הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים

21.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54596

⸱

30 באוקטובר 2016

 ,  , 
1School of Biological Sciences, College of Science, Nanyang Technological University

במאמר זה

סיכום

לימפוציטים הם השחקנים העיקריים בתגובות חיסוניות נרכשות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול טיהור לימפוציטים כדי לקבוע את הפונקציות הפיזיולוגיות של המולקולות הרצויות בהפעלת לימפוציטים במבחנה וב-vivo. הליכי הניסוי המתוארים מתאימים להשוואת יכולות תפקודיות בין לימפוציטים בקרה ללימפוציטים מהונדסים גנטית.

תקציר

לתאי

B ו-T, עם רפרטואר קולטני האנטיגן-קולטני המגוון ביותר שלהם, יש את היכולת להרכיב תגובות חיסוניות ספציפיות כמעט נגד כל פתוגן פולש1,2. מובן שיכולות מורכבות כאלה נשלטות על ידי מספר רב של מולקולות המעורבות בתהליכים תאיים שונים כדי להבטיח תגובות חיסוניות בזמן ובוויסות מרחבי3. כאן, אנו מתארים הליכים ניסיוניים המאפשרים בידוד מהיר של לימפוציטים עכבריים מטוהרים מאוד באמצעות טכנולוגיית מיון תאים מגנטיים. לאחר מכן ניתן לעבור את הלימפוציטים המטוהרים המתקבלים לבדיקות תפקודיות שונות במבחנה או in vivo, כגון קביעת יכולת האיתות של הלימפוציטים בעת גירוי על ידי אימונובלוטינג4 וחקירת יכולות שגשוג על ידי שילוב 3H-thymidine או תיוג carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)5-7. בנוסף להשוואת היכולות התפקודיות של בקרה ולימפוציטים מהונדסים גנטית, אנו יכולים גם לקבוע את יכולת הגירוי של תאי T של תאים מציגי אנטיגן (APCs) in vivo, כפי שמוצג בתוצאות המייצגות שלנו באמצעות תאי OT-I T מושתלים המסומנים ב-CFSE.

מבוא

לימפוציטים בוגרים קיימים בדרך כלל במצב מנוחה אם אין זיהום או דלקת קיימים באדם. לכן, חשוב לשמור על הסטטוס הנאיבי של לימפוציטים במהלך תהליך הבידוד לפני ביצוע בדיקות תפקודיות במבחנה או in vivo. המפתח להבטחת תוצאות עקביות וניתנות לשחזור הוא להגביל כל מניפולציה מיותרת של התאים.

מיון תאים מגנטיים משתמש בנוגדנים ומיקרו-חרוזים כדי לתייג תאים כדי להעשיר את אוכלוסיית התאים המעניינת. בגישה זו, ישנן שתי אסטרטגיות טיהור: העשרה חיובית ודלדול שלילי. העשרה חיובית מעשירה את אוכלוסיית התאים המעניינים באמצעות נוגדן הנקשר לתאי המטרה. דלדול שלילי, לעומת זאת, מדלדל תאים שאינם מטרה, ומשאיר את אוכלוסיית התאים מעניינת. במעבדה שלנו, אנו מעדיפים דלדול שלילי על פני העשרה חיובית מכיוון שקשירת הנוגדנים לתאי המטרה עלולה לשנות את תכונות התא והתנהגותו. למעשה, סמנים מבוססים רבים על פני התא המתאימים לבידוד של אוכלוסיית תאים מסוימת הם גם קולטנים פונקציונליים.

מיון תאים מגנטיים לא רק מניב אוכלוסיות טהורות ביותר של תאי מטרה ברי קיימא, הוא גם גוזל פחות זמן ומונע את הלחץ התאי הנגרם על ידי זרימה בלחץ גבוה המשמשת במיון תאים המופעל פלואורסצנטי (FACS). על ידי תיוג אוכלוסיות התאים הלא רצויות ודלדולן באמצעות עמודת הפרדה מגנטית, אנו מסוגלים לבצע בידוד תאים מהיר מבלי לפגוע בכדאיות של אוכלוסיית תאי היעד. בפרוטוקול זה, אנו מדגימים את השימוש באסטרטגיות דלדול שליליות לטיהור תאי B נאיביים או תאי T.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל העכברים הם התרבו ומתוחזק בתנאים הפתוגן ללא ספציפיים וכל פרוטוקולי העכבר מתנהלים בהתאם להנחיות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש.

