הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי

13.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54657

⸱

30 בנובמבר 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, The University of Chicago, 2Department of Radiation and Cellular Oncology and Ludwig Center for Metastasis Research, The University of Chicago

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

היכולת של שיבוטים גרורתיים ליישב אתרים מרוחקים תלויה ביכולת ההתפשטות שלהם ו/או ביכולתם לשרוד במיקרו-סביבה המארחת ללא התפשטות משמעותית. כאן, אנו מציגים מודל של בעלי חיים המאפשר הדמיה כמותית של שני סוגי ההתיישבות בכבד על ידי שיבוטים גרורתיים.

תקציר

חולים עם מספר מצומצם של גרורות בכבד ושיעורים איטיים של התקדמות יכולים להיות מטופלים בהצלחה עם טיפול מקומי גישות 1,2. עם זאת, מעט מאוד ידוע על ההטרוגניות של גרורות בכבד, ומודלים של בעלי החיים מסוגלים להעריך את ההתפתחות של מושבות גרורתי בודדות נדרשים. כאן, אנו מציגים מודל מתקדם של גרורות בכבד המספקות את היכולת לדמיין את ההתפתחות כמותית של שיבוטי גידול פרט בכבד להעריך קינטיקה הצמיחה ויעילות קולוניזציה שלהם. יצרנו פאנל של נגזרים monoclonal של תאי סרטן המעי הגס האנושי HCT116 שכותרתו ביציבות עם בלוציפראז ו tdTomato והחזקת נכסים צמיחה שונים. עם הזרקת טחול ואחריו כריתת טחול, רוב השיבוטים אלה מסוגלים ליצור גרורות בכבד, אבל עם תדרים שונים של קולוניזציה ושיעורי צמיחה שונה. באמצעות syste הדמיה in vivoמ '(IVIS), אפשר לחזות ולכמת פיתוח גרור עם זורח in vivo ו דימות פלואורסצנטי vivo לשעבר. בנוסף, טומוגרפיה ההדמיה המפוזרת פלורסנט (DLIT) מספקת הפצת 3D של גרורות בכבד in vivo. דימות פלואורסצנטי Ex vivo של כבדים שנקטפו מספקת מדידות כמותיות של מושבות גרורתי בכבד בודדת, המאפשרת להערכת תדירות קולוניזציה כבדה קינטיקה הצמיחה גרורות. מאז המודל דומה גרורות בכבד שנצפו קלינית, היא יכולה לשמש אופנות לאיתור גנים הקשורים גרורות בכבד לבדיקת טיפולים פולשני או אדג'ובנטי פוטנציאל מחלה גרורתית בכבד.

מבוא

חולים עם גרורות בכבד מסרטן מעי גס ראשוני (CRC) מאופיינים פרוגנוזה גרועה. שיעור ההישרדות לאחר 5 שנים עבור העיקרי nonmetastatic CRC (בשלבים I - III) מוערך 75 - 88% 3,4, בעוד חולים עם גרורות בכבד (בשלב IV) יש שיעור ההישרדות לאחר 5 שנים של רק 8 - 12% 5 , 6. עם זאת, חולים עם גרורות מייצגים קבוצה הטרוגנית, עם הצגת מספרים שונים של גרורות ושעות ישנות שונות. תצפיות קליניים הראו כי מספר גרורות (אשר עשוי להיות פרופורציונלי ליכולת או תדירות מיישבים של קולוניזציה) ואת הגודל של כל גרורה בודדת (ביחס ישר לשיעור הגידול המקומי) 1,7 גורמים פרוגנוסטיים בלתי תלויים. במילים אחרות, ההצלחה של שיבוטים גרורתי מיישבים את הכבד תלויה בשני מאפיינים עיקריים: היכולת שלהם לגדול יכולתם להפיץ ולשרוד במיקרו-סביבה של הכבד.

העיצובמודלים קליניים מוצלחים של עם היכולת של לכידה וכימותי המאפיינים של שיבוטים גרורתי יכול לשפר את הבנתנו דרסטי של ביולוגיה כבדה גרורה ולספק כולים יעילים על העיצוב של גישות טיפוליות פוטנציאליות. מודלים של גרורות בכבד ניסיוני דווחו בעבר 8,9, אבל אף אחד מהם לא סיפק את היכולת ללכוד כמותית לתאר תכונות של שיבוטים גרורתי הפרט הן in vivo ו vivo לשעבר.

