הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

6.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54619

⸱

13 בספטמבר 2016

 ,  ,  , 
1Graduate School of Biomedical Sciences, Rowan University, 2Department of Cell Biology, Rowan University School of Osteopathic Medicine

במאמר זה

סיכום

מערכת בעלות נמוכה, קלה לשימוש וחזק הוא הוקם כדי להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול לשפר הפרת מחסום דם ברשתית המושרית על ידי היסטמין. דליפת כלי דם, הפעלת תא מולר ואת ההמשכיות של תהליכים עצביים מנוצלות כדי להעריך את תגובת הניזק והיפוכו עם תרופה פוטנציאלית, A4 lipoxin.

תקציר

הוקמה מערכת מודל זולה, קלה לשימוש ועוצמתית להערכת טיפולים פוטנציאליים שיכולים לשפר את פריצת מחסום הרשתית בדם. גורם דלקתי, היסטמין, הוכח כפוגע בשלמות כלי הדם ברשתית המתורבתת באמצעות צביעה חיובית של IgG מחוץ לכלי הדם. ההשפעות של היסטמין עצמו ושל תרופות מועמדות לטיפולים פוטנציאליים, כגון ליפוקסין A4, מוערכות באמצעות שלושה פרמטרים: דליפת כלי דם באמצעות צביעה אימונולוגית IgG, הפעלת תאי מולר באמצעות צביעת GFAP ושינוי בדנדריטים עצביים באמצעות צביעה ל-MAP2. יתר על כן, הארגון השכבתי של הרשתית מאפשר ניתוח מפורט של התהליכים של תאי מולר וגנגליון, כגון שינויים ברוחב ובהמשכיות. בעוד שהנתונים המוצגים הם עם תרבית רשתית חזירים, המערכת ישימה למספר מינים. לפיכך, המודל מספק כלי אמין לחקירת ההשפעות המוקדמות של פגיעה בשלמות כלי הדם ברשתית על סוגי תאים שונים וגם להערכת תרופות מועמדות פוטנציאליות לטיפול.

מבוא

גוף גדל והולך של ראיות תומכת בקיומו של מחסום דם ברשתית (BRB) 1-5 ואת הדמיון שלה אל מחסום דם מוח (BBB) ​​6,7. הפשרה של BBB נקשר בחוזקה סיבתי או כסמן אבחון מחלות ניווניות כרוניות כמו מחלת אלצהיימר (AD) 8,9 ו מצבים חריפים כגון הזיות 10. תובנות מכניסטית לתוך פתולוגיות ותגליות אלה עבור מטרות תרופה פוטנציאל הם הקשו בדרך כלל על ידי מורכבות נגישות מוגבלת לרשת של המוח. חלופות כגון in vivo הדמיה 11, המוח organotypic תרבות 12, בתרביות תאים ראשוניים 13,14 ומערכות שיתוף התרבות 15 נוצרו. עם זאת, רוב המודלים האלה דורשים מכשירים מיוחדים, תקופות ניסוי ארוכות או סמנים מרובים כדי לזהות תאים. דמיון פונקציונלי מבני בין BBB ו BRB וכן מתאם בין dysfunctions של שני היה לטעון 16-19. בנוסף, גישה קלה יותר, סוגי תאים מוגדרים היטב שכבתי מבנה אפשרו הרשתית היטב מאופיינת כחלון למוח. הזהויות המבניות ותפקודיות של BBB ו BRB להישאר להיות לעומת בפירוט. עם זאת, פתולוגיות רשתית, במיוחד הפרת BRB, גם נקשרו בחוזקה עם ההתקדמות של מחלות שונות, כולל סוכרת 18-19 לספירה 21,22. לכן, זה עניין להקים מערכת תפקוד BRB לא רק להתוות את המנגנון אלא גם להקרין תרופות פוטנציאליות. בדו"ח זה, תפקוד לקוי פרוטוקול המאפשר BRB באמצעות תרבות ברשתית חריפה פשוט מפותח והציג.