1. הכנת Buffers ריאגנטים

  1. הכן מכון הזיכרון רוזוול פארק שלם (RPMI) בינוני (10% בסרום שור העובר חום מומת (FBS), 2 מ"מ L- גלוטמין, פניצילין (100 IU / ml) / סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), 55 מיקרומטר 2-mercaptoethanol ).
  2. כן 20x תמיסת מלח מאוזן (BSS) במלאי 1 ומלאה 2, בנפרד.
    1. כן 20x BSS מניות 1 (111 מ"מ דקסטרוז, פוספט אשלגן 8.8 מ"מ, 26.7 מ"מ dibasic פוספט נתרן 1 מי L סטרילי) ולהוסיף 40 מיליליטר 0.5% פנול אדומים כדי 20x BSS מנייה 1 לפני התאמת נפח סופית. סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן לפני אחסון ב 4 ° C..
    2. הכן 20x BSS המניות 2 (מימית סידן כלורי 25.8 מ"מ, 107 מ"מ אשלגן כלורי, 2.73 M נתרן chloride, 19.6 hexahydrate מגנזיום כלוריד מ"מ, מגנזיום סולפט 16.6 מ"מ 1 מים L סטרילי). סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר מסנן לפני אחסון ב 4 ° C..
    3. כדי להכין 1x BSS לשימוש ניסיוני, לדלל 50 מ"ל BSS מניות 1 ו -50 מ"ל BSS המניות 2, בנפרד, ב 400 מ"ל מים סטריליים כל. שלב שני פתרונות מדולל, להסתגל pH 7, ולהוסיף 20 FBS מ"ל (2%). למעלה עד 1 L באמצעות מים סטריליים סינון סטרילי באמצעות 0.2 מיקרומטר הסינון.
      הערה: פתרונות מניות BSS צריכים להיות מוכנים בנפרד בגלל הערבוב של מניות BSS מרוכזות ישירות עלול לגרום משקעים.
  3. תאי דם אדומים (RBC) הצפת תמוגה
    1. כדי להכין חיץ תמוגה RBC, לערבב 9 חלקים כלוריד אמוניום המניות (אמוניום כלוריד 155 מ"מ במים סטריליים) עד 1 חלק המניה טריס-בסיס (130 מ"מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane במים סטריליים, pH 7.65) לפני השימוש.
      הערה: חנות פתרונות מניות סטרילי כלוריד אמוניום טריס-בסיס על 4 מעלות צלזיוס. הכן תמוגה בuffer טרי על מנת להבטיח תמוגה יעיל של RBCs.

הדור 2. של השעיה לימפוציטים מן הטחול או בלוטות לימפה

הערה: חשוב להכין את כל החומרים כימיים והציוד הנדרשים לצורך הניסוי לפני המתת חסד עכבר כדי ליצור השעיות תא בודדות של לימפוציטים בהקדם האפשרי כדי לשמור viabilities תא גבוה.

  1. להרדים העכבר ניסיוני על ידי נקע בצוואר הרחם או מחנק 2 CO.
    הערה: משלב זה ואילך, כל הפרוצדורות צריכות להתבצע בסביבה נקיה מחיידקים.
  2. טובל את העכבר כולו לתוך אתנול 70% לפני ביצוע כל חתכים. הסר את בלוטות הטחול והלימפה 8 בסביבה נקייה מחיידקים, ומניחים אותם 15 נפרד צינורות מ"ל המכיל 5 מ"ל קר כקרח RPMI / FBS (RPMI עם 2% FBS) או BSS / FBS (משלב 1.2.3).
    הערה: מאז BSS מונע תמוגה RBC יעיל, להשתמש RPMI לעריכת ההשעיה תא הטחול ולעבור BSS after RBC תמוגה.
  3. כדי ליצור השעיה תא בודד מן הצמתים הטחול או הלימפה, למקם את איבר (ים) בין שתי חתיכות של רשת מסננת 100 מיקרומטר תא סטרילי בצלחת פטרי המכילה 2 מ"ל קר כקרח RPMI / FBS או BSS / FBS. באמצעות הבוכנה של מזרק 1 מ"ל, ומועכים את איבר (ים) עד שהוא נקרע לחלקים עדינים מאוד.
  4. מעבירים את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל ולשטוף את מסננת תא רשת עם קרים כקרח RPMI / FBS או BSS / FBS. אסוף את ההשעיה תא הנותרים, להוסיף אותו צינור 15 מ"ל אותו, ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant.
    הערה: Re- להשעות את התאים pelleted על ידי מצליף את הצינור עם האצבעות לפני הוספת RBC תמוגה חיץ או בינוני בשלבים הבאים.
  5. הכן בטמפרטורת החדר (RT) חיץ תמוגה RBC במהלך צנטריפוגה של השעיה התא (ראה שלב 1.3.). לאחר pelleting את התאים הסרת supernatant, מחדש להשעות את התאים עם חיץ תמוגה 1 מ"ל RBC עבור כל 10 8 תאים. Incuבייט התגובה תמוגה ב RT במשך 3-4 דקות.
  6. עצור תמוגה RBC עם 14 מ"ל קר כקרח BSS / FBS ומסובב ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C..

טיהור 3. B ותאי T

  1. טיהור של תאי B
    1. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. Re- להשעות עד 10 8 תאים הטחול ב 300 μl BSS / FBS ולהוסיף 50 μl אנטי CD43 microbeads מגנטי 9,10. כדי להסיר תאים מתים, להוסיף 30 חרוזים מגנטיים μl Annexin V. לדגור על השעיית התא במקרר 4 ° C. למשך 30 דקות.
  2. טיהור של תאי T
    1. ספירת התאים באמצעות hemocytometer. Re- להשעות עד 10 8 תאים קוקטייל נוגדנים דלדול התאים הלא-T (נוגדנים biotinylated נגד CD19, B220, Gr-1, TCR-γδ, CD49b, CD11c, CD11b, Ter119 ו CD4 או CD8 תלוי אוכלוסיית תאים היעד להיטהר), מדולל 1: 200 ב 200 μl BSS / FBS 4,5. דגירת השעית התא4 ° C במקרר במשך 15 דקות.
    2. לאחר דגירה, להוסיף 10 מ"ל BSS / FBS כדי לשטוף את התאים ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant מחדש להשעות את התאים 165 μl BSS / FBS עם 30 microbeads μl streptavidin ו -15 חרוזים מגנטיים μl Annexin V. לדגור על השעיית התא במקרר 4 ° C. למשך 30 דקות.
      הערה: כדי להבטיח אפילו תיוג עם microbeads מגנטי, דגירה התאים עם microbeads במשך 15 דקות, ואז לערבב את ההשעיה תא בעדינות על ידי הקשה על שפופרת 15 מ"ל ו דגירה 15 דקות אחר במהלך שלב 3.1.1. או 3.2.2.
  3. הכנת טור הפרדה עבור טיהור Cell
    1. כן עמודת פרדה בשימוש במהלך תיוג microbead של התאים (שלב 3.1.1. או 3.2.2.). טרום חמים BSS (ללא FBS) RT ולהשתמש 2 מ"ל לשטוף לאזן את העמודה בסביבה נקייה מחיידקים. לאחר איזון עם BSS, בעמודת השטף אסור להתייבש.
      הערה: אנו משתמשים ג LSolumn במקום בעמודה LD מומלץ בשל מחדש השימושיות שלה (ראה שלב 3.4.).
    2. לאחר תיוג עם חרוזים מגנטיים, להוסיף 14 מ"ל BSS / FBS כדי לשטוף את התאים ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant מחדש להשעות את התאים 1-3 מ"ל RT BSS.
    3. צרף מחט 21 G סטרילי אל קצה הטור להפחית את קצב הזרימה במהלך תהליך של היטהרות. טען את השעית התא על טור equilibrated לאסוף את הזרימה דרך המכיל את תאי היעד המטוהרים.
      הערה: הימנע החדרת בועות לתוך הטור בעת טעינה.
    4. לשטוף את העמודה פעם עם 1 מ"ל BSS / FBS לאסוף את הזרימה דרך המכיל את התאים היעד מטוהרים. רענן בעמודה עם הזרם דרך שוב. אסוף את הזרימה דרך לאחר הטעינה השנייה בצינור אותו 15 המ"ל.
    5. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 1 מ"ל BSS / FBS לאסוף את הזרימה דרך המכיל את התאים היעד מטוהרים. לאחר מכן, להוסיף 5 מ"ל BSS / FBS כדי thבעמודת E ו-, עם בוכנה, לשטוף את התא המגנטי שכותרתו מהטור לתוך צינור 15 מיליליטר חדש.
    6. בדוק את הטוהר של התאים שנאספו על ידי cytometry זרימה באמצעות נוגדנים הנקשרים אל פני השטח אנטיגנים של B מטוהרים או תאי T 4,5.
  4. שימוש מחדש טור ההפרדה
    הערה: הטור LS ניתן לעשות שימוש חוזר עד 4 פעמים מבלי להשפיע יעילות הטיהור.
    1. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 5 מ"ל בופר פוספט (PBS) ו -3 פעמים עם 5 מ"ל מים מזוקקים מלמעלה באמצעות הבוכנה.
    2. לשטוף את העמודה עם אתנול 5 מ"ל 70% ולייבש את העמודה באמצעות ברז אוויר נרחב כדי למנוע הצטברות של חלודה בעמודה.
    3. כדי להכין עמודת LS משומשת עבור ניסוי לטיהור נפרד, לשטוף את העמודה מלמטה למעלה עם אתנול 5 מיליליטר 70% באמצעות מתאם המזרק. לאחר מכן, לשטוף את העמודה מלמטה למעלה פעמיים עם 5 מ"ל סטרילי PBS, ואחריו 5 מ"ל PBS פעם מהחלק העליון של העמודה. מוסיפים 2מ"ל RT BSS כדי לאזן את העמודה ולאחר מכן להמשיך טעינת עמודה עם תאים שכותרתו.