כאן, אנו מציגים מודל חדש, מתקדם של גרורות בכבד הכוללת את הדור של שיבוטי גידול עם יעילות קולוניזציה הכבדה שונה ומאפיין צמיחה. העסקנו שילוב של תיוג כפול של תאים סרטניים עם בלוציפראז ו פלורסנט חלבון tdTomato עם הדור של שורות תאים חד שבטיים שיש הבדלים מהותיים בתוקף גרורתי. במודל ניסיוני זה, הנתונים מצביעים כי ההתפתחותגרורות בכבד יכול להיות מתואר במונחים של תדירות קולוניזציה זמן ההכפלה (TD), אשר עולה בקנה אחד עם תצפיות קליניות. אופי כמותי של מודל זה עושה את זה לאימוץ בקלות עבור גילוי סמים למטרות אבחון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הנהלים כל חיה אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש באוניברסיטת שיקגו (פרוטוקול # 72,213-09) ו להתבצע בתנאים סטריליים.

1. הכנות

  1. הפוך 500 מיליליטר של מדיום התרבות של תאים סרטניים HCT116: בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% עובריים שור סרום (FBS), 100 פניצילין U / mL, ו -100 מ"ג / mL סטרפטומיצין.
  2. החיטוי מכשיר לשמש מודל הזרקת הטחול, כולל 3 - 4 מגבות כירורגית, גזה, שני טנדרים קטנים Adson, נהגה מחט, שני זוגות מספריים, מהדק קטן, ו -3 microclips, ב 251 מעלות במשך 20 דקות .
  3. כן הרדמה לאחר ניתוח עבור העכברים שינוהלו תת עורית בעקבות הזרקת הטחול. לדלל 2 - 4 מיקרוגרם של עצירות ב 500 μL של 0.9 מלח רגיל לכל עכבר.
  4. הכן aliquots של 150 מיקרוגרם / 150 μL של luciferin גחלילית עבור זריקות intraperitoneal during מבחני פליטת האור. חנות ב -20 ° C ולהגן מפני אור.

