ב-TEER ועלייה ב-Ccl. הבדיקה מתעדת שינויים בשלמות EC חד-שכבתי בצורה רציפה ואוטומטית. הוא רגיש מספיק כדי להבחין בין עוצמות שונות של גירויים ורמות שונות של הפעלת תאי T והוא מאפשר לחקור את ההשלכות של אפנון ממוקד של אינטראקציה בין תאי T ל-EC באמצעות מגוון רחב של חומרים כגון נוגדנים, ריאגנטים פרמקולוגיים וציטוקינים. הטכניקה יכולה לשמש גם כבקרת איכות לשלמות EC במבחני הגירה של תאי T במבחנה. יישומים אלה הופכים אותו לכלי רב-תכליתי לחקר תכונות BBB בתנאים פיזיולוגיים ופתופיזיולוגיים.

מבוא

מחסום דם-המוח מפריד בין המחזור המערכתי ממערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 - 3. הוא מספק מכשול פיזי מעכב את התנועה החופשית של תאים ואת דיפוזיה של מולקולות מסיסות במים מגן על המוח מפני פתוגנים ואפשרות חומרים מזיקים. בנוסף תפקוד המחסום שלה, BBB מאפשרת אספקה ​​של חמצן וחומרים מזינים את המוח parenchyma, אשר מבטיח תפקוד תקין של רקמות עצביות. תכונות פעילות של BBB מוסדרות מאוד על ידי המרכיבים התאיים ו acellular שלה, עם ECS מאוד מיוחדת להיות האלמנט המבני העיקרי שלה. ECS של BBB מאופיינת על ידי הנוכחות של צומת חזק (TJ) מתחמים, חוסר fenestrations, פעילות pinocytic נמוכה מאוד, ואת מנגנוני הובלה פעילים באופן קבוע. רכיבים אחרים של BBB קרום המרתף EC, pericytes הטבעה האנדותל, הרגליים בסוף astrocytic ו = נקוב הקשוריםקרום במרתף enchymal גם לתרום לפיתוח, תחזוקה ותפקוד של BBB 2,4 - 6, ויחד עם נוירונים microglia, מהווים את יחידת העצבים וכלי הדם (NVU), המאפשר תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית 7 - 9.

במגוון מחלות נוירולוגיות, כגון ניווניות, מחלות דלקתיות או זיהומיות, הפונקציה של BBB נפגעת 2,5,10. חוסר וויסות של TJ מתחמי מנגנוני הובלה מולקולרי מוביל גדל חדירות BBB, extravasation לויקוציטים, דלקת ופגיעה עצבית. על מנת ללמוד נכסים BBB בתנאים pathophysiological כאלה, שונים במבחנה מודלים BBB הוקמו 9,11,12. יחד הם סיפקו תובנות רבות ערך את השינויים של מחסום שלמות, חדירות וכן מנגנוני הובלה. מודלים אלה מעסיקים תאי אנדותל של אדם, עכבר, חולדה, חזירי או בהמוצא כבש 13 - 18; תאי אנדותל ראשוני או שורות תאים בתרבית או כמו monoculture או יחד עם pericytes ו / או האסטרוציטים כדי לחקות באופן הדוק יותר את BBB in vivo 19 - 25. בשנים האחרונות, מדידת ההתנגדות החשמלית Transendothelial (TEER) הפכה לכלי מקובל להעריך נכסי מכשול אנדותל 26,27.

TEER משקף את עכבת שטף היונים על פני בשכבת תא הירידה שלה מספקת מדד רגיש של שלמות מחסום אנדותל שנפרץ ומכאן חדירות מוגברת. מערכות המדידה TEER שונים פותחו, כולל אפיתל Voltohmmeter (EVOM), חישה עכבה Cell-המצע חשמלי (ECIS), וניתוח התא בזמן אמת 15,28 - 30. TEER משקף את התנגדות שטף היון בין ECS הסמוכים (מסלול paracellular) והוא ביחס ישרמחסום שלמות. הספקטרוסקופיה עכבת 27,31, עכבה הכוללת מורכבת (Z) נמדדה, אשר מספקת מידע נוסף על שלמות המחסום ידי מדידת Ccl. Ccl מתייחס נוכחי קיבולי דרך קרום תא (מסלול transcellular): שכבת התאים מתנהגת כמו קבלים במעגל השווה החשמלי, הפרדת האישומים משני צידי הממברנה ואת עומדת ביחס הפוך על שלמות המכשול. כאשר גדל על מוסיף חדיר, ECS לדבוק, להתרבות על פני קרום microporous. זה מתנגד זרם קיבולי הרקע של הכנס (שבעצמו מתנהג כמו קבלים) ומוביל לירידת הקיבול עד שהוא מגיע לרמה המינימאלית שלה. זה ואחריו הקמת TJ מתחמים כי חותם מן החלל בין ECS הסמוך. זה מגביל את שטף היון דרך מסלול paracellular, ו TEER מגדילה עד שהוא מגיע לרמה שלה. בתנאים דלקתיים, אולם endotheliמחסום אל נפגע: TEER יורדת ככל TJ קומפלקסים לקבל שיבש Ccl מתחזקת ככל רכיב הקיבולים של הכנס עולה שוב.