4. תיוג CFSE גירוי

הערה: מטוהרי תאים יכולים להיות נתונה למגוון במבחנת מבחנים תפקודיים vivo. כאן, אנו משתמשים בתאי T מטוהרים כדי לקבוע את יכולת גירוי תא T של נגמ"שים 5.

  1. פתרון תיוג טרום חם (FBS 0.1% ב- PBS) עד 37 ° C לפני CFSE טעינה.
    הערה: שימוש באחוז נמוך של FBS ב PBS מפחיתה מוות של תאים במהלך טעינת CFSE וממזערת אובדן תאים במהלך צנטריפוגה. עם זאת, מדי FBS הרבה יכול להפריע טעינת CFSE.
  2. פעמיים שטפו תאים מטוהרים עם פתרון תיוג, אז מחדש תלויה ב -2 x 10 7 תאים / מ"ל בתמיסה תיוג מחומם מראש בתוך שפופרת 15 מ"ל.
  3. הכן 10 מיקרומטר פתרון CFSE (1: 500 דילול של 5 מ"מ CFSE פתרון המניות) בתמיסה תיוג מחומם מראש. צריך CFSE פתרוןטרי להיות מוכן כל זמן כדי להשיג תיוג אופטימלי.
  4. כדי לטעון תאים עם CFSE, להוסיף ההשעיה תא 1 חלק 1 חלק 10 פתרון מיקרומטר CFSE בתוך שפופרת 15 מ"ל ו דגירה בחושך במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לריכוז סופי של 5 מיקרומטר CFSE משמש התווית 1 x 10 7 תאים / מ"ל.
  5. להפוך את הצינור כל 2 דקות כדי להבטיח תערובת הומוגנית של תאים במהלך טעינת CFSE.
  6. כדי לעצור את התגובה, להוסיף כמה כרכים של מדיום RPMI מלא קר כקרח ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C. בטעינת CFSE מוצלחת, התא הגלול יופיע צהבהב.
  7. לשטוף CFSE טעון תאים עוד פעם אחת עם מדיום RPMI מלא קר כקרח ספין למטה ב 453 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C לפני השימוש עבור culturing במבחנה או בגירוי vivo.