הדור 2. של בלוציפראז / שורות תאים חד-שבטיים tdTomato שכותרתו 10,11

  1. ההפשרה ולשמור בתאי סרטן המעי הגס האנושי HCT116 ו 293FT בתאי כליה עובריים אנושיים DMEM עם 10% FBS, 100 U / mL פניצילין, ו -100 מ"ג / mL סטרפטומיצין. לשמור בתרבות ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס.
  2. לייצר lentivirus גבוהה כייל.
    1. ביום ד '1, צלחת 10 - 12 x 10 6 293FT תאים בין מעבר 3 ו -10 במנות תרבית תאים 15 ס"מ 18 מ"ל של DMEM מלאה (cDMEM) עם 10% FBS, 1% פניצילין / סטרפטומיצין, ו -1% חומצות אמינו חיוניות . לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
    2. ביום ד '2, transfect התאים באמצעות פתרון transfection הבאים:
      1. עבור כל מנה, השתמש בנוסחה הבאה: תערובת DNA של 37.5 מיקרוגרם של וקטור lentiviral pFUG מוכנס עם בלוציפראז (Luc2) ו tdTomatoבונה 11 (מתנה ד"ר ג'פרי גרין באוניברסיטת שיקגו), 25 מיקרוגרם של pCMVΔ8.74, ו -12.5 מיקרוגרם של pMD2.G resuspended בסך של 1,062 μL של H סטרילי 2 O. להוסיף 188 μL של 2 M CaCl 2.
      2. להוסיף 1,250 μL של 2x Hepes שנאגרו מלוחים (HBS, 50 מ"מ Hepes, 1.5 מ"מ Na 2 HPO 4, ו -180 מ"מ NaCl, pH 7.12) לפתרון ה- DNA / CaCl 2, ירידה בכל פעם, תוך פיצוץ בועות דרך פתרון עם טפטפת.
      3. לדגור על RT במשך 20 דקות, ולאחר מכן להוסיף 15.5 מ"ל של RT cDMEM ו chloroquine לעשות לריכוז סופי של 25 מיקרומטר.
    3. לשאוב את התקשורת בכל צלחת של 293FT תאים ולהחליף עם פתרון transfection. להוסיף 16 מ"ל של הפתרון transfection לאט, כמו התאים מצופה לסלק בקלות.
    4. ביום ד '3, לאחר 8 - 16 שעות, להסיר את פתרון transfection ולשטוף את התאים פעם עם פוספט שנאגר המלוח של Dulbecco (DPBS), שוב טאקיng אכפת שלא לעקור את התאים. החלף את המדיה עם 18 מ"ל של cDMEM טרי עם 10 מ"מ Hepes.
      הערה: זז לאט מנות, לשאוב את פתרון transfection, ולהוסיף את התקשורת דרך הדפנות של צלחות כדי לא לסלק את התאים.
    5. ביום ד '4, 48 שעות מרגע של transfection, לאסוף את התקשורת בין המנות ידי aspirating לאט עם טפטפת כדי לא לסלק את התאים. צנטריפוגה התקשורת שנאספה ב XG 300 במשך 5 דקות כדי לזרז את פסולת תא הגדולה.
    6. סנן את supernatant ויראלי באמצעות בקבוק מסנן 0.45 מיקרומטר נמוך חלבון מחייב צנטריפוגות באמצעות הרוטור SW-28 עבור 2 שעות על 50,000 XG ו -4 מעלות צלזיוס. למזוג supernatant מיד לאחר סיום צנטריפוגה ולייבש את פנים הצינור עם המגבים.
    7. Resuspend גלולה ויראלי 50 μL של בינוני סרום מופחת (RSM) עם 1% FBS. ניתן לאחסן aliquots ב -80 ° C לשימוש עתידי (המניה ויראלי).
  3. Transduce lentiviruses לתוך התאים HCT116 וליצור פאנל של שיבוטים tdTomato חיובי.
    1. פלייט התאים HCT116 בצפיפות של 1 x 10 5 ב 24 צלחות היטב 1 ד לפני זיהום ויראלי.
    2. לדלל 40 μL של וירוס מושעים (מ 2.2.7) ב 4 מ"ל של RSM (דילול 1: 100) עם 1% פניצילין / סטרפטומיצין ו -8 מיקרוגרם / מ"ל ​​polybrene (cRSM).
    3. ביום של זיהום, לשטוף את התאים פעם עם DPBS, ולאחר מכן להוסיף 250 μL של וירוס בדילול משלב 2.3.2 היטב כל אחד. דגירה של 4 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של cDMEM היטב כל; לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 48 - 72 שעות.
    4. Resuspend התאים עם 1 מ"ל של טריפסין 0.05% ו 0.53 מ"מ EDTA, ולאחר מכן להוסיף 1 מ"ל של cDMEM לנטרל את טריפסין. מעבירים את התאים לצינור microcentrifuge ו גלולה ב 300 XG למשך 4 דקות. שטפו את 3x גלולה ב 1 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן "הנקס (HBSS) בתוספת 2% FBS.
    5. Resuspend גלולה משלב 2.3.4עם חיץ FACS (FBCs 2% ו 2 מ"מ EDTA ב PBS) לתוך ההשעיה תא בודד של 1 x 10 6 תאים / מ"ל.
    6. מיין תאי tdTomato החיוב HCT116 באמצעות סדרן תא, gating עבור תאי PE-חיובי (עירור / פליטה: 556/585 ננומטר). לגדל את התאים שנאספו בצלחת 10 סנטימטרים ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס לייצר תאי HCT116 tdTomato החיובי הוריים (איור 1 א).
    7. Resuspend התאים HCT116 הורית חיובית-tdTomato מ 2.3.6 עם 8 מ"ל של טריפסין 0.05% ו 0.53 מ"מ EDTA במשך 3 - 5 דקות, ולאחר מכן להוסיף 8 מ"ל של cDMEM לנטרל את טריפסין.
      1. מעבירים את התאים לצינור גלולה 50 מ"ל ב 300 XG למשך 4 דקות. הסר את supernatant לדלל את התאים ההוריים tdTomato החיוב HCT116 עד 1 תא לכל 200 μL ב cDMEM (האיור 1B).
    8. פלייט תא בודד (200 μL של דילול) לכל היטב צלחת 96-גם ב 5% CO 2 ו -37 ° C (איור 1 ג).
    9. לגדול monoclones פרט צלוחיות ב 5% CO 2 ו -37 מעלות צלזיוס. (איור 1D).