מדידת TEER שלנו עושה שימוש במערכת תא ניטור 32 אוטומטית: מסקנה היא עיקרון ספקטרוסקופיה עכבה ומרחיב הבקשות הקודמות שלה. כאן אנו מתארים מודל BBB במבחנה המאפשר חקר תכונותיהם המחסום, כולל האינטראקציה של האנדותל מוח עם תאי חיסון; בפרט תאי T מופעלים. תנאי pathophysiological כאלה הם נצפו מחלות אוטואימוניות של מערכת העצבים המרכזית, כגון טרשת נפוצה ודלקת encephalomyelitis אוטואימוניות הניסוי במודל חיה שלה 33 - 37. כאן, צעד חיוני הוא הגלגול של encephalitogenic, תאי T ספציפי-המיאלין ברחבי BBB. זה ואחריו מחדש שלהם במרחב perivascular וכניסת parenchyma המוח, שם הם מגייסים תאי חיסון אחרים ואותידלקת diate ו demyelination עוקבת 1,35,38. עם זאת, מנגנונים מולקולריים של האינטראקציה בין תאי T כגון ותאי האנדותל, המרכיבים העיקריים של BBB, אינם מובנים היטב. הפרוטוקול שלנו שואף למלא את הפער הזה ולתת תובנה חדשות על ההשלכות על תאי האנדותל (כלומר, שלמות מחסום וחדירות) במגע הישיר שלהם גומלין מורכב עם תאי T מופעלים.

הפרוטוקול המתואר כאן עושה שימוש בתאי אנדותל כלי הדם במוח העכבר העיקרי, גדל כמו בשכבה על מוסיף חדיר עם ממברנות microporous. תאי האנדותל הם שיתוף תרבותי עם תאי CD4 + T, אשר ניתן המופעל מראש או polyclonally או בצורה אנטיגן ספציפי. עמית תרבות MBMECs עם המופעל מראש, אבל לא נאיבי בתאי T גורם לירידה TEER וגידול Ccl, אשר מספק מדד כמותי של הפרעה בתפקוד מחסום MBMEC. הטכניקהפולשני הוא: היא משתמשת מובנהית במקום אלקטרודות מקל, אשר למנוע הפרעה עיקרית של monolayer EC; ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר תפקוד מחסום ללא שימוש סמני תא. זה גורם מדידה רציפה באופן אוטומטי ומאפשר הערכה עצמאית של שני פרמטרים מחסומים (TEER ו CCL) בו זמנית לאורך זמן. השיטה היא גם רגיש מספיק כדי להבחין בין רמות שונות של הפעלת תא T ואפקטים של תאי T כזה על ECS.

ניתן להשתמש בו במגוון רחב של מבחנים תפקודיים: ציטוקינים שונים ו / או כמוקינים מעורבים בתהליכים דלקתיים ניתן להוסיף גם את התרבות המשותפת של MBMECs ותאי T; נוגדנים חוסמים נגד מולקולות הידבקות התא משני האיחוד האירופי או בצד T-cell יכול לשמש; ומעכבים של סמנים הפעלה תא T או נכסי cytolytic שלהם ניתן להוסיף במהלך יחול תאי T או שיתוף התרבות שלהם עם ECS. Assay הוא שימושי גם עבור גלגול T-cellמבחנים, כפי שהוא יכול לשמש בקרת איכות של שלמות monolayer MBMEC לפני התוספת של תאי T. כל זה הופך שיטה זו כלי תכליתי ואמין ללמוד את BBB במבחנה, תוך שימת דגש על ההשפעה של תאי T מופעלים על שלמות monolayer EC. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת להבנת המנגנונים של שיבוש BBB בפתוגנזה של מחלות אוטואימוניות, כגון טרשת נפוצה במודל חיה שלה EAE, שבו תגובתי עצמית, תאי T encephalitogenic לחצות את BBB ולגרום דלקת ונזק עצבי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עבור כל הניסויים, עכברים גדלו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים במתקן החיה המרכזי באונ' מינסטר, על פי הנחיות גרמניות לטיפול בבעלי חיים. כל הניסויים בוצעו על פי הנחיות ועדת האתיקה ניסיון בעלי החיים ואושר על ידי הרשויות המקומיות של נורדריין-וסטפאליה, גרמניה (LANUV, AZ 84-02.05.20.12.217).

1. ניתוק MBMEC ותרבות

הערה: לבודד MBMECs כפי שתואר לעיל בפירוט 14 בשינויים הבאים:

  1. להקריב 20 מבוגרים C57BL / 6 עכברים (6-8 שבועות) משאיפת CO 2 ולאשר מותם ידי בירור מדום לב ונשימה.
  2. יש לשטוף את העכבר עם 70% אתנול ו לערוף אותו במספריים; להסיר את הקרקפת בעזרת מלקחיים ומספריים. ודא חתכים בצד שמאל וימין של הגולגולת, החל מגנום foramen. הרם את הגולגולת מצד הזנב שלה takדואר את המוח עם מלקחיים.
  3. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להשתמש במלקחיים סטרילי כדי למקם את המוח בצלחת פטרי ולהסיר את גזע המוח, המוח הקטן, ו התלמוס, והותירה רק את הקליפה.
    הערה: השימוש במיקרוסקופ אינו הכרחי עבור כל אחד משלבים אלה.
  4. מניח את הקליפה על גבי פיסת נייר סופג המערבי סטרילי ולגלגל אותו בעדינות עם מלקחיים עד קרומי המוח אינם גלויים.
  5. לאחר עיכול מכני אנזימטיות (בעקבות פרוטוקול 14), לאסוף תאי האנדותל מן שיפוע צפיפות באמצעות מחט ארוכה, סטרילי הבוכנה 5 מ"ל. תאי האנדותל להופיע כשכבה עכורים מעל הטבעת האדומה עם אריתרוציטים. העברה 20-25 מ"ל של שכבה זו לתוך צינור צנטריפוגה חדשה 50 מ"ל; למעלה מעלה את הצינור עם DMEM.
  6. אחרי שני סיבובים של כביסה 14, resuspend תאי 6 מיליליטר של מדיום MBMEC המכיל puromycin (4 מיקרוגרם / מיליליטר) וזרע אותם על שש בארות מצופות של צלחת 24 גם; להשאיר אותם בתוך רקמותתרבות חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 (המכונה 'החממה' מכאן ולהבא) במשך שלושה ימים.
    הערה: לפרטים של פתרון הציפוי MBMEC, ראה חומרים טבלה.
  7. שינוי המדיום על ידי הוספת 1 מ"ל היטב בכל מדיום MBMEC טריים ללא puromycin; לשים את הצלחת בחזרה 37 ° C ו 5% CO 2 במשך יומיים נוספים.

2. קציר MBMECs

  1. ביום חמש לאחר בידוד MBMEC, מוסיף חדיר טרום מעיל עם פתרון הציפוי MBMEC: להוסיף 80 μl של פתרון לכל הכנס ולהשאיר אותם על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 3 שעות.
  2. בזהירות פיפטה את פתרון הציפוי ולתת להתייבש באוויר מוסיף למשך 30 דקות. הוסף 2 מ"ל של בטמפרטורת החדר (RT) PBS היטב בכל צלחת, באמצעות MBMECs לשטוף המדיום; חזור על שלב זה. להוסיף 0.05% טריפסין- EDTA (300 μl לכל היטב) ולהשאיר את הצלחת בחממה במשך 5-10 דקות.
  3. הוסף 2 מ"ל של מדיום MBMEC היטב כל להפסיקtrypsinization. העברת התאים שנאספו לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל ו צנטריפוגות אותם ב 700 XG במשך 8 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ו resuspend התאים 1 מ"ל של מדיום MBMEC ללא puromycin.
  4. ספירת התאים; לערבב 10 μl של ההשעיה תא עם 90 μl של 0.04% Trypan כחול (10x דילול של תאים). פיפטה 10 μl של תערובת זו בין כיסוי זכוכית תא ספירת תאים (hemocytometer). רוזן Trypan תאים הכחול-חינם בכל ארבעת הרביעים של החדר (N) ולקבוע את המספר הממוצע של תאים ספרתיים (N ') כדלקמן: N' = N / 4.
  5. חשב את הריכוז התא (ב 10 6 תאים / מ"ל) באמצעות הנוסחה הבאה: C = N 'x 10 x 10 4, שבו 10 4 ניתנת על ידי ממדים של hemocytometer ו -10 הוא גורם לדילול משלב 2.4.
  6. Seed 2 x 10 4 תאים בנפח של 260 μl לכל כנס. להוסיף 810 μl של מדיום MBMEC לתא התחתון של כל טוב. מניח את הצלחת עם מוסיף בחממה עד מוכן להמשיך עם סעיף 4.
    הערה: הכרכים עבור התא העליון ותחתון הם כנס ספציפי ואינו פועלים בכל פורמטי 24 גם.