חדירות BBB מוגברות שינויים פתולוגיים דמוית לספירה הוקמו תרבות המוח organotypic מודגרות עם היסטמין, מתווך פרו-דלקתי 12. לכן, במערכת הציגה, היסטמין היה Applמטען לתרבות רשתית vivo לשעבר כדי לגרום בעיות בתפקוד BRB. רשתיות מכמה מינים, כגון musculus Mus ו Bos Taurus, נבדקו. בשל זמינויות הדמיון המסחריות שלהם רקמה אנושית, נוצלו עיני חזירים טריות לספק את הנתונים המדווחים כאן. לאחר דוגרים עם היסטמין ו / או תרופות אחרות, את הרשתיות עובדו להערכה על ידי immunostaining במשך כמה חלבונים 12, כגון אימונוגלובולין G (IgG), אחד המרכיבים העיקריים של דם; גליה fibrillary חלבון חומצי (GFAP), סמן ידוע עבור הפעלת גליה; ו-הקשורים microtubule חלבון 2 (MAP2), חלבון cytoskeletal ספציפי נוירון חיוני להרכבה microtubule. יתר על כן, במודל השכבות של הרשתית מאפשר ניתוח מפורט של התהליכים של תאי מולר ותאי גנגליון, כגון שינויי הרוחב וההמשכיות שלהם. כך מספר פרמטרים נוספים זמינים להעריך את ההשלכות שלBRB הפרה בשלב מוקדם כדי להעריך את השפעות ההיפוך של טיפולים פוטנציאליים וכן.

בפרוטוקול זה, תופעות היפוך הפוטנציאל של תרופות הוקרן מוערכים משלושה היבטים: דליפה של כלי הדם (BVS), הפעלת תאי גלייה והתגובה-נזק של תאים עצביים. כמה שיטות כימותים מנוצלות, למשל, את רמת הביטוי שמוצגת על ידי עוצמת immunostaining, מדידת רוחב של תהליך ורציפות תהליכים עצביים שמוצגים על ידי מסנן שיפור. כדי להמחיש את השיטה טובה יותר וכדי לסייע לפרש את התוצאות, lipoxin A4 (LXA4), תרכובת המסונתזת באופן אנדוגני בתגובה לפציעה דלקתית הפחתה בתפקוד האנדותל 23, נבחר למטרות הדגמה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים בוצעו בהתאם למדיניות של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית השתמשתי ישימה.

1. הכנה

  1. כן תקשורת הייצוב עם 75% בינוניים הנשר השונה של Dulbecco (DMEM), 25% תמיסת המלח המאוזן "הנקס (HBSS). מערבבים היטב, aliquot ולאחסן ב -20 ° C עד השימוש.
  2. הכן את בופר פוספט (PBS) לעקר ידי מעוקר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר. מומלץ לחמם את PBS על 37 ° C לפני הניסוי (5 מ"ל לכל טוב).
  3. כן 10%, 20% ו -30% סוכרוז PBS. לסנן את כל הפתרונים בנפרד מעל 0.22 מיקרומטר מסננים נפרדים עבור עיקור. שמור פתרונות על 4 מעלות צלזיוס.
  4. כן פתרון מניות היסטמין ב PBS לריכוז של 90 מ"מ. לעקר את הפתרון על ידי סינון על מסנן 0.22 מיקרומטר. Aliquot ולשמור הפתרון ב -80 מעלות צלזיוס. הימנע מחזורים להקפיא-ו-הפשרה מרובות.
  5. הפוך paraformaldehyde 4% טרי (PFA) ב- PBS לפני הניסוי. מניחים אותו על קרח.
    זהירות: שמור PFA במנדף וללבוש ציוד מגן מתאים.
  6. הפשרה בינוני הייצוב (20 מיליליטר לכל רשתית). להוסיף פניצילין, סטרפטומיצין לריכוז סופי של 100 U / ml. חלק חם של המדיום (15 מ"ל לכל רשתית) ל -37 מעלות צלזיוס חממה לפני הניסוי. השאירו את שאר המדיום על הקרח.
  7. מניחים את HBSS (10 מ"ל לכל הרשתית) על קרח.