כיול 3. עוצמת אות פלורסנט כפונקציה של מספר הסלולרי

  1. פלייט התאים HCT116 טרנספקציה, עכשיו המכונה HCT116-L2T, בצפיפות של 0, 10 3, 2 x 10 4, 3 x 10 5, 5 x 10 4, 7 x 10 4, 9 x 10 4, ו -10 5 תאים / גם ב 96 צלחות היטב triplicates עבור כל צפיפות.
  2. אחרי 5 שעות של דגירה, לכמת את עוצמות פלורסנט tdTomato באמצעות 10 IVIS.
    1. הקש על סמל תוכנת תמונה על שולחן העבודה כדי להפעיל את התוכנה. לחץ על הכפתור "אתחול" כדי לאתחל את מערכת ההדמיה. לאחר מסיים אתחול (אשר לוקח בערך כמה דקות), בחר "הקרינה", "4 השני" זמן החשיפה, "בינוני" binning, "2" F / stop, "535" מסנן עירור,ו "580" מסנן פליטה.
    2. מניח 96 את הצלחת היטב על תחנת ההדמיה ולחץ על "רוכש" להתחיל הדמיה. לאחר צילום התמונה רכשה, לחץ על "כלי ROI" בלוח הכלי ובחרת 12 x 8 מסמל החריץ.
    3. צור 12 x 8 חריצים כדי לכסות את האזור של אות על התמונה של 96 את הצלחת היטב ולחץ על הכרטיסייה המדידה. שימו חלון עם שולחן של מדידות ROI עם יחידות של פוטונים לכל s לכל סטרדיאן לס"מ מרובע (פוטונים / s / sr / 2 ס"מ).
  3. לבנות scatterplot עם (ציר X) טיעון שווה למספר של תאים והפונקציה (ציר Y) מייצג עוצמת אות. חישוב עקום רגרסיה באמצעות תוכנת ניתוח נתונים כדי לחשב את כמות תאים המתאימים ליחידה של עוצמת פלורסנט (איור 2) 10.

