מאמר שיטה

נוהל מכני פשוט ליצור מחסור בתאי גזע limbal עכבר

DOI:

10.3791/54658

⸱

17 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Illinois at Chicago

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכתבה הבאה מספקת טכניקה קלה, לשחזור כדי ליצור מודל עכבר קיימא ביעילות של מחסור בתאי גזע limbal (LSCD). במודל חיה זו שימושית בבדיקת והשוואת יעילותם של טיפולים למחלות תאי גזע limbal.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחסור בתאי גזע limbal (LSCD) היא מצב של תקלה או אובדן של תאי גזע אפיתל limbal, שלאחריו אפיתל הקרנית מוחלף לחמית. חולים סובלים מפגמים קרניים חוזרים, כאבים, דלקות, ואובדן הראייה.

בעבר, מודל Murine של LSCD תואר ולעומת שני מודלים אחרים. המטרה הייתה לייצר מודל עכבר עקבי של LSCD ששני מחק את הפנוטיפ בבני אדם ובבעלי נמשך מספיק זמן כדי לעשות את זה ניתן ללמוד בפתופיזיולוגיה המחלה ולהעריך טיפולים חדשים. כאן, הטכניקה מתוארת בפירוט רב יותר.

כלי ממונע עם בר מסתובב תוכנן כדי להסיר את הטבעות החלודות מפני השטח של הקרנית או להחליק מיטת pterygium בחולים. זהו מכשיר מתאים כדי ליצור את מודל LSCD הרצוי. זהו כולים זמינים, קלים לשימוש במחט דקה זה עושה את זה מתאים לעבודה על עיניים קטנות, כמובעכברים. המריחה שלו מונעת טראומה מיותרת לעין וזה לא לגרום פציעות לא רצויות, כמו שקורה לעתים קרובות עם מודלי פציעה כימית. בניגוד מגרד בוטה, הוא מסיר את האפיתל עם קרום המרתף. בפרוטוקול זה, באזור לימבלית היה משופשף פעמים, ולאחר מכן האפיתל של הקרנית כולה ומהוקצע לימבוס כדי לימבוס. כדי למנוע פציעה stroma, טיפול נלקח לא להבריש את פני הקרנית פעם האפיתל היה כבר הוסרו.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אפיתל הקרנית נדרשים בכדי לשמור על בהירות ושלמות של הקרנית. זה מתחדש כל הזמן לאורך כל החיים על ידי תאי גזע אפיתל המתגוררים לימבוס-אזור צר בצומת של הקרנית ואת לחמית. עצמי לחידוש אלה תאי גזע limbal לשחק תפקיד מכריע התחדשות אפיתל הקרנית, הוא בדרך כלל ואחרי פציעה. דלדול חלקי או מלא של תאי גזע אלה יגרום ארוזיות בקרנית חוזרת, כאב, הצטלקות קרנית נאווסקולריזציה, מראה של תאי גביע, אם אינו מטופל, עיוורון קרני. מצב זה ידוע בתור חסר בתאי גזע limbal (LSCD) ויכול להיות אידיופטית; תוֹרַשְׁתִי; או נרכש עקב פציעות כימיות או תרמית, עדשות מגע לטווח ארוכות ללבוש, וכרוני דלקת 1-6.

מחקר על LSCD דורש מודל בעל חיים מתאים לו שלא רק מחקה את המחלה בבני אדם, אך ניתן לשחזור ובת קיימא, עם לפחותהר של פגיעה במבנים קרניים של עין אחרות. מודל זה יש צורך להעריך טיפולים ולהבהיר את מנגנוני המחלה ברמות מולקולרית תאית. כפי שתואר קודם לכן 1, עם השימוש של בר מסתובב, אפשר בקלות לפתח מודל עכבר של LSCD כי תכונות היתרונות הנ"ל נמשך לפחות שלושה חודשים. מטרת מחקר זה היא להציג מודל עכבר פשוט, לשחזור, ובר-קיימא של LSCD.