5. גירוי חוץ-גופית

  1. כן פתרון 2x מניות של גירויים (פתרון מניות 2x גירויים) מייד לפני שימוש כך 100 μl של פתרון גירויים המניות 2x ניתן להוסיף 100 μl של תאים כדי לנפח סופי של 200 μl לכל היטב צלחת 96-היטב.
  2. אם צלחת מצופה גירויים (IgM או CD40 בתאי B או CD3 ו CD28 בתאי T) נדרש, לדלל את הגירויים PBS מראש מעיל הצלחת תרבות ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לחלופין, הצליח התרבות יכולה להיות מצופה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. ביום הניסוי. פעמים לשטוף את הצלחת המצופית עם PBS (אל תאפשרו הצליח להתייבש בכל עת).
עבור תאי B
גירויים ריכוז סופי
F (ab ') 2 עיזים אנטי עכבר IgM 0.6-2.4 מיקרוגרם / מ"ל
אנטי עכבר CD40 מב 0.5-2 מיקרוגרם / מ"ל
רקומביננטיעכבר IL-4 25 U / ml
lipopolysaccharide 0.1-10 מיקרוגרם / מ"ל
(LPS) מ א coli סרוטיפ 055: B5
עבור תאי T
גירויים ריכוז סופי
Anti-CD3 (צלחת מצופה) 2-10 מיקרוגרם / מ"ל
(50 μl / טוב לציפוי)
אנטי CD28 (צלחת מצופה) 2 מיקרוגרם / מ"ל
IL-2 רקומביננטי 40 U / ml
PDBu (אסתר phorbol) 5-50 ng / ml
A23187 (ionophore סידן) 250 ng / ml

טבלה 1: ריכוזים של גירויים משמש כדי לעורר לימפוציטים בתרבות במבחנה.

  1. עבור תאים B שכותרתו CFSE, מחדש להשעות עד 3 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום RPMI להשלים ותרבות בשלושה עותקים עם 3 x 10 5 תאים / גם ב 96-היטב צלחות שטוחות התחתונה למשך 72 שעות.
  2. עבור תאים T שכותרתו CFSE, מחדש להשעות כדי 0.5-3 x 10 מ"ל 6 תאים / במדיום RPMI להשלים ותרבות בשלושה עותקים עם 0.5-3 x 10 5 תאים / גם ב 96-גם בסיבוב צלחות התחתונה למשך 48 או 72 שעות .

גירוי 6. Vivo

  1. עבור in vivo גירוי, העברת adoptively 4 x 10 6 CFSE שכותרתו תאים T לכל עכבר (לווריד (iv) ב 200 μl PBS) לתוך כל עכבר הנמען MHC בהתאמה.
    הערה: בפרוטוקול זה, CFSE שכותרתו בתאי T ניתן להעביר adoptively באמצעות וריד הזנב או רטרו מסלולית הזרקת תאים אלה יהיה ביתם הלימפה לאיברים כגון בלוטות הטחול והלימפה.
  2. אתגר עכברי נמען יום אחד מאוחר עם האנטיגן.
    הערה:בדוגמה זו, אנו משתמשים ovalbumin (חלבון OVA, 50 מיקרוגרם / עכבר) כמו אנטיגן כי OVA ספציפי, הקולטן של תאי T (TCR) -transgenic תאי T הועברו adoptively לעכברים הנמען. כן חלבון OVA ב PBS סטרילית להזריק 100 μl של חלבון OVA / PBS או שליטת PBS, באמצעות זריקה תת עורית (סי), לתוך כל עכבר נמען 5.
  3. קציר וליצור השעיות תא בודדות מאיברים הלימפה (בלוטות הלימפה טחול) של עכברי נמען 3 ימים לאחר חיסון עם חלבון OVA או PBS. בלוטות הלימפה נפרדות לתוך בלוטות הלימפה הפרוקסימלית (PLN), הכולל בית השחי, זרוע ובלוטות לימפה צוואריות שטחיות) ובלוטות לימפה דיסטלי (DLN), הכולל mesenteric, popliteal, מפשעתי, המותני, ובלוטות לימפה זנב. תאי כתם באמצעות נוגדני FACS המתאימים כדי לבדוק התפשטות תאי T.
    הערה: בניסוי מעקב CFSE התא הזה, CFSE שכותרתו תאי T מעכברי שליטה הזריקו PBS להקים קרינת בסיס הלא-dividing תאים. חלוקות תא של מתרבים, מגורה-אנטיגן, שכותרתו תאי CFSE הם דמיינו ידי מדידת פסגות קרינת 12,13. באמצעות השלט PBS, מספר חלוקות תא של מתרבים, CFSE שכותרתו בתאי T ניתן לקבוע 12,13.
  4. לנתח את נתוני התפשטות תאים שכותרתו CFSE על ידי השוואת מספר חלוקות תא או שיאים בין דגימות (איורים 1 ו -2).
    הערה: לדוגמה, CFSE שכותרתו, OVA הספציפי בתא T adoptively הועבר לעכברי נמען מקבלים את האנטיגן OVA יעבור התפשטות פעילה לעומת עכברי השליטה הזריק PBS 5,12. יתר על כן, ראוי לציין לציין כי ישנן דרכים רבות כדי לנתח נתוני התפשטות תאי CFSE, כפי שהוכחו על ידי הוקינס ועמיתיו 14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