4. במודל חיה של גרורות בכבד

  1. ברגע שתאי-L2T HCT116 להגיע 70- 80% confluency, להכין אותם כ 1 שעות לפני זריקת הטחול. לנתק את התאים באמצעות 0.05% טריפסין ב 0.53 מ"מ EDTA במשך 3 - 5 דקות, ולאחר מכן לנטרל אותם עם כמות שווה של cDMEM. הקפד פיפטה ביסודיות כדי למנוע clumping.
  2. ספירת התאים עם דלפק תא אוטומטי.
  3. Resuspend התאים 1x DPBS לריכוז של 1.2 - 2 x 10 6 תאים / 100 μL. הקפד פיפטה ו resuspend התאים ביסודיות כדי למנוע clumping.
  4. שמור את התאים על הקרח עד ההזרקה, מדי פעם resuspending אותם בצינור.
  5. לפני הרדמה עכברים, לספק הרדמה לפני ואחרי בולוס נוזלים על ידי תת עורית הזרקת 500 μL של התערובת עצירות כמתואר בשלב 1.3. נהל באותו מינון של תערובת עצירות נוספות פעמיים ביום עד סימנים של כאב (ניידות מופחתת, קומתו שפופה, אי החתן, הניקוד כאשר טיפל) פתרו.
  6. להרדים 6- עד 8 שבועותעכברים בעירום athymic נקבה -old עם 2% isoflurane חמצן בתא הרדמה. ודאו העכברים הם לחלוטין בהרדמה ידי צובט את הזנב. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה. העבר כל עכבר הרדים אל חרטומו בודד עבור הזרקת הטחול. לפני החתך, כל עכבר צריך להיות מכוסה וילון ניתוח סטרילי.
  7. זהה את הטחול כאזור סגול לראות חיצוני דרך העור בכנף שמאל של עכברים בעירום. בעזרת מספריים microdissection, עושים חתך בכנף שמאל 8 מ"מ על העור מעל הטחול.
    1. לאחר מכן, להרים על דופן הבטן ולעשות חתך קטן. אפשר אוויר לתוך חלל הבטן, כך האיברים הפנימיים להתרחק מאתר החתך. להגדלת החתך בדופן הבטן בכ -5 מ"מ.
    2. לחשוף את הטחול על ידי הפעלת לחץ בעדינות סביב החתך עם מקלון צמר גפן. במידת הצורך, שומן הלבלב יכול להיות בעדינות גברipulated לעזור עם חשיפה כדי לא לפצוע את הטחול.
  8. לאט לאט להזריק 100 μL של תאים באמצעות מזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G לתוך קצה של הטחול חשוף. להזריק לאט, על פני תקופה של לפחות 30 - 60 s, כדי למנוע גידולים במיוחד כבדים.
  9. מניחים microclip על הטחול לפני הסרת המחט בסוף הזריקה כדי למנוע דליפה של ההשעיה התא שהוחדר.
  10. השאירו את microclip במקום למשך 5 דקות.
  11. 5 דקות postinjection, לבצע כריתת טחול באמצעות מכשיר כוויית כף יד עבור המוסטאסיס. לנתח את hilum הטחול, החל מהצד הקדמי. כאשר מנתחי כלי גדול, טרום להקריש בצד הפרוקסימלי של הכלי עם רקמת שומן סמוכה, באמצעות כווייה כדי למנוע דימום יתר.
    הערה: שיטות המוסטאסיס: להקריש את נקודת דימום ישירות עם כויה, להפעיל לחץ עד כדי דימום במשך 3 - 5 דקות, או תפר-ולקשור את נקודת דימום עם עניבת משי 5-0.
  12. סגירת חתך אגפו של כל עכבר בשתי שכבות. ראשית, לסגור את דופן הבטן עם תפר קלוע 5-0 נספגים (למשל, vicryl) ב תפר אופקי יחיד. לאחר מכן, לסגור את העור באמצעות תפר monofilament nonabsorbable 4-0 (למשל, prolene), שוב עם תפר אופקי יחיד.
  13. יש לנקות את כל המכשירים על ידי ריסוס isopropanol 70% כדי לשמור על תנאים סטריליים בין כל הליך.
    הערה: ודא החיות הם חממו בזמן שהם ערים מן ההרדמה. ניטור כל העכברים שלאחר הניתוח עד שהם הופכים אמבולטורי לחזור לפעילות רגילה. בדרך כלל, זמן ההחלמה הוא כ 3 - 5 דקות. אין להשאיר חיות ללא השגחה עד שהם להכרתו מספיק כדי לשמור שכיבה sternal. אל תחזרו בעל חיים אשר עבר ניתוח לחברה של בעלי חיים אחרים עד שהוא התאושש לחלוטין.

5. הדמיה Bioluminescent Vivo

  1. בצע הדמיה עלבסיס שבועי כדי למדוד ולכמת שינויי פליטת אור לאורך זמן.
  2. מניחים עכברים בתא הרדמה להרדים אותם עם 2% isoflurane חמצן. ודאו העכברים הם לחלוטין בהרדמה ידי צובט את הזנבות. השתמש במשחת וטרינר על העיניים כדי למנוע יובש לאחר הרדמה.
  3. לאחר מכן, intraperitoneally להזריק כל עכבר עם 150 μL של preprepared גחלילית luciferin משלב 1.4.
  4. מניח את העכברים בתוך IVIS עם קונוסים אף פרט מתן isoflurane. מניח את העכברים במצב שכיבה עם מפרידים בין למזער את האות לעכברים סמוכים. לכל היותר חמישה עכברים עשויים להיות צלמו בבת אחת.
  5. למדוד ולנתח עוצמות bioluminescent 3 דקות לאחר ההזרקה luciferin.
    1. לאחר אתחול IVIS כמתואר בשלב 3.2.1, בחר "פלורסנט", "1 השני" זמן החשיפה, "בינוני" binning.
    2. לחצו על כפתור "לרכוש" להתחיל imaginז. הקפד לבצע כל הדמיה בכל פעם עקבית (3 דקות) לאחר הזרקת luciferin.
    3. לאחר צילום התמונה רכשה, חלון תמונת לוח הכלי יופיע. לחץ על "כלי ROI" ובחר "1", "2", "3", "4", או "5" מהסמל המעגל, מתאים למספר של עכברים צלמו.
    4. כדי להגדיר אזורים של עניין (ROIs), להקיף את האות לאזור של האות זורח בתוך חלל הבטן של העכבר, ולאחר מכן לחץ על "מדידות" של ROI כיחידה שרירותית של יעילות קורן ((פוטונים / s / ס"מ 2 / סטרדיאן) / (μW / ס"מ 2)). ודא שיש מעגל ROI נוסף של הרקע.
  6. בארבעה שבועות לאחר הזרקה ולפני להקריב בעלי חיים, לבצע המפוזרת פלורסנט ההדמיה טומוגרפיה (DLIT) באמצעות IVIS להעריך את ניטל הגידול והפצה באמצעות שחזור 3D בזמן אמת של עוצמות bioluminescent של מושבות גידול פרט.
    1. להרדים את העכברים ולהזריק luciferin, כמתואר בשלב 5.2.4. DLIT מבוצע על עכבר אחד בכל פעם.
    2. לאחר אתחול IVIS, כמתואר בשלב 3.2.1, בחר "אשף הדמיה", "פליטת אור", ולחץ על "הבא". בחר "DLIT" ולחץ על "הבא". בחר בדיקות "Firefly" ולחץ על "הבא". "העכבר" בחר נושא התמונה, "אוטומטי" פרמטר חשיפה, "C-13 ס"מ" שדה הראייה, ו "0.5 ס"מ" גובה נושא, ולחץ על "הבא". לחץ על כפתור "לרכוש" להתחיל הדמיה.
    3. לאחר צילום התמונה רכשה, בחר את כרטיסיית "DLIT 3D Reconstruction" ואת הכרטיסייה "לנתח" ולחץ על "בנייה מחדש" על מנת ליצור את תמונת שחזור 3D.
    4. לחץ על "כלים" ו "אנימצית 3D". בחר "CCW ספין על ציר Y" בחלון 3D אנימציה. לחץ על "שיא" ואת "שמור" לקובץ בפורמט mov.