2. רשתית תרבות Organotypic

  1. העברת דגימות במנדף בתרבית רקמה. פתח את עיינית בחתך סביב העדשה. בעזרת מברשת, להסיר את ההומור זגוגי בעדינות מבלי משיכת הרשתית. בעדינות לנתק את הרשתית מהקצה לחתוך עם מברשת לחשוף את בדיסק האופטי. חמור עצב הראייה בתער ולשחרר את הרשתית.
  2. מעבירים את הרשתית לתוך צלחת פטרי ובזהירות לשטוף הרשתית פעם באמצעות HBSS קר. הנח את הדוגמה HBSS על iלִספִירַת הַנוֹצרִים. לנתח כמה הרשתיות החוצה לפי הצורך על ידי חזרה על שלב 2.1 ו על שלב זה.
  3. חותכים את הרשתית לשניים באופן סימטרי עם תער. בעדינות להעביר דגימות לצלחת 6-היטב עם 3 מ"ל של התקשורת ייצוב לכל טוב. אפשר איזון למשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור עם האווירה המכילה 5% CO 2.
  4. הכן את ריאגנטים הבאים במהלך הדגירה על שלב 2.3: לדלל את הפתרון המניות היסטמין לריכוז הרצוי (450 מיקרומטר) במדיום חמים. ממיסים LXA4 (מאוחסן תחת ארגון) לתוך המדיום לריכוז סופי של 250 ng / ml.
    הערה: כאשר מודדים את השפעת LXA4, מחצית מן הרשתית יחיד משמש היסטמין לבד, בעוד החצי השני משמש היסטמין עם LXA4.
  5. לשאוב את המדיום ייצוב בזהירות ולהוסיף המדיום מוכן היטב כל (3 מ"ל לכל טוב). דגירת הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. באינקובטור עם האווירה המכילה 2 5% CO.
  6. שוטפים אתדגימות פעם חם, PBS סטרילית.

3. להכין את דגימות Immunostaining

  1. לשאוב PBS מהצלחות. להוסיף 4% PFA (3 מ"ל לכל טוב) ו דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  2. במהירות לשאוב PFA. שוטפים את דגימות פעם באמצעות PBS. העברת דגימות 10% סוכרוז (5 מ"ל לכל טוב) ו דגירה של 2 עד 4 שעות ב 4 ° C.
  3. העברת דגימות סוכרוז 30% (5 מ"ל לכל טוב) ו דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס. מערבב חלק אחד של מדיום ההקפאה המסחרי עם שני חלקים של סוכרוז 20% על מנת להפוך את מדיום ההקפאה עובד. תשאיר את זה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או יותר עד באוויר בועות להיעלם.
  4. העברת דגימות המדיום מקפיא עובד ולאפשר איזון במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. חתוך כל רשתית למלבנים (בערך 3 מ"מ על 5 מ"מ).
  5. להעביר בזהירות את דגימות לתוך התקשורת מקפיא עובד הכלול מיכל גלילי (כ -1 ס"מ רדיוס x 2 ס"מ גובה) devised מרדיד אלומיניום. ודא פרוסות רשתית הם אנכיים (אוריינטציה לספק חתך של הרשתית על חתך) ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. שמור את אבני ב -80 ° C עד השימוש.
  6. סעיף כל בלוק על cryostat ל -14 מיקרומטר פרוסות עבות ו הר בסעיפים בשקופיות זכוכית. אחסן את השקופיות ב -80 ° C עד השימוש.

4. Immunostaining

  1. שטפו את החלקים עם חיץ פוספט סוכרוז 5% (SPB, סוכרוז 5% ב PBS, pH 7.4) פעם. חסום את אתרי הקישור הלא ספציפית על ידי דוגרים סעיפים בחסימת המאגר (5% SPB עם 10% נסיוב עז נורמלי 0.5% Triton X-100) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
  2. דגירת הסעיפים (בשקופיות) עם הנוגדן הראשוני המתאים (GFAP או MAP2, מדולל ב 1: 500 בחסימת מאגר) במשך שעה 1. לשאוב את הפתרון. לשטוף שלוש פעמים ב 5% SPB. עבור מכתים את IgG אנדוגני, לדלג על שלב זה.
  3. דגירה החלקה עם SECON המקבילנוגדנים dary (Cyanine3 / FITC IgG אנטי עכבר חמור מצומדות / נגד ארנב, מדולל ב 1: 800 במאגר חסימה) במשך שעה 1.
  4. שטפו את החלקים ביסודיות עם 5% SPB שלוש פעמים. להכין את דגימות במיקרוסקופ על ידי מקבע אותם ב הרכבה בינונית המכיל DAPI והתכסות coverslips.
  5. באמצעות מיקרוסקופ לייזר confocal, ללכוד תמונות באמצעות עדשה 20X תחת פרמטרים זהים כגון עוצמת הלייזר, ערך רווח, להתעכב זמן, וכו 'בין הקבוצות. הגדר את אורכי גל עירור / פליטה עבור הערוץ הכחול (כדי לזהות DAPI) כמו 408/447 ננומטר, עבור במסלול האדום (כדי לזהות Cyanine3) כמו 561/785 ננומטר עבור המסלול הירוק (כדי לזהות FITC) כמו 488/525 ננומטר .

ניתוח תמונה 5.