טיהור תא מגנטית של לימפוציטים מאפשרת למשתמשים לטהר אוכלוסיית תא המטרה בסכום זמן קצר יחסית. שימוש בפרוטוקול הדלדול שלנו, הצלחנו להגדיל את אחוז תאי CD8 T (OT-I-הפעלת רקומבינציה גן-1 (RAG-1) עכברי -deficient) מ 72.8% (טיהור לפני כן) 94.2% (לאחר טיהור; 4,5 איור 1A). לימפוציטים המטוהרים אלה לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחנים פונקציונליים במורד לקבוע תמרת התפשטות אות הלימפוציטים 4,5. לדוגמה, אנו יכולים ללמוד את קיבולת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים נוהל טיהור לימפוציטים מאיברים הלימפה. טיהור תא באמצעות מיון חרוז מגנטי היא שיטה מהירה ופשוטה מניב קיימא, תאי יעד מטוהרים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

כדאיויות תא תשואת תא

שמירה על כדאיות של תאים השושלת hematopoietic במבחנה הי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המחקר נתמך על ידי משרד החינוך, סינגפור (AcRF Tier1-RG40 / 13 ו Tier2-MOE2013-T2-2-038). כתב היד בעריכת איימי סאליבן מתקשורת Obrizus.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>חומרים
RPMI 1640 (ללא L-גלוטמין)סרום
מושבת בחום 
L-גלוטמיןGibco25030024
פניצילין/סטרפטומיציןGibco15140114
2-מרקפטואתנולGibco21985023
אנטי-CD43 מיקרו-חרוזים מגנטייםMiltenyi Biotec130-049-801ערבב היטב לפני השימוש
מיקרו-חרוזי סטרפטווידיןMiltenyi Biotec130-048-101ערבב היטב לפני השימוש
חרוזים מגנטיים נגד Annexin VMiltenyi Biotec130-090-201מערבבים היטב לפני השימוש
MACS LD Miltenyi Biotec130-042-901
96 באר U-bottom צלחת תרבית סטריליתGreiner Bio-one650180
96-well F-bottom צלחת תרבית סטריליתGreiner Bio-one655180
100 μ רשתלעיקור באמצעות קרינת UV שימוש קודם
0.2 μ מ  יחידות סינון חד פעמיות סטריליותNalgene567-0020ניתנות להחלפה בכל מכשיר סינון סטרילי CellTrace
VioletInvitrogenC34557CTV בקיצור; חלופה ל-CFSE
CellTrace YellowInvitrogenC34567CTY בקיצור; חלופה ל-CFSE
CellTrace Far RedInvitrogenC34564CTFR בקיצור; חלופה ל-CFSE
Cell Proliferation Dye eFluor 670eBioscience65-0840CPD670 בקיצור; חלופה ל-CFSE
PKH26Sigma AldrichPKH26GLPKH26, חלופה ל-CFSE
NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
דקסטרוזסיגמא אולדריץG7021
אשלגן פוספט מונו-בסיסיסיגמא אולדריץ'P5655
נתרן פוספט דו-בסיסיסיגמא אולדריץ'S5136
פנול אדוםסיגמא אולדריץ'P0290
סידן כלוריד דיהידרטסיגמא אולדריץ'C7902
אשלגן כלוריסיגמא אולדריץ'P5405
נתרן כלוריMerck MilliporeS7653יכול להשתמש ממקורות אחרים
מגנזיום כלוריד הקסהידרטסיגמא אולדריץ'M2393
מגנזיום גופרתיסיגמא אולדריץ'M2643
אמוניום כלורידסיגמא אולדריץ'A9434
טריס-בסיס
דימתיל סולפוקסידסיגמא אולדריץ' D8418
(5-(ו-6-) carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE)בדיקות מולקולריותC-1157מורכבות מחדש ב-DMSO
Phorbol 12,13-dibutyrate (PBDU, Phorbol ester)Sigma AldrichP1269
A23187 (סידן יונופור)Sigma AldrichC7522
<חזק>שם<חזק>חברה <חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
><חזק>נוגדנים וחלבון רקומביננטי
CD11b ביוטין (שיבוט m1/70)Biolegend101204קוקטייל דלדול תאי T
CD11c ביוטין (שיבוט N418)Biolegend117304קוקטייל דלדול תאי
T Gr-1 ביוטין (שיבוט RB6-8C5)Biolegend108404קוקטייל דלדול תאי T
Ter119 ביוטין (שיבוט Ter119)Biolegend116204קוקטייל דלדול תאי
T TCR-γ &דלתא; ביוטין (שיבוט GL-3)Biolegend118103קוקטייל דלדול תאי T
CD19 ביוטין (שיבוט 6D5)Biolegend115504קוקטייל דלדול תאי T
B220 (שיבוט RA3-6B2)Biolegend103204קוקטייל דלדול תאי T
CD49b ביוטין (שיבוט DX5)Biolegend108904קוקטייל דלדול תאי T
CD4 ביוטין (שיבוט GK1.5)Biolegend100404 קוקטייל דלדול תאי T
CD8 ביוטין (שיבוט 53-6.7)Biolegend100704קוקטייל דלדול תאי T
F(ab')2 עזים נגד עכברים IgM (מצופה צלחת)Jackson ImmunoResearch 115-006-07550 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)
נגד עכבר CD40 mAb (מצופה צלחת)Pharmingen 55372250 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)
רקומביננטי IL-4ProSpec Cyt-282
LPS מ-E. coli Serotype 055:B5Sigma AldrichL-4005
Anti-CD3 (שיבוט שיבוט OKT3) (מצופה צלחת)eBioscience 16-0037-8550 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)
Anti-CD28 (שיבוט שיבוט 37.51) (מצופה צלחת)eBioscience 16-0281-8550 ומיקרו; l/well לציפוי (96-well)
רקומביננטי IL-2ProSpecCyt-370
אלבומין מחלבון ביצת עוף, OvalbuminSigma AldrichA7641
בקר עוברי של Gibco 31870025 מסננת תאים m '