6. הדמיה פלורסנט גופיים

  1. להקריב את העכברים על ידי נקע בצוואר הרחם בזמן מורדם, או בהתאם להנחיות מוסדיים ב 4 - 6 שבועות לאחר זריקות הטחול.
  2. קציר את הכבד. ביצוע חתך אופקי מהשמאל כדי כנף ימנית. הוא תפס את תהליך xiphoid עם טנדר, לנתח את falciform, וריד הכבד, ואת הווריד הנבוב נחות.
    1. לנתח את הרצועה התקינה hepatorenal, רצועת hepatoduodenal, ואת רצועת hepatorenal עזב, נזהר שלא לפגוע באונת caudate תוך ביתור רצועת hepatoduodenal. לאחר קצירת הכבד, להסיר את כיס המרה, כמו זה יציג autofluorescence. רשום לעצמך כל גידולים חוץ כבד נוסף נוכחיים.
  3. לרשום את המספרים והגדלים של גידולי כבד נוכחי macroscopically, ולמקם את הכבדים שנקטפו DPBS.
    הערה: גידולים גלויים macroscopically לעין בלתי מזוינתכמו גידולים לבנים (עבור דוגמא מייצגת, ראה איור 4).
  4. לפני מיקום על סדין ההדמיה, לקחת כל כבד בעדינות להסיר עודפי נוזלים על ידי סופג על מגבת נייר.
  5. מדוד את עוצמות ניאון מכל מושבת גידול באמצעות IVIS.
    1. בחר "קרינה", זמן חשיפה "4 שניות", binning "הבינוני", "2" F / stop, "535" מסנן עירור, ו "580" מסנן פליטה. לחץ על כפתור "לרכוש" להתחיל הדמיה.
    2. לאחר שרכש את התמונה, לאתר את חלון תמונת צבעי כלי. לחץ על "כלי ROI" ובחר "1" מהסמל המעגל. כדי להגדיר ROIs, להקיף את האזור אות של מושבות הגידול הפרט על התמונה, ולאחר מכן לחץ על "מדידות" של ROI כיחידה שרירותית של יעילות קורן ((פוטונים / s / ס"מ 2 / סטרדיאן) / (μW / ס"מ 2) ). ודא שיש מעגל ROI נוסף של הרקע.
  6. חשב את נפח הגידול הכולל ידי בהנחה שזה יהיה כדור. נפח הגידול = 4 x π xr 3/3 (r = רדיוס). לחשב את החלק היחסי של תאי מושבה להרכיב גידול (FC) כמספר גידולים בכבדים מחולק במספר התאים המוזרק splenically.
  7. לחשב את המספר הסלולרי הכולל לכל מושבה (= X) מן הקירוב לינארי משלב 3.3. חשב את מספר חלוקות תא (= Y) כמו Y = להיכנס X 2 ואת td כמו Td (יום) = 28 / י