  1. לכמת אחוז כלי דם דולפים על פי הקריטריונים הבאים 12: כלול רק כלי דם עם גרעיני תא האנדותל בתוך מטוס סעיף במניין; לשקול דולפי כלי דם אם הוא מראה AGradient של immunostaining סביב הספינה.
  2. כדי לקבוע את רמת הביטוי, לבחור אזורים של עניין ולמדוד את הערך האפור הממוצע באמצעות תוכנת ניתוח תמונה.
  3. כדי למדוד את הרוחב של התהליך, לבחור שטח של המקטע שבו התהליכים מובחנים (השכבה החיצונית גרעינית, ONL, למשל). לאחר מכן בחר שדה אופטי שבו תהליכים אלו גלויים ורציפים. הגדר את סרגל קנה המידה בהתאם להגדרה המיקרוסקופית, למתוח קו על פני התהליך ולבצע את המדידה.
  4. כדי לנתח את ההמשכיות של תהליך, באזורים נבחרים של עניין, להחיל את המסנן נקרא השונות אשר משפר את הקצוות של התמונה על ידי החלפת כל פיקסל עם השונות בשכונה שלה, באופן אוטומטי את הניגודיות והבהירות, לספור את השורות לנרמל את הספירה על ידי אֵזוֹר.
  5. חישוב משמעויות סטטיסטיות באמצעות -test t של סטודנט שני זנב. *, P <0.05; **, P <0.01; ***, P <0.001. Pהרבה תוצאה כמו ממוצע ± SEM.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו מציגים מערכת בעלות נמוכה, זמן יעיל וקל לשימוש להעריך טיפולים פוטנציאל שיכול להגן מפני הפרת BRB המושרה על ידי היסטמין. IgG הוא מוגבל בתוך הכלי ברשתית ביקורת (איור 1 א), אך הדלפות מתוך כלי הדם בחשיפת היסטמין (איור 1B), המאשר כי המודל הוקם בהצלחה.

LXA4 נבחר כדי להדגים את ההקרנה לתרופות נגד הפרת BRB במערכת הציגה. ת...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בדוח זה, אנו מציגים מודל רשתית חריפה רב עוצמה ex vivo של תפקוד לקוי של BRB באמצעות רשתית החזירים. מערכת מודל זו אינה דורשת מכשירים מיוחדים וניתנת להתאמה בקלות ברוב הגדרות המעבדה. עם זאת, כדי להשיג תוצאה מוצלחת, מספר שלבים דורשים תשומת לב רבה. לאחר השגת גלגלי העיניים מהמקור, יש לשמור אותם בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס או על קרח ולעבד אותם בהקדם האפשרי. כאשר מנתחים את השפעת הטיפול, יש להשתמש בשני חצאים של אותה רשתית - מחצית אחת לאיתור שינויים אך ורק עקב פרוצדורות ניסיוניות (קו בסיס) והשנייה לאיתור השפעת הטיפול. גישה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

Bringhurst Meats (ברלין, ניו ג'רזי) זוכה להכרה על עזרתם האמיתית באספקת גלגלי העיניים של החזירים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
DMEMLife Technologies 11965-092
HBSSLife Technologies 14170-112
סוכרוזJ.T.Baker4072-05
היסטמין סיגמאH7125-1G
פניצילין-סטרפטומיצין Invitrogen
PFAמדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית15710
מדיה מקפיאה משולש מדעים ביו-רפואייםTFM-5
סרום עיזים רגיל RocklandD104-00-0050
Triton X-100SigmaT8787
GFAP נוגדןMilliporeAB5804
MAP2 נוגדןEMD MilliporeMAB3418
FITC מצומד חמור נגד ארנב IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.711-095-152
Cy3 מצומד חמור נגד עכבר IgGJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.715-165-150
מדיום הרכבה המכיל DAPIVector Laboratories, Inc.H-1200
מיקרוסקופ לייזר קונפוקליNikonEclipse Ti מיקרוסקופ
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות1.45 שניות