בידוד גירוי תא 3. CD4 + T

  1. בידוד תא CD4 + T
    1. קורבן עכבר בוגר אחד (6-8 שבועות) משאיפת CO 2 ולאשר למוות על ידי בירור מדום לב ונשימה.
    2. מניחים את העכבר על גבו על קרש החיתוך נקי ולשטוף אותו עם 70% אתנול; להשתמש מספרי מלקחיים סטרילית כדי לפתוח את הצפק ולהסיר את בלוטות הטחול הלימפה (מפשעתי, בבית השחי, זרוע ואת צוואר רחם); ולבסוף, להעביר את הרקמה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של PBS על הקרח.
    3. מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית, להעביר את רקמות באמצעות אחסון PBS עם רקמה לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל עם מסננת תא 70 מיקרומטר על גבי; homogenizeאת הרקמה על ידי לחיצה אותו עם הבוכנה 1 מ"ל דרך מסננת.
    4. הוסף 30 מ"ל של חיץ צנטריפוגות FACS זה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 10 מ"ל של חיץ FACS. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר, להוסיף עוד 20 מ"ל של חיץ FACS אל הצינור.
    5. צנטריפוגה זה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C.. בטל supernatant ו resuspend התאים 500 μl של חיץ FACS.
    6. הוסף 20 μl של microbeads מגנטי העכבר CD4, מערבבים היטב דגירה במשך 15 דקות ב 4 °. הוסף 25 מ"ל של חיץ צנטריפוגות FACS זה ב XG 500 במשך 5 דקות ב 4 ° C..
    7. בינתיים, למקם עמודת הפרדה LS לתוך המגנט ולשטוף אותו עם 3 מ"ל של חיץ FACS. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 3 מ"ל של חיץ FACS.
    8. הוספת תאים לעמודה. לשטוף את העמודה עם 3 מ"ל של חיץ FACS שלוש פעמים. הסר את העמודה המגנט ומניחים אותו על גבי centri חדש 15 מ"לצינור fugation. הוסף 5 מ"ל של חיץ FACS, לשטוף את התאים שכותרתו עם הבוכנה עמודה צנטריפוגות זה ב XG 500 עבור C ° 5 דקות 4.
    9. בטל supernatant ו resuspend התאים ב 3 מ"ל של המדיום הסלולרי T. ספירת התאים כמתואר 2.4 וזרעי 1 x 10 5 תאים ב 100 μl של מדיום בכל טוב.
  2. גירוי תא T מסוג CD4 +
    1. גירוי התאים Polyclonal CD4 + T
      1. מעיל טרום צלחת 96-היטב מסביב לתחתית עם נוגדן אנטי עכבר CD3 מטוהרים (שיבוט 145-2C11) ב- PBS, בריכוז הסופי הרצוי. לדוגמה, מראש לצפות את צלחת מלאה עם α-CD3 ב 1 מיקרוגרם / מ"ל, לערבב 10 μl של הנוגדן (ריכוז המניות = 0.5 מ"ג / מ"ל) עם 5 מ"ל של PBS, מערבולת ולהוסיף 50 μl של תערובת כל טוב עם טפטפת רב.
      2. השאר את הצלחת בחממה במשך 3 שעות. לאחר לבודד את תאי ה- T, לשטוף את הצלחת מראש מצופה פעמים עם PBS. הוסף נוגדן אנטי CD28 מטוהר (שיבוט37.51) לתאי T מבודדים בריכוז סופי רצוי (למשל, 1 מיקרוגרם / מיליליטר); לערבב היטב. זרעים תאי T ולהשאיר אותם בחממה במשך יומיים עד שלושה ימים.
    2. אנטיגן ספציפי גירוי תא CD4 + T עם תאים דנדריטים (DCS)
      הערה: אם DCs משמש תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים), בצע את פרוטוקול בידוד תא T, עם חריגים אלה:
      1. לפני שמאחד את הטחול, להזריק אותו עם 1 מ"ל של Collagenase סוג IA PBS ב 0.5 מ"ג / מ"ל ​​ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
      2. דגירה באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. לאחר שטיפה עם PBS, resuspend גלולה במאגר FACS ולהוסיף 20 μl של microbeads המגנטי CD11c העכבר, במקום microbeads CD4.
      3. השתמש בעמודה ההפרדה MS והיקפי המתאים: לשטוף את העמודה עם 1 מ"ל של חיץ FACS; תאים גלולה ב 1 מ"ל של חיץ FACS ולשטוף את העמודה עם 1 מ"ל של חיץ FACS שלוש פעמים.
      4. מוֹדָעָהאנטיגן D של הבחירה DCS (למשל, גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש"א) aa 35-55 ב 20 מיקרוגרם / מ"ל) בינוני תרבות, מערבבים היטב זרע 5 x 10 4 תאים 100 μl של תא T לכל 96 סיבוב-קרקעית הנהר טוֹב.
      5. הוסף 1 x 10 5 T תאים 100 μl של מדיום תרבית תאי T שידורים גם 96-מסביב לתחתית בסוף, כמתואר בידוד תא פרוטוקול T.
    3. אנטיגן ספציפי גירוי תא CD4 + T עם תאי B
      הערה: אם תאי B משמשים נגמ"שים, בצע את פרוטוקול בידוד תא T, עם חריגים אלה:
      1. השתמש טחול מעכברים מהונדס B אשר התאים אנטיגן ספציפי (למשל, IGH ש"א (Th) עכברים, תאי B אשר במיוחד להכיר MOG 35-55).
      2. השתמש בתאי T אנטיגן ספציפי (למשל, מ TCR ש"א (2D2) עכברים). הוסף 20 μl של microbeads מגנטי העכבר CD19 במקום microbeads CD4.
      3. מוסיפים את האנטיגן של בחירה על cel Bls (למשל, MOG 35-55 ב 20 מיקרוגרם / מ"ל), מערבבים היטב זרע 5 x 10 4 תאים 100 μl של המדיום תרבית תאים B לכל 96-מסביב לתחתית היטב.
      4. הוסף 1 x 10 5 T תאים 100 μl של מדיום תרבית תאי T לכל 96-מסביב לתחתית היטב, כמתואר בפרוטוקול בידוד תא T.