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

מטרת ניסוי זה הייתה לבסס מודל חיה עקבי לשחזור בקלות עם פוטנציאל הכימות הסידורי של ניטל הגידול גרורתי in vivo ו לאמידת התדירות הקולוניאליסטית קינטיקה צמיחה לפתח גרורות בכבד. איורי 2-6, עם אגדות, ניתנים מתוך הפרסום הקודם שלנו תחת רישיון Creative Commons CC-BY 10.

הדור של Monoclones תאים סרטניים פעמיים שכותרתו

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המודל החי שהוצג בדוח הנוכחי מבוסס על שתי גישות עיקריות. ראשית, על מנת להבטיח את היכולת להתבונן שיבוטים גרורתי עם נטיות שונות ליישב מתרבים בכבד, פאנל של שורות תאים חד שבטיים הטרוגנית מאוד הוקמה, ולא קו תאים סרטניים unfractionated הוקמה 12,13. הגישה monoclonal להתפתחות גרורות מוצדקת על ידי הנתונים הגנומי האחרונות 14 ושימש בהצלחה בעבר מודל 10,15,16 תהליך גרורתי. שנית, פעמי תיוג של הקו הסלולרי ההורי על ידי סמנים בלוציפראז ו tdTomato התאגד על מנת לספק נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

ברצוננו להודות לד"ר ג'פרי ל גרין (אוניברסיטת שיקגו) עבור פלסמיד Luc2-tdTomato ואת שורת תאים HCT116, מר Ani Solanki (מרכז משאבים בעלי חיים) לניהול עכברים, וד"ר לארה לאוני על הסיוע עם DLIT. Quantifications בעוצמות פלורסנט ושקוף למחצה בוצעו משאבים מחקר הדמיה בעלי חיים קטנים משולב באוניברסיטת שיקגו על ספקטרום IVIS (PerkinElmer, Hopkinton, MA). עבודה זו נתמכה על ידי וירג'יניה ו DK לודוויג קרן לחקר הסרטן, קרן המחקר לסרטן ריאות (LCRF), קרן סרטן הערמונית (PCF), ואת גרנט תמיכה במרכז לחקר הסרטן (P30CA014599). המממנים לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים וניתוח, ההחלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
IVIS Spectrum In Vivo מערכת הדמיהקליפר מדעי החיים124262In Vivo מערכת הדמיה
LivingImage 4.0 תוכנתהדמיה קליפר 128165 מדעי החייםמכונת הרדמה
מחקרית VAD-MGXמכונת הרדמה אינהלציהVETAMACVAD-MGX
DMEMGibco11965-118ריאגנטים לתרבית תאים
DPBSGibco14190250ריאגנטים לתרבית תאים
פניצילין/סטרפטומיצין, נוזל (10,000 יחידות פניצילין; 10,000 μ g סטרפטומיצין)Invitrogen15140163ריאגנטים לתרבית תאים
HBSSThermoFisher24020117ריאגנטים לתרבית תאים
הזרקת בופרנקס (0.3 מ"ג/מ"ל)רקיט בנקיזר הלת'קר בע"מ12496-0757-5בופרנורפין הידרוכלוריד
Gemini Cautery SystemBraintree ScientificGEM 5917צריבה ידנית לכריתת טחול
מיקרו קליפ; ישר; לחץ של 70 גרם; רוחב קליפ 1.5 מ"מ; מכשיר כירורגי Roboz באורך לסת 10 מ"מRS-5426Hemoclip: מכשירי המוסטזיס לאחר הזרקת טחול
D-luciferin, מלח אשלגןGoldbio TechnologyLUCK-1Gמלח אשלגן לוציפרין
Opti-MEM I סרום מופחתבינוני Gibco31985062סרום מופחת בינוני
TC20 מונה תאים אוטומטיBIO-RAD1450102מונה תאים אוטומטי
תוכנת JMP10 תוכנת ניתוח נתוניםמכון
SAS BD FACSAria II סדרן תאיםBD Biocsiencesסדרן תאים
של

מקורות

  1. Fong, Y., Fortner, J., Sun, R. L., Brennan, M. F., Blumgart, L. H. Clinical score for predicting recurrence after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: analysis of 1001 consecutive cases. Ann. Surg. 230 (3), 309-318 (1999).
  2. Pawlik, T. M., et al. Effect of surgical margin status on survival and site of recurrence after hepatic resection for colorectal metastases. Ann. Surg. 241 (5), 715-722 (2005).
  3. Park, J. H., Watt, D. G., Roxburgh, C. S., Horgan, P. G., McMillan, D. C. Colorectal Cancer, Systemic Inflammation, and Outcome: Staging the Tumor and Staging the Host. Ann. Surg. 263 (2), 326-336 (2016).
  4. Veen, T., et al. Long-Term Follow-Up and Survivorship After Completing Systematic Surveillance in Stage I-III Colorectal Cancer: Who Is Still at Risk. J. Gastrointest. Cancer. 46 (3), 259-266 (2015).
  5. Siegel, R., et al. Cancer treatment and survivorship statistics. CA Cancer J. Clin. 62 (2), 220-241 (2012).
  6. O'Connell, J. B., Maggard, M. A., Ko, C. Y. Colon cancer survival rates with the new American Joint Committee on Cancer sixth edition staging. J. Natl. Cancer Inst. 96 (19), 1420-1425 (2004).
  7. House, M. G., et al. Survival after hepatic resection for metastatic colorectal cancer: trends in outcomes for 1,600 patients during two decades at a single institution. J. Am. Coll. Surg. 210 (5), 744-752 (2010).
  8. Smakman, N., Martens, A., Kranenburg, O., Borel Rinkes, I. H. Validation of bioluminescence imaging of colorectal liver metastases in the mouse. J. Surg. Res. 122 (2), 225-230 (2004).
  9. Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J. Vis. Exp. (41), (2010).
  10. Oshima, G., et al. Imaging of tumor clones with differential liver colonization. Sci. Rep. 5 (10946), (2015).
  11. Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
  12. Wang, X. M., et al. Integrative analyses identify osteopontin, LAMB3 and ITGB1 as critical pro-metastatic genes for lung cancer. PLoS One. 8 (2), e55714(2013).
  13. Fidler, I. J., Kripke, M. L. Metastasis results from preexisting variant cells within a malignant tumor. Science. 197 (4306), 893-895 (1977).
  14. Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).
  15. Khodarev, N. N., et al. STAT1 pathway mediates amplification of metastatic potential and resistance to therapy. PLoS One. 4 (6), e5821(2009).
  16. Langley, R. R., Fidler, I. J. Tumor cell-organ microenvironment interactions in the pathogenesis of cancer metastasis. Endocr. Rev. 28 (3), 297-321 (2007).
  17. Lussier, Y. A., et al. Oligo- and polymetastatic progression in lung metastasis(es) patients is associated with specific microRNAs. PLoS One. 7 (12), e50141(2012).
  18. Lussier, Y. A., et al. MicroRNA expression characterizes oligometastasis(es). PLoS One. 6 (12), e28650(2011).
  19. Calon, A., et al. Dependency of colorectal cancer on a TGF-beta-driven program in stromal cells for metastasis initiation. Cancer Cell. 22 (5), 571-584 (2012).
  20. Vanharanta, S., Massague, J. Origins of metastatic traits. Cancer Cell. 24 (4), 410-421 (2013).
  21. Khodarev, N. N., Roizman, B., Weichselbaum, R. R. Molecular pathways: Interferon/Stat1 Pathway: Role in the tumor resistance to genotoxic stress and aggressive growth. Clin. Cancer Res. 18 (11), 3015-3021 (2012).
  22. Li, C., et al. Interferon-stimulated gene 15 (ISG15) is a trigger for tumorigenesis and metastasis of hepatocellular carcinoma. Oncotarget. 5 (18), 8429-8441 (2014).
  23. Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. Am. J. Pathol. 170 (3), 1077-1085 (2007).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J. Vis. Exp. (10), (2007).
  25. Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J. Vis. Exp. (27), e51677(2014).
  26. Evans, J. P., et al. From mice to men: Murine models of colorectal cancer for use in translational research. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 98, 94-105 (2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

IVISHCT116
מתקדם במודל חיה של גרורה גסה בכבד: טכניקות הדמיה ונכסים של משובטים גרורתי
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.