מקורות

  1. Cunha-Vaz, J., Bernardes, R., Lobo, C. Blood-retinal barrier. J Ophthalmol. 21, 3(2011).
  2. Kim, J. H., et al. Blood-neural barrier: intercellular communication at glio-vascular interface. J Biochem Molec Biol. 39, 339-345 (2006).
  3. Kumagai, A. K. Glucose transport in brain and retina: implications in the management and complications of diabetes. Diabetes Metab Res Rev. 15, 261-273 (1999).
  4. Runkle, E. A., Antonetti, D. A. The blood-retinal barrier: structure and functional significance. Methods Molec Biol. 686, Clifton, N.J. 133-148 (2011).
  5. Takata, K., Hirano, H., Kasahara, M. Transport of glucose across the blood-tissue barriers. Int Rev Cytol. 172, 1-53 (1997).
  6. Goncalves, A., Ambrosio, A. F., Fernandes, R. Regulation of claudins in blood-tissue barriers under physiological and pathological states. Tissue Barriers. 1, 24782(2013).
  7. Patton, N., et al. Retinal image analysis: concepts, applications and potential. Prog Ret Eye Res. 25, 99-127 (2006).
  8. Di Marco, L. Y., et al. Vascular dysfunction in the pathogenesis of Alzheimer's disease--A review of endothelium-mediated mechanisms and ensuing vicious circles. Neurobiol Dis. 82, 593-606 (2015).
  9. Nagele, R. G., et al. Brain-reactive autoantibodies prevalent in human sera increase intraneuronal amyloid-beta(1-42) deposition. J Alzheimer's Dis: JAD. 25, 605-622 (2011).
  10. Goldwaser, E., Acharya, N., Nagele, R. Cerebrovascular and blood-brain barrier compromise: A mechanistic link between vascular disease and Alzheimer's disease subtypes of neurocognitive disorders. J Parkinsons Dis Alzheimer's Dis. 2, 10(2015).
  11. Horton, N. G., et al. In vivo three-photon microscopy of subcortical structures within an intact mouse brain. Nat Photonics. 7, (2013).
  12. Sedeyn, J. C., et al. Histamine Induces Alzheimer's Disease-Like Blood Brain Barrier Breach and Local Cellular Responses in Mouse Brain Organotypic Cultures. Biomed Res Int. 2015, 937148(2015).
  13. Avdeef, A., Deli, M. A., Neuhaus, W. Blood-Brain Barrier in Drug Discovery: Optimizing Brain Exposure of CNS Drugs and Minimizing Brain Side Effects for Peripheral Drugs. Di, L., Kerns, E. H. , John Wiley & Sons, Inc. Ch. 10 188(2014).
  14. Eigenmann, D. E., et al. Comparative study of four immortalized human brain capillary endothelial cell lines, hCMEC/D3, hBMEC, TY10, and BB19, and optimization of culture conditions, for an in vitro blood-brain barrier model for drug permeability studies. Fluids Barriers CNS. 10, 33(2013).
  15. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  16. Alberghina, M., Lupo, G., Anfuso, C. D., Moro, F. Palmitate transport through the blood-retina and blood-brain barrier of rat visual system during aging. Neurosci Lett. 150, 17-20 (1993).
  17. Hosoya, K., Yamamoto, A., Akanuma, S., Tachikawa, M. Lipophilicity and transporter influence on blood-retinal barrier permeability: a comparison with blood-brain barrier permeability. Pharm Res. 27, 2715-2724 (2010).
  18. Minamizono, A., Tomi, M., Hosoya, K. Inhibition of dehydroascorbic acid transport across the rat blood-retinal and -brain barriers in experimental diabetes. Biol Pharm Bull. 29, 2148-2150 (2006).
  19. Serlin, Y., Levy, J., Shalev, H. Vascular pathology and blood-brain barrier disruption in cognitive and psychiatric complications of type 2 diabetes mellitus. Cardiovasc Psychiatry Neurol. 2011, 609202(2011).
  20. Kolb, H. How the retina works - Much of the construction of an image takes place in the retina itself through the use of specialized neural circuits. Am Sci. 91, 28-35 (2003).
  21. Ikram, M. K., Cheung, C. Y., Wong, T. Y., Chen, C. P. Retinal pathology as biomarker for cognitive impairment and Alzheimer's disease. J Neurol Neurosurgery Psychiatry. 83, 917-922 (2012).
  22. Tan, Z., Ge, J. Amyloid-beta, the retina, and mouse models of Alzheimer disease. Am J Pathol. 176, 2055(2010).
  23. Serhan, C. N. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature. 510, 92-101 (2014).
  24. Bucolo, C., et al. Effects of topical indomethacin, bromfenac and nepafenac on lipopolysaccharide-induced ocular inflammation. J Pharm Pharmacol. 66, 954-960 (2014).
  25. Edelman, J. L., Lutz, D., Castro, M. R. Corticosteroids inhibit VEGF-induced vascular leakage in a rabbit model of blood-retinal and blood-aqueous barrier breakdown. Exp Eye Res. 80, 249-258 (2005).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

A4IgGGFAPMAP2Ex Vivo
במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.