4. הגדרה וביצוע מדידת TEER

  1. מניחים את מודול 24 גם של המכשיר TEER מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית. הסר את המכסים ותוספות מקום עם MBMECs במכשיר באמצעות מלקחיים.
  2. פיפטה 810 μl של מדיום חדש לתא התחתון של בארות מודול: להוסיף אותו בזהירות בין הכנס ואת הקיר של מודול היטב.
  3. סגור את המכסים ומניחים המכשיר בחממה. חברו את המכשיר למחשב שלה; להפעיל את בקר המכשיר ולפתוח את התוכנה.
  4. בחר "מדידה חדשה 'בחלון המוקפץ. צ'הck "להראות TEER 'ותיבות' הצג Ccl '; ולאחר מכן הקש 'להתחיל'. לאחר סיום המדידה הראשונה, בחר 'לבדוק את כל הבארות' בכרטיסייה 'התוצאות' כדי לראות את כל ערכי TEER ו Ccl.
  5. שמור את הקובץ: קובץ> שמור בשם> "בשם הקובץ שלך '.
    הערה: כפי TEER ו Ccl נמדדים בצורה רציפה בצורה אוטומטית, לפקח ערכיהם על פני תקופה של שלושה עד חמישה ימים. שינוי המדיום הוא לא הכרחי, אלא אם כדאיות התא הוא הכי מוצלח, כמו דמיינו ידי חוסר הגידול TEER.
  6. בחר את נקודת הזמן לשתף תרבות MBMECs עם תאי T כאשר Ccl יציב ונמוך 1 μF / 2 ס"מ TEER הגיע לרמה המקסימלית שלה.
  7. בזהירות לבדוק ערכי TEER ו Ccl מוחלטים שולל את הבארות שבו MBMECs לא פתח monolayers מספיק ומחוברות על ידי ביטול סימון בארות כאלה.
  8. קבוצה שאר הבארות: לחץ לחיצה ימנית על באר ובחר 'להוסיף לבאר ממוצע חדש'. נאמתידואר אותו בחלון המוקפץ; לעשות את אותו הדבר עבור להיות מקובצים כל הבארות הבודדות.
  9. בדקו את כל הבארות הממוצעות לאשר כי כולם יש את אותו תנאי ההתחלה לפני לתרבות המשותפת. אם יש כמה ערכים מוחלטים TEER שונה מהותית או TEER המדרונות, או סטיות התקן הם גדולים מדי, לעשות שוב את הקיבוץ.
    הערה: הקיבוץ האופטימלי של בארות מספק וריאציה מינימאלית בערכי TEER, הוא בתוך ובין קבוצות ניסוי.
  10. בלשונית 'ניסוי', 'השהה' העיתונות, נתק את המכשיר ולקחת אותו מתוך האינקובטור. הסר את המכסים מתחת למכסה המנוע זרימה למינרית.
  11. הכן מראש מופעל ו / או תאי T נאיבי, עם או בלי ציטוקינים ספציפיים, נוגדנים או חומרים אחרים, לפי הצורך: לדוגמא: לערבב מטוהרים NA / LE עכברוש אנטי עכבר IFN-γ נוגדן (שיבוט XGM1.2) עם מוכן T תאים, ב 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​לכל טוב של המכשיר TEER.
    הערה: אם חומרים כגון מעכבי granzyme B משמשים, הםdded לתרבות תאי T בתחילת גירוי תא T: למשל, II B המונע Granzyme (Calbiochem) מעורבב עם תאי T מבודדים בריכוז של 10 מיקרומטר סופי DMSO. ראה חומרים וציוד לקבלת פרטים נוספים.
  12. הסר חלק המדיום מן הכנס (תא היטב העליון): למשל, בזהירות פיפטה מתוך 150 μl (הסרת כל מדיום יש להימנע ככל שזה יכול להפריע בשכבה MBMEC).
  13. הוספת תאי T כדי MBMECs ידי pipetting בזהירות 150 μl של מדיום המכיל 2 x 10 5 תאים / להוסיף.
    הערה: בעת קצירת תאים טרום מופעל T, לספור רק פיצוץ, Trypan תאים כחול-חינם.
  14. סגור את המכסים ומניחים את הכלי מהר בחזרה אל האינקובטור. חבר מחדש את המכשיר ולחץ על 'מדידת קורות חיים'. לאחר 24 שעות, לחץ על 'עצור' בלשונית 'ניסוי' ולשמור את הקובץ (File> Save).