נהמתם מסתובבת הוא כלי שימושי זה שווה מסיר האפיתל מבלי לפצוע את stroma הבסיסית 1. זה כבר נעשה שימוש כדי לגרום לשחיקה קרנית מרכזית 7, 8 במחקרי ריפוי פצע. הטכניקה-המובאת כאן ליצור LSCD בעכבר טרם דווחה בעבר. בעבר הציג שיטות של גירוד האפיתל עם תוצאה מרית בוטה במדי פחות פציעה-במיוחד בבית לימבוס-ו פנוטיפ 1 משתנה יותר, 9, עם o שיקום יותררגיל ו קרני אפיתל 1. בניגוד המגרד הבוטה, הזמזום מסתובב מסיר את הקרום במרתף אפיתל כמו גם 7, 8, 10. שיטות דיווח אחרות לניתק תאי גזע לערב את השימוש בכימיקלים, כגון סודיום הידרוקסיד, n-heptanol, ו בנזלקוניום כלוריד, אשר לא רק יכול לגרום לפגיעה בלתי רצויה למבני עין בסיסיים, אלא גם עלול להוביל לדלקת משמעותית עכירות בקרנית לאחר או מטפלזיה קשקשית אפיתל 11-15. נהמתם מסתובבת אינה משויכת סיבוכים חמורים אלה. בניתוח הסרת האפיתל לימבלית, לבד או עם השימוש בכימיקלים 10, 11, 16, הוא יותר קשה לביצוע הוא לא האפשרות הטובה ביותר בחיות בעיניים קטנות epithelia לימבלית דק (כמו עכברים). בנוסף, באופן מפתיע, limbectomy עדיין עשוי להשאיר חלק האפיתל לימבלית מאחורי 10.

הטכניקה המתוארת להלן תגרום LSCD עם נאווסקולריזציהד conjunctivalization המחקה את הצגת LSCD המלא בחולים ונמשך לפחות 1 שלושה חודשים. היא מתאימה למי שואף ללמוד LSCD או פתופיזיולוגיה ריפוי פצעים, אימונולוגיה, וטיפולים פוטנציאל בעכברים. ואולי, עם כמה שינויים, הליך זה יכול להתבצע אצל חולדות או ארנבות 10. כמו הבר מסתובב ביעילות מסיר את האפיתל, זה יכול להיות מנוצל בכל מחקר הנוגע שחיקה אפיתל קרנית / פציעה ובכל טיפול קשור או מחקרים בביולוגיה מולקולריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל הניתוחים שבוצעו על בעלי חיים לציית האגודה למחקר בדוחות חזון עיניים לשימוש בבעלי חיים במחקר חזון. ארבע עשרה ארבע עד שישה חודשים בן זכר / נקבה C57BL / 6J סוג בר שימשו: עשר עכברים עבור דגם פציעה וארבעה כחיות מלאה (קרניות unwounded).

1. הכנת בעלי חיים

  1. להרדים עכבר עם זריקה intraperitoneal של 100 מ"ג / ק"ג קטמין תערובת 5 מ"ג / ק"ג xylazine. לאחר ההרדמה נקטה השפעה, לצבוט את בוהן כדי לאשר את עומק ההרדמה; החיה לא צריכה להגיב.
  2. בדוק את העין תחת מנורת סדק לפני ביצוע הניסויים כדי לוודא עדר כל פגיעה בקרנית קודמת.
  3. להחדיר טיפת hydrochloride tetracaine 1% אל מעל העין. לאחר 60 - 90 שניות, לבדוק את רפלקס הקרנית כדי לאשר את עדר התחושה. 0.5% hydrochloride Proparacaine יכול לשמש במקום.
  4. כאשר אובדן התחושה קרנית הואמסוימים, במקום ירידה של 5% povidone יוד על העין ועל השיער סביב העין בעדינות. תמחק את הירידה לאחר 1 דקות או למרוח אותו על השיער סביב העין כדי למנוע את השיער מלהתערב עם קצה הכלי.