מקורות

  1. Nikolich-Žugich, J., Slifka, M. K., Messaoudi, I. The many important facets of T-cell repertoire diversity. Nat. Rev. Immunol. 4 (2), 123-132 (2004).
  2. LeBien, T. W., Tedder, T. F. B lymphocytes: how they develop and function. Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).
  3. Brownlie, R., Zamoyska, R. T cell receptor signaling networks: branched, diversified and bound. Nat. Rev. Immunol. 13 (4), 257-269 (2013).
  4. Neo, W. H., Lim, J. F., Grumont, R., Gerondakis, S., Su, I. C-rel regulates ezh2 expression in activated lymphocytes and malignant lymphoid cells. J. Biol. Chem. 289 (46), 31693-31707 (2014).
  5. Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16 (5), 505-516 (2015).
  6. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  7. Cabatingan, M. S., Schmidt, M. R., Sen, R., Woodland, R. T. Naïve B lymphocytes undergo homeostatic proliferation in response to B cell deficit. J. Immunol. 169 (12), 6795-6805 (2002).
  8. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and Th17 differentiation of naïve CD4 lymphocytes. J. Vis. Exp. (79), e50765(2013).
  9. Su, I., et al. Ezh2 controls B cell development through histone h3 methylation and Igh rearrangement. Nat. Immunol. 4 (2), 124-131 (2003).
  10. Mecklenbräuker, I., Saijo, K., Zheng, N., Leitges, M., Tarakhovsky, A. Protein kinase Cδ controls self-antigen-induced B-cell tolerance. Nature. 416 (6883), 860-865 (2002).
  11. Rush, J. S., Hodgkin, P. D. B cells activated via CD40 and IL-4 undergo a division burst but require continued stimulation to maintain division, survival and differentiation. Eur. J. Immunol. 31 (4), 1150-1159 (2001).
  12. Quah, B. J. C., Warren, H. S., Parish, C. R. Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester. Nat. Protoc. 2 (9), 2049-2056 (2007).
  13. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  14. Hawkins, E. D., Hommel, M., Turner, M. L., Battye, F. L., Markham, J. F., Hodgkin, P. D. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  15. Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. J. Tissue Eng. 4 (1), 1-14 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

BTCFSE
בידוד ההפעלה של Murine לימפוציטים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.