5. ייצוא נתונים וניתוח סטטיסטי

  1. לייצא את התוצאות על ידי בחירת קובץ> יצוא.
  2. בכרטיסייה "הגדרות" של חלון מוקפץ, בחר ".dot" באפשרות "המפריד העשרוני" ו "טַבלָר" באפשרות "תוחם השדות".
  3. בלשונית "תוצאות יצוא", שם הקובץ, לבדוק את כל הבארות להיות מיוצאות, וסמנו את "TEER" ו "Ccl" תיבות "נתונים לבחור" האפשרות.
  4. לחץ "נתוני היצוא," לפתוח את הקובץ המיוצא, ולהעתיק את הנתונים לגיליון אלקטרוני.
  5. לנרמל את הנתונים המיוצאים (הממוינים לפי כל לשכפל, עם ערכי TEER ו Ccl הנתון עבור כל מחזור (מדידה)): סט TEER ו Ccl ערכים של הנקודה בפעם האחרונה לפני שיתוף התרבות עד 100% ולשנות בהתאם את הערכים עבור כל האחרים ריצות, ביחס בטווח '100%'.
  6. העתיקו נתונים מנורמלים תוכנה של בחירה כדי ליצור גרף, באמצעות בארות בודדות ולהציג את סטיית ההתקן של הממוצע עבור כל קבוצת טיפול.
  7. Perform מבחן סטטיסטי ANOVA דו כיוונית עם תיקון Bonferroni להשוואות מרובות, באמצעות תוכנת הבחירה הסטטיסטית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מספק סקירה כללית של המודל במבחנה BBB לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין תאי T ותאי האנדותל. הניסוי מורכב משלושה שלבים עיקריים. הצעד הראשון הוא הבדידות של MBMECs ראשית ממנהל בקורטקס המוח, ותרבותם במשך חמישה ימים. כשהם מגיעים למפגש בצלחת תרבית תאים, MBMECs הוא trypsinized ו reseeded על מוסיף חדיר, אשר ממוקמים אז מכשיר TEER. TEER ו Ccl של MBMECs נמדדים בצורה רציפה פיקוח על פני תקופה של שלושה עד חמישה ימים. בינתיים, תאי ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

כמה שלבים של הפרוטוקול המתואר חיוניים עבור ניסוי מוצלח. במהלך הבידוד MBMEC הראשונית ותרבות, חשוב כי העבודה נעשית בתנאים סטריליים ככל האפשר, כדי למנוע את הזיהום של תרבית תאים עם נבגי פטריות או חיידקים. על מנת לקבל תרבות טהורה של ECS, מומלץ להשתמש במצע המכיל puromycin עבור שלושת הימים הראשונים, המאפשר הישרדות של ECS, אבל לא סוגי תאים אחרים (במיוחד pericytes) 41,42. עוד צעד קריטי, כי ראוי לתשומת לב מיוחדת הוא זיהוי של נקודת הזמן הנכונה להוספת תאי T מראש הופעלו. במהלך 48 הש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ל-I. Kuzmanov, A. M. Herrmann, S.G. Meuth, H. Wiendl ו-L. Klotz אין מה לחשוף. H.-J. Galla הוא יועץ מדעי של nanoAnalytics GmbH, יצרנית מוניטור התאים האוטומטי.

תודות

אנו מודים אניקה Engbers ופרנק Kurth לקבלת התמיכה הטכנית המעולה שלהם ד"ר מרקוס שפר (nanoAnalytics GmbH) לדיונים מועילים לגבי מדידות TEER. עבודה זו נתמכה על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה (DFG), A03 פרויקט SFB1009 כדי HW ו LK, CRC TR128, פרויקטי A08; Z1 ו- B01 כדי LK ו HW, ואת המרכז הבינתחומי לחקר קליני (פקולטה לרפואה של מינסטר) מספר מענק Kl2 / 2015/14 עד LK.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
cellZscopenanoAnalytics GmbHwww.nanoanalytics.comכולל: מודול תא 24 בארות, בקר, מחשב עם תוכנת cellZscope v2.2.2 
אולטרה-צנטריפוגהThermo Scientificwww.thermoscientific.comSORVALL RC 6+; רוטור F21S-8x50y; עבור
ציטומטר זרימת בידוד MBMECבקמן קולטרwww.beckmancoulter.comלניתוח הגירה של תאי T
תוכנת FlowJo7.6.5 TreeStarwww.flowjo.comלניתוח גלגול תאי
T צינורות צנטריפוגה של אוק רידג', PCThermo Fisher Scientific3118-005050 מ"ל; לבידוד MBMEC
מוסיף קרום Transwell - גודל נקבוביות 0.4 ומיקרו; mCorning3470למדידת TEER כקריאה העיקרית
מוסיף קרום Transwell - גודל נקבוביות 3 ומיקרו; mCorning3472למדידת TEER כבקרת איכות לפני בדיקת הגירה של תאי T לוחית
תרבית תאים 24 בארותGreiner650 180תחתית שטוחה; עבור תרבית MBMEC
צלחת תרבית תאים 96 בארותCostar3526תחתית עגולה; עבור תרבית תאים חיסוניים
מפריד QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976לבידוד תאי T ותאי B; תומך בבידוד תאי T ותאי B; תומך עמודות MACS LS
מפריד OctoMACSMiltenyi Biotec130-042-109לבידוד תאים דנדריטיים; תומך בעמודות MACS MS
תא ספירת נויבאוארMarienfeldMF-0640010לספירת תאים
מסננת תאים, 70 ומיקרו; mCorning352350לבידוד תאים חיסוניים
מסננת תאים, 40 ומיקרו; mCorning352340לבידוד תאי חיסון
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303לבידוד תאי חיסון
עמודות הפרדה MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401לבידוד תאי T ותאי B
עמודות הפרדה MACS MSMiltenyi Biotec130-042-201לבידוד תאים דנדריטיים
עכבר CD4 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-049-201עבור CD4+ בידוד תאי T
עכבר CD19 MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-201לבידוד תאי B
עכבר CD11c MicroBeadsMiltenyi Biotec130-052-001לבידוד תאים דנדריטיים
קולגן מסוג IV משליה אנושיתSigmaC5533לתמיסת ציפוי MBMEC
פיברונקטין מ פלזמת בקרSigmaF1141-5MGלתמיסת ציפוי MBMEC
קולגנאז 2 (CSL2)וורת'ינגטוןLS004176לבידוד MBMEC
קולגנאז/דיספאז (C/D)Roche11097113001לבידוד MBMEC
DNase ISigmaDN25לבידוד MBMEC
סרום בקר עוברי (FBS)SigmaF7524לבידוד MBMEC
אלבומין בסרום בקר (BSA)אמרסקו0332-100Gלבידוד MBMEC
PercollSigmaP1644-1Lלבידוד MBMEC
DMEM (+ GlutaMAX)Gibco31966-021לבידוד MBMEC ומדיום תרבית MBMEC
פניצילין/סטרפטומיציןסיגמאP4333לבידוד MBMEC ומדיום תרבית MBMEC
חוצץ פוספט תמיסת מלח (PBS)SigmaD8537עבור MBMEC ובידוד תאי חיסון
הפריןסיגמאH3393עבור מדיום תרבית MBMEC
גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי אנושי (bFGF)PeproTech100-18Bעבור מדיום תרבית MBMEC
PuromycinSigmaP8833עבור מדיום תרבית MBMEC; רק בשלושת הימים הראשונים
0.05% טריפסין-EDTAGibco25300-054לקצירת MBMECs
קולגנאז מסוג IASigmaC9891לבידוד תאים דנדריטיים
תמיסת טריפן בלו, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061לספירת תאים
EDTASigmaE5134לבידוד תאי חיסון
IMDM + 1% L-GlutaminGibco21980-032למדיום תרבית תאי T
X-VIVO 15LonzaBE04-418Qמגן מפני אור; למדיום תרבית תאי B
ובטא;-מרקפטואתנולGibco31350-010למדיום תרבית תאי B
L-גלוטמין (100x גלוטמקס)Gibco35050-061לעכבר בינוני תרבית תאי B
MOG35— 55 פפטידBiotrendBP0328להפעלת תאי T ספציפיים לאנטיגן
מטוהר נגד עכבר CD3 AbBioLegend100302שיבוט 145-2C11; להפעלת תאי T פוליקלונליים
מטוהר NA/LE נגד עכבר CD28 AbBD Pharmingen553294שיבוט 37.51; להפעלת תאי T רב-שבטיים
רקומביננטי עכברי IFN-γPeproTech315-05לבדיקות הגירה של תאי T
עכברים רקומביננטיים TNF-αPeproTech315-01Aלבדיקות התמרה של תאי T
/LE מטוהר נגד עכברים IFN-γ נוגדןBD Biosciences554408שיבוט XMG1.2; ריכוז סופי מומלץ: 20 ומיקרו; גרם/מ"ל
מעכב גרנזים B IICalbiochem368055ריכוז סופי מומלץ: 10 ומיקרו;
נוגדן CD4 נגד עכבר M PEBiolegend116005שיבוט RM4-4; לניתוח הגירה של תאי T
NA

מקורות

  1. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction. Semin Immunopathol. 31 (4), 497-511 (2009).
  2. Obermeier, B., Daneman, R., Ransohoff, R. M. Development, maintenance and disruption of the blood-brain barrier. Nat Med. 19 (12), 1584-1596 (2013).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Luissint, A. -C., Artus, C., Glacial, F., Ganeshamoorthy, K., Couraud, P. -O. Tight junctions at the blood brain barrier: physiological architecture and disease-associated dysregulation. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 23(2012).
  5. Zlokovic, B. V. The Blood-Brain Barrier in Health and Chronic Neurodegenerative Disorders. Neuron. 57, 178-201 (2008).
  6. Armulik, A., Genové, G., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  7. Stanimirovic, D. B., Friedman, A. Pathophysiology of the neurovascular unit: disease cause or consequence? J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1207-1221 (2012).
  8. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The Blood-Brain Barrier / Neurovascular Unit in Health and Disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  9. Cardoso, F. L., Brites, D., Brito, M. A. Looking at the blood-brain barrier: molecular anatomy and possible investigation approaches. Brain Res Rev. 64 (2), 328-363 (2010).
  10. Weiss, N., Miller, F., Cazaubon, S., Couraud, P. -O. The blood-brain barrier in brain homeostasis and neurological diseases. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 842-857 (2009).
  11. Deli, M. A., Ábrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: Physiology, pathology, and pharmacology. Cell Mol Neurobiol. 25 (1), 59-127 (2005).
  12. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  13. Bernas, M. J., Cardoso, F. L., et al. Establishment of primary cultures of human brain microvascular endothelial cells to provide an in vitro cellular model of the blood-brain barrier. Nat Protoc. 5 (7), 1265-1272 (2010).
  14. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. J Vis Exp. (93), e52204(2014).
  15. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. J Vis Exp. (88), (2014).
  16. Eigenmann, D. E., Xue, G., Kim, K. S., Moses, A. V., Hamburger, M., Oufir, M. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10 (1), (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Abbott, N. J. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Res. 1521, 16-30 (2013).
  18. Burek, M., Salvador, E., Förster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. J Vis Exp. (66), e4022(2012).
  19. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. Int J Biochem Cell Biol. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  20. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved in vitro BBB model: RBEC co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  21. Sansing, H. A., Renner, N. A., MacLean, A. G. An inverted blood-brain barrier model that permits interactions between glia and inflammatory stimuli. J Neurosci Methods. 207 (1), 91-96 (2012).
  22. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  23. Xue, Q., Liu, Y., et al. A novel brain neurovascular unit model with neurons, astrocytes and microvascular endothelial cells of rat. Int J Biol Sci. 9 (2), 174-189 (2013).
  24. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  25. Nakagawa, S., Deli, M. A., et al. Pericytes from Brain Microvessels Strengthen the Barrier Integrity in Primary Cultures of Rat Brain Endothelial Cells. Cell Mol Neurobiol. 27 (6), 687-694 (2007).
  26. Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  27. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and barriers of the CNS. 10 (1), 5(2013).
  28. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. J Vis Exp. (85), (2014).
  29. Kroon, J., Daniel, A. E., Hoogenboezem, M., van Buul, J. D. Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow. J Vis Exp. (90), e51766(2014).
  30. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
  31. Galla, H. J., Thanabalasundaram, G., Wedel-Parlow, M., Rempe, R. G., Kramer, S., El-Gindi, J., Schäfer, M. A. B. The Blood-Brain-Barrier in Vitro: Regulation, Maintenance and Quantification of the Barrier Properties by Impedance Spectroscopy. Horizons in Neuroscience Research. , Nova. New York. (2011).
  32. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
  33. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The Blood-Brain Barrier, Chemokines and Multiple Sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  34. Larochelle, C., Alvarez, J. I., Prat, A. How do immune cells overcome the blood-brain barrier in multiple sclerosis. FEBS Lett. 585 (23), 3770-3780 (2011).
  35. Choi, J., Enis, D. R., Koh, K. P., Shiao, S. L., Pober, J. S. T Lymphocyte-Endothelial Cell Interactions. Annu Rev Immunol. 22 (1), 683-709 (2004).
  36. Lyck, R., Engelhardt, B. Going Against the Tide - How Encephalitogenic T Cells Breach the Blood-Brain Barrier. J Vasc Res. 49 (6), 497-509 (2012).
  37. Engelhardt, B. Molecular mechanisms involved in T cell migration across the blood-brain barrier. J Neural Transm (Vienna). 113 (4), 477-485 (2006).
  38. von Wedel-Parlow, M., Schrot, S., Lemmen, J., Treeratanapiboon, L., Wegener, J., Galla, H. -J. Neutrophils cross the BBB primarily on transcellular pathways: An in vitro study. Brain Res. 1367, 62-76 (2011).
  39. nanoAnalytics GmbH, Münster, Germany. , Available from: http://www.nanoanalytics.com/en (2016).
  40. Perrière, N., Demeuse, P. H., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. J Neurochem. 93 (2), 279-289 (2005).
  41. Bendayan, R., Lee, G., Bendayan, M. Functional expression and localization of P-glycoprotein at the blood brain barrier. Microsc Res Tech. 57, 365-380 (2002).
  42. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (1), 315-327 (2011).
  43. Malina, K. C. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Res. 1284, 12-21 (2009).
  44. Ruck, T., Bittner, S., Meuth, S. Blood-brain barrier modeling: challenges and perspectives. Neural Regen Res. 10 (6), 889(2015).
  45. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Res. 1053, 162-174 (2005).
  46. Schrot, S., Weidenfeller, C., Schäffer, T. E., Robenek, H., Galla, H. -J. Influence of hydrocortisone on the mechanical properties of the cerebral endothelium in vitro. Biophys J. 89 (6), 3904-3910 (2005).
  47. Seebach, J., Dieterich, P., et al. Endothelial barrier function under laminar fluid shear stress. Lab Invest. 80 (12), 1819-1831 (2000).
  48. Siddharthan, V., Kim, Y. V., Liu, S., Kim, K. S. Human astrocytes/astrocyte-conditioned medium and shear stress enhance the barrier properties of human brain microvascular endothelial cells. Brain Res. 1147, 39-50 (2007).
  49. Santaguida, S., Janigro, D., Hossain, M., Oby, E., Rapp, E., Cucullo, L. Side by side comparison between dynamic versus static models of blood-brain barrier in vitro: a permeability study. Brain Res. 1109 (1), 1-13 (2006).
  50. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784(2012).
  51. Griep, L. M., Wolbers, F., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

T

מאמרים קשורים