2. כלי ליטוש האפיתל של הקרנית

  1. יש להשתמש בכפפות כירורגית גלימה. הכן את הכלים הנדרשים: גרגור מסתובב סטרילית פינצטה סטרילית. עבור שליטה טובה יותר, להשתמש בפינצטה מכופף. מניחים את הכלים על גיליון סטרילי במהלך ההליך.
  2. באמצעות פינצטה הכפוף, לייצב את העין על ידי גרירה של העפעפיים מצד האף בעדינות proptosing העין. הימנע משימוש יותר מדי לחץ.
  3. תחת מיקרוסקופ כירורגי, לגלח 360 ° מסביב לאזור לימבלית פעמיים באמצעות בר מסתובב סטרילי. לך סביב לימבוס עם מהירות של 5 - 6 שניות לכל סיבוב.
    הערה: יש הבר מהירות אחת קבועה. עם זאת, עבור זה כדי לסובב במהירות הוקמה, "אגוז הסוף" יש להדק לחלוטין.
  4. הסר את אפיתל הקרנית כולה מן לימבוס כדי לימבוס עם בר מסתובב. לקבלת תוצאות טובות יותר, להזיז את הכלי בצורה מעגלית והחזק אותו במקצת במקביל פני הקרנית לעבוד עם הצד הלטרלי של קצהו. יש להיזהר שלא לפגוע stroma ידי לא מחדש צחצוח באזורים שבהם האפיתל כבר הוסר. אין ליישם את כל לחץ על העין. נקה את קצה המברשת כנדרש.
  5. להחדיר טיפת המלח שנאגר פוספט סטרילי על הקרנית ואת למחות כל גיליונות אפיתל מנותקים עם רקמות לניקוי רהיטים רכות.
  6. לגלח את האפיתל הנותר, אם בכלל.
  7. שים לב זנב העכבר במהלך הניתוח.
    הערה: אם כל תנועה מתרחשת, את עומק ההרדמה דהה וכתב הזרקה נוספת נדרשת. שליש עד שני שלישים של נפח המוזרק העיקרי צריכה להספיק. אל יתר החיה עם תרופות ההרדמה.
  8. לעקר את כל הכלים לפני השימוש בהם על עין נוספת.

3. אשר הסרת אפיתל שלמה

  1. החל ירידה של 1 מ"ג / נתרן והעמסת מ"ל על הקרנית. נקו את הקרנית לאחר 30 שניות ולבחון אותה תחת מיקרוסקופ עם פילטר כחול קובלט לאמת הסרה מלאה של האפיתל.
    הערה: אזורים קרניים עם מומים אפיתל הם דמיינו בירוק.

4. הודעת הפעולה Care

  1. שים את החיה על שמיכת חימום ולשמור אותו במקום בטוח (למשל, בתוך הכלוב שלה) תוך תחת התאוששות. אין להשאיר חית מחוסר הכרה בחברה אלה בהכרה.
  2. החל 1% משחת עיניים אריתרומיצין. זה גם ימנע יובש בעיניים. המשך יישום ביומון אנטיביוטי במשך שבוע.
  3. להזריק 0.1 מ"ג / ק"ג עצירות תת עורי לאחר ההליך ושוב לאחר 12 שעות. המשך הזריקה פעמיים ביום למשך יומיים.
  4. שים את חית 30 - 45 דקות, עד להחלמה מלאה מן ההרדמה.
    הערה: תנועה קלה של שרירי הנשימה על פני שטח הגחון מציינת בריאות חיה בזמן תחת התאוששות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בתוך חודש לאחר ביצוע טכניקה זו, 100% של הקרניות שפותחו נאווסקולריזציה שטחית (איור 1 א. תמונות צולמו במצלמת מחוברת מנורת סדק תחת שדה בהיר מסנן הכחול קובלט). ב 18/20 (90%) של העיניים, נאווסקולריזציה מעורב פני הקרנית כולה (איור 1 א). ב 2/20 (10%), נאווסקולריזציה נצפתה בשלושה מארבעה רביעים קרניים, אבל זה עדיין הגיע למרכז הקרני.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר טכניקה לשחזור ופשוט יחסית ליצור מודל עכבר של LSCD. ישנם כמה היבטים חשובים של מודל זה כי ראוי לציין. ראשית, מודלים בניגוד המשתמשות בכימיקלים 11, 12, הפציעה כרוכה בעיקר האפיתל פני השטח (ו קרום במרתף), עם ניזק מינימאלי stroma הקרני הבסיסי או למבנים תוך עיניים אחרות. לפיכך, יש דלקת מוגבלת בלבד וצלקות, אשר שניהם יכולים לסבך את ההליך ולעשות את זה יותר קשה להעריך את התוצאה הסופית של כל התערבויות שמטרתן תאי גזע limbal. מחקר אחרון מעניין ידי ואח Li. 10...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מודים רות Zelkha, MS, על עזרתם הנדיבה שלה בתחום ההדמיה. מחקר זה מומן על ידי פרס תכנית קליני פיתוח מדען K12EY021475 לי, להעניק R01 EY024349-01A1 כדי ARD, EY01792 מענק הליבה של העין הלאומית, NIH, וכן מענק בלתי מוגבל של מחקר כדי למנוע עיוורון. ARD הוא הנמען של פרס פיתוח קריירה של מחקר כדי למנוע עיוורון.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
בור מסתובב: מסיר טבעת חלודה AlgerBrush II רומקס אינטרנשיונל ושות', קלירווטר, פלורידה16-1410.5 מ"מ קוץ. ניתן להשיג גם מחברות אחרות.
מיקרוסקופ כירורגיWild Heerbrugg, שוויץWild M691
ניקון, תאילנד
ניקון FS-2 מנורת חריץניקון, יפן
נוגדן אנטי-CK12 פוליקלונליקרוז בלוטכנולוגיה, קליפורניה,SC-17101ריכוז 1:100
נוגדן חד-שבטי נגד CK8TROMA-I-s, איווה סיטי, IAAB_531826ריכוז 1:50
מצלמה דיגיטלית סנטה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Afsharkhamseh, N., et al. Stability of limbal stem cell deficiency after mechanical and thermal injuries in mice. Exp. Eye Res. 145, 88-92 (2015).
  2. Dorà, N. J., Hill, R. E., Collinson, J. M., West, J. D. Lineage tracing in the adult mouse corneal epithelium supports the limbal epithelial stem cell hypothesis with intermittent periods of stem cell quiescence. Stem Cell Res. 15 (3), 665-677 (2015).
  3. Ahmad, S., Osei-Bempong, C., Dana, R., Jurkunas, U. The culture and transplantation of human limbal stem cells. J. Cell Physiol. 225 (1), 15-19 (2010).
  4. Kolli, S., Ahmad, S., Lako, M., Figueiredo, F. Successful clinical implementation of corneal epithelial stem cell therapy for treatment of unilateral limbal stem cell deficiency. Stem Cells. 28 (3), 597-610 (2010).
  5. Ahmad, S., Figueiredo, F., Lako, M. Corneal epithelial stem cells: characterization, culture and transplantation. Regen. Med. 1 (1), 29-44 (2006).
  6. He, H., Yiu, S. C. Stem cell-based therapy for treating limbal stem cells deficiency: A review of different strategies. Saudi J. Ophthalmol. 28 (3), 188-194 (2014).
  7. Pal-Ghosh, S., Pajoohesh-Ganji, A., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Removal of the basement membrane enhances corneal wound healing. Exp Eye Res. 93 (6), 927-936 (2011).
  8. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Exp. Eye Res. 121, 178-193 (2014).
  9. Amirjamshidi, H., et al. Limbal fibroblast conditioned media: a non-invasive treatment for limbal stem cell deficiency. Mol. Vis. 17, 658-666 (2011).
  10. Li, F. J., et al. Evaluation of the AlgerBrush II rotating burr as a tool for inducing ocular surface failure in the New Zealand White rabbit. Exp. Eye Res. 147, 1-11 (2016).
  11. Ti, S. E., Anderson, D., Touhami, A., Kim, C., Tseng, S. C. G. Factors affecting outcome following transplantation of ex vivo expanded limbal epithelium on amniotic membrane for total limbal deficiency in rabbits. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 43 (8), 2584-2592 (2002).
  12. Ma, Y., et al. Reconstruction of chemically burned rat corneal surface by bone marrow-derived human mesenchymal stem cells. Stem Cells. 24 (2), 315-321 (2006).
  13. Bu, P., et al. Effects of activated omental cells on rat limbal corneal alkali injury. Exp. Eye Res. 121, 143-146 (2014).
  14. Luengo Gimeno, F., Lavigne, V., Gatto, S., Croxatto, J. O., Correa, L., Gallo, J. E. Advances in corneal stem-cell transplantation in rabbits with severe ocular alkali burns. J. Cataract Refract. Surg. 33 (11), 1958-1965 (2007).
  15. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  16. Huang, A. J., Tseng, S. C. Corneal epithelial wound healing in the absence of limbal epithelium. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 32 (1), 96-105 (1991).
  17. Liu, C. Y., et al. Cornea-specific expression of K12 keratin during mouse development. Curr. Eye Res. 12 (11), 963-974 (1993).
  18. Nakatsu, M. N., González, S., Mei, H., Deng, S. X. Human limbal mesenchymal cells support the growth of human corneal epithelial stem/progenitor cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 55 (10), 6953-6959 (2014).
  19. Pajoohesh-Ganji, A., Pal-Ghosh, S., Tadvalkar, G., Stepp, M. A. Corneal goblet cells and their niche: implications for corneal stem cell deficiency. Stem Cells. 30 (9), 2032-2043 (2012).
  20. McCloy, R. A., Rogers, S., Caldon, C. E., Lorca, T., Castro, A., Burgess, A. Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events. Cell Cycle. 13, 1400-1412 (2014).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים