מאמר שיטה

Microglia בתור biosensor סרוגייט לקביעת Nanoparticle neurotoxicity

DOI:

10.3791/54662

⸱

25 באוקטובר 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Minneapolis Veterans Affairs Health Care System, 2Department of Food Science and Nutrition, University of Minnesota, 3Biomedical Informatics and Computational Biology Program, University of Minnesota, 4Minnesota Obesity Center, University of Minnesota

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מיקרוגליה (תאים חיסוניים של המוח), משמשים כחיישן ביולוגי חלופי כדי לקבוע כיצד ננו-חלקיקים משפיעים על רעילות עצבית. אנו מתארים סדרה של ניסויים שנועדו לבחון את תגובת המיקרוגליה לננו-חלקיקים וחשיפה של נוירונים היפותלמוסיים לסופרנטנט ממיקרוגליה מופעלת כדי לקבוע רעילות עצבית.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-חלקיקים המצויים במזהמי אוויר יכולים לשנות פרופילים של נוירוטרנסמיטורים, להגביר דלקת עצבית ולשנות את תפקוד המוח. לכן, הבדיקה המתוארת כאן תסייע בהבהרת תפקיד המיקרוגליה בדלקת עצבית ובמחלות ניווניות. השימוש במיקרוגליה, תאי חיסון של המוח, כחיישן ביולוגי חלופי מספק תובנה חדשה לגבי האופן שבו תגובות דלקתיות מתווכות עלבונות עצביים. כאן, אנו משתמשים בקו תאי מיקרוגליה של עכברים אימורטליים, המכונה BV2, ומתארים שיטה לחשיפה לננו-חלקיקים באמצעות ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) כסטנדרט. אנו מתארים כיצד לחשוף מיקרוגליה לננו-חלקיקים, כיצד להסיר ננו-חלקיקים מסופרנטנט, וכיצד להשתמש בסופרנטנט ממיקרוגליה מופעלת כדי לקבוע רעילות, תוך שימוש בהישרדות תאי ההיפותלמוס כמדד. בעקבות חשיפה ל-AgNP, הפעלת מיקרוגליה BV2 אומתה באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים גורם נמק גידול אלפא (TNF-α) (ELISA). הסופרנטנט סונן כדי להסיר את ה-AgNP ולאפשר לציטוקינים ולגורמים מופרשים אחרים להישאר במדיה המותנית. לאחר מכן נחשפו תאים היפותלמוסיים לסופרנטנט ממיקרוגליה המופעלת על ידי AgNP והישרדות הנוירונים נקבעה באמצעות מבחן פלואורסצנטי מבוסס רזזורין. טכניקה זו שימושית לשימוש במיקרוגליה כסמן ביולוגי חלופי של דלקת עצבית וקביעת ההשפעה של דלקת עצבית על סוגי תאים אחרים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זיהומים סביבתיים, במיוחד אלה של הטווח ננו-חלקיקים (NP) (1 - 20 בקוטר ננומטר), נקשרו להשמנה ומחלות ניווניות אחרות בשל היכולת לחצות את מחסום דם מוח 1-3. חשיפה גבוהה לזיהום עלולה לגרום לדלקת במערכת העצבים המרכזית כולל ההיפותלמוס 1. מנגנון אפשרי אחד שבו זה מתרחש יכול להיות באמצעות הפעלת המושרה ננו-חלקיקים של microglia (תאי מערכת החיסון במוח) 4. מחקרים קודמים השתמשו במודלים vivo כדי לחקור את ההשפעות של צירופים על בריאות המוח אשר זמן רב, יקר, ובאופן ישיר לא לענות על השאלה של איך צירופים להשפיע microglia. Microglia לשחק תפקיד רב במערכת העצבים המרכזית, כולל תחזוקה של microenvironment המוח ובתקשורת עם סובבים נוירונים באמצעות שחרור גורמים מופרשים וציטוקינים. בהתאם לגירויים, microglia יכול להיות מופעל כדי יחסי ציבור M1o-דלקתי או מדינה אנטי דלקתית M2. לדוגמה, M1 מופעל microglia לשחרר ציטוקינים פרו-דלקתיים כגון אלפא tumor necrosis factor (TNF-α), ואילו M2 מופעל ציטוקינים אנטי דלקתיות שחרור microglia כולל interleukin-4 (IL-4). כדי לאמת פונדקאית שלנו biosensor במבחנה לקביעת רעילות עצבית של מזהמי אוויר, מדדנו תגובה microglial עד 20 חלקיקי כסף ננומטר (AgNPs). מטרת מאמר זה היא לתאר כיצד קו תאים במבחנה microglial יכול לשמש כסמן biosensor פונדקאית לבדיקת תגובה microglial בעכברים כדי צירופים ואיך microglial ההפעלה משפיע על תאים ההיפותלמוס. לטווח הארוך נועד יישום של מודל תוקף זה הוא לבחון השפעות של מזהמים לגבי עולם האמיתי בריאות המוח ומחלות ניווניות. אנו מספקים תיאור מפורט של assay בפורמט במבחנה 96-היטב למדידת ההפעלה microglial והישרדות התא ההיפותלמוס בעקבות חשיפת מיקרופון roglial תקשורת מותנית.

הפעלת microglial נקבעה בעקבות חשיפת AgNP באמצעות אנזים TNF-α מקושר immunosorbent assay (ELISA). כדי לקבוע את ההשפעה של microglia מופעל על תאים ההיפותלמוס, את AgNPs הוצא supernatant microglial (מדיה מותנית) באמצעות מכשיר סינון. מכשיר הסינון שומר ציטוקינים ובמקביל לא תכלול AgNPs על בסיס הגודל. בקצרה, supernatant מן microglia מטופלים עם או בלי AgNPs נאסף, להוסיף את המסננים, centrifuged ב 14,000 XG במשך 15 דקות. היינו אז מסוגל לקבוע את ההשפעה של ציטוקינים המופרשים microglial על כדאיות התא ההיפותלמוס. רעילות לתא בעקבות חשיפה בתקשורת מותנית (ציטוקינים המכיל) נקבעו באמצעות assay מבוסס resazurin כפי שתוארו לעיל 5,6. מבחינה מטבולית תאים פעילים להפחית resazurin ולהפיק אות ניאון ביחס ישר למספר התאים קיימא 7.

NT "> ישנם מספר יתרונות של שימוש בטכניקה זו על פני אחרים (כגון שיתוף תרבות, setups היטב טרנס, או בניסויים vivo). המודל שלנו מספק את היכולת להפעיל ישירות המיקרוגליה לקבוע אם גורמים המופרשים רעילים לנוירונים 8 . הפרוטוקול הנוכחי משתמש microglia BV2 הנציח מגורה עם 20 חלקיקים ננומטר בקוטר, והנציח תאים ההיפותלמוס בעכברים (מיועד mHypo-A1 / 2) 9 לקביעה בתגובה שלאחר מכן. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם תנאים ספציפיים האלה, השיטות יכולות להיות שיניתי לשמש מודלים אחרים של מוות תאי מושרה microglial, או עם סוגי תאים אחרים, כולל המיקרוגליה הנוירונים עיקריים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תחזוקת תא תרבות microglial

  1. תרבית תאים בינוני חמה (בינוני הנשר השונה של Dulbecco; DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / neomycin (PSN) ל -37 מעלות צלזיוס.
  2. השג מלאי קפוא של תאים microglial BV2 ב מעבר 18 - 25 מ אחסון ב -80 ° C. במהירות להפשיר תאים 37 באמבט מים מעלות צלזיוס.
  3. בעדינות להעביר תאים בבקבוק פרק 75 סנטימטר 2 המכיל 10 מיליליטר תא תקשורת ותרבות.
  4. דגירת בקבוק ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לשאוב תקשורת לאחר 24 שעות ולהחליף עם תקשורת טריה. לגדל תאים עד כ 70 - 80% confluency.

ספירה 2. תאי ציפוי

  1. באמבט מים 37 מעלות צלזיוס, DMEM חם פתרון 1x-טריפסין-EDTA.
  2. לשאוב מדיה מתאי ולהוסיף 500 μl של טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 5 דקות.
  3. באמצעות מגרד, להסיר תאים מהבקבוק ו להשעות ב 5 מ"לשל DMEM. Pass התאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל שלוש פעמים.
  4. ספירת תאים באמצעות hemocytometer וזרעי 8,000 תאים / היטב שחור חומת צלחת תחתונה ברורה בנפח סופי של 200 μl DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% PSN. דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  5. הסר הישן DMEM ולהחליף עם 200 μl של חימם DMEM בתוספת 1% PSN סרום להרעיב microglia. דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

3. Microglia הפעלה

  1. ב צינורות נפרדים, לדלל AgNPs (0.01, 0.05 או 0.1 מיקרוגרם / מיליליטר) ורכב / שליטה ניטראלית (נתרן ציטרט, 0.04 מ"מ) סרום ללא DMEM בתוספת 1% PSN לריכוזי עבודה סופיים.
  2. סור 100 μl של תקשורת מכל טוב ולהחליף עם 100 μl של מתחם טיפול מתאים.
  3. דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.

אלחוטי 4.ltering מדיה אוויר

  1. אסוף 200 μl של supernatant תקשורת מכל טוב ולהעביר לתוך (הפסקת משקל מולקולרית של 10 KDA) מסנן עם צינור איסוף (1.5 עד אפס מקום מיליליטר 2).
  2. צנטריפוגה ב 14,000 XG בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
  3. מחק את זרימת הדרך (supernatant עם חלקיקים) ומקום ההפוך המסננת לתוך צינור אוסף חדש.
  4. צנטריפוגה XG ב 1000 בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות.
    הערה: המדיה המסוננת שתעורר (המכיל ציטוקינים מופרשים) מרוכזת על ידי פי שש.
  5. תביא את הנפח של הרכז 400 μl עם DMEM הטרי בתוספת 10% FBS ו -1% PSN ולאחסן על קרח.
    הערה: כדי להבטיח AgNPs שיורית יוסר תקשורת מסוננת, ליצור ריכוז AgNP מבוסס על פסגת האופייניים ב כ 390 - 420 10 ננומטר. בקיצור, להכין aliquots של AgNPs בלי פילטר (0, 0.01, 0.025, 0.05, 0.1, ו -0.2 מיקרוגרם / מ"ל ​​כמתואר בשלב 3.1) ומסונניםשליטה ברכב (נתרן ציטרט, 0.04 מ"מ) ב סרום ללא DMEM. Aliquot 50 μl של דגימות וסטנדרטים מסוננים לשחור חומת צלחת תחתונה ברורה. באמצעות ספקטרופוטומטר, למדוד ספיגת 390 - 410 ננומטר ולהשוות את קריאות עקום ריכוז AgNP. אם דגימות מסוננות יש אותו הערך ספיג כמו מדגם השליטה ברכב, ניתן להניח AgNPs שיורית יוסר.
  6. השתמש חץ התקשורת המסונן כדי לקבוע הוראות באות הפרשת TNF-α מתוך ערכה זמינה מסחרי.

5. תחזוקת תרבית תאים ההיפותלמוס

  1. בינוני תרבות DMEM תא חם בתוספת 10% FBS ו PSN 1% ל -37 מעלות צלזיוס.
  2. השג מלאי קפוא של ההיפותלמוס (mHypo-A1 / 2) תאים ב מעבר 18 - 25 מאוחסנים על 80 מעלות צלזיוס. במהירות להפשיר תאים 37 באמבט מים מעלות צלזיוס.
  3. בעדינות להעביר תאים בבקבוק פרק 75 סנטימטר 2 המכיל 10 מיליליטר תא תקשורת ותרבות.
  4. דגירת בקבוק ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. לשאוב תקשורת לאחר 24 שעות ולהחליף עם תקשורת טריה. לגדל תאים עד כ 70 - 80% confluency.

6. רעילות לתא ההיפותלמוס קביעה

  1. DMEM חם פתרון 1x-טריפסין-EDTA באמבט המים 37 מעלות צלזיוס.
  2. לשאוב מדיה מתאי ההיפותלמוס ולהוסיף 500 μl של טריפסין. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 - 5 דקות. הסרת תאים מן הבקבוק באמצעות מגרד כמתואר לעיל בשלב 2.
  3. ספירת תאים באמצעות hemocytometer צלחת תאי ההיפותלמוס ב 5000 תאים / היטב שחור חומת צלחת תחתונה ברורה בנפח סופי של 200 μl DMEM בתוספת 10% FBS ו -1% PSN דגירת הלילה ב 5% CO 2 ב 37 ° C .
  4. הסר 100 μl של המדיה הישנה באמצעות pipetter רב ולהוסיף 100 μl של התקשורת מותנה מרוכזים מסונן, לריכוז סופי של 1x.
  5. דגירת צלחת ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
  6. להוסיף 221; l של מגיב resazurin דגירה צלחת במשך 20 דקות ב 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס.
  7. באמצעות ספקטרופוטומטר multimode, הקרינה שיא (560 ננומטר EX / 590 ננומטר EM) כדי למדוד כדאיות התא. דווח תוצאות כיחידות קרינה יחסיות (RFU).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מראים כי הפונקציה microglia בתור biosensor פונדקאית עבור תגובת המוח חלקיקים באמצעות פרוטוקול לעיל. התוצאות שלנו כוללות מדידה מן ההשפעות הרעילות של הפעלת microglial על מוות של תאים עצביים במורד זרם. איור 1 מדגימה זרימת עבודה של הפרוטוקול להפעיל המיקרוגליה לקבוע אם ציטוקינים המופרשים להפחית כדאיות של נוירונים ההיפותלמוס. הפרשת TNF-α הוגדלה משמעותית בעקבות חשיפת AgNP (איור 2). כאשר נוירונים ההיפותלמוס נחשפים למדיה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקרים אחרונים תומכים בכך שחשיפה סביבתית תורמת להשמנת יתר ולמחלות ניווניות אחרות 11,12. עם זאת, טכניקות ששימשו במחקרים קודמים גוזלות זמן ויקרות. שיקולים כלכליים, מערכות אספקה רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, סוגיות אתיות עם שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים in vivo , וקושי לתרגם ממצאים לייעוץ בריאותי משמעותי הם כמה מהאתגרים העיקריים שעיכבו את ההתקדמות בחקר רעילות עצבית הנגרמת על ידי NP 13. לכן, השימוש בחיישן ביולוגי חלופי מיקרוגליאלי במבחנה הפך לכלי חיוני לחשיפה סביבתית לנוירוטוקסינים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לענייני חיילים משוחררים בארה"ב BLR&D IK2 BX001686 (ל-TAB), ומענקים מאוניברסיטת מינסוטה למזון בריא, המכון לחיים בריאים (ל-CMD, JPN ו-TAB) וקרן המחקר והחינוך הרפואי ליוצאי צבא מינסוטה (ל-TAB). אנו מודים לד"ר פיליפ מרמבו (מכון פיינשטיין למחקר רפואי, מנהאסט, ניו יורק) ול-Weihua Zhao (בית החולים המתודיסטי ביוסטון, טקסס) על אספקת קו התאים BV2.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<תאים חזקים/ריאגנטים
תאי מיקרוגליה של עכבר (BV2)אוסף קו תאים בין>מעבדתי (גנואה, איטליה)ATL03001
קו תאי היפותלמוס של עכבר בוגר mHypoA-1/2 סלוטיונס ביוסיסטמס בע"מCLU172
דולבקו s Modified Eagle' s MediumInvitrogen10313-039
סרום בקר עוברי PAA LabsA15-751
פניצילין/סטרפטומיצין/ניאומיציןתרמו פישר סיינטיפיק15640-055
טריפסין-EDTAתרמו פישר25200056
ננו-חלקיקי כסף (20 ננומטר)Sigma-Aldrich730793

PrestoBlue Cell Reagent		InvitrogenA13262
עכבר TNF- ואלפא; ELISA Max DeluxBiolegend430904
ליפופוליסכרידסיגמא-אולדריץ'L4391
נתרן ציטראטסיגמא-אולדריץ'S4641
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי<חזק>הערות
<חזק>ציוד
96 W, פוליסטירן שחור, תרבית תאים מטופלת, עם מכסה,Sterile Thermo Fisher Scientific
Amicon Ultra-0.5 עם קרום Ultracel-10 EMDMilliporeUFC501008
SpectraMax M5 Multi-Mode Microplateמכשירים מולקולרייםM5
Falcon 50 מ"ל צנטריפוגה חרוטית צינורותCorning, Inc
14-432-22
מסנני תאי פלקון 70 μ mCorning, Inc08-771-2
צנטריפוגה שולחנית 5430Eppendorf22620560
קו יחידת מסנן צנטריפוגלי 165305

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
  2. Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly. Risk Anal. 34, 567-582 (2014).
  3. Jerrett, M., et al. Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis. Environ Health. 13, 49(2014).
  4. Kraft, A. D., Harry, G. J. Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity. Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).
  5. Duffy, C. M., et al. Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells. Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).
  6. Butterick, T. A., et al. Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model. J Vis Exp. , (2014).
  7. Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
  8. Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus. J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).
  9. Belsham, D. D., et al. Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons. FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).
  10. Paramelle, D., et al. A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra. Analyst. 139, 4855-4861 (2014).
  11. Wei, Y., et al. Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing. FASEB J. , (2016).
  12. Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease. J Neuroinflammation. 8, 105(2011).
  13. Block, M. L., et al. The outdoor air pollution and brain health workshop. Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).
  14. Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models. Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).
  15. Valdearcos, M., et al. Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function. Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).
  16. Perry, V. H., Holmes, C. Microglial priming in neurodegenerative disease. Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).
  17. Block, M. L., Hong, J. S. Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity. Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).
  18. Vincenti, J. E., et al. Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration. J Virol. 90, 3003-3017 (2015).
  19. Grabert, K., et al. Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging. Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).
  20. Lull, M. E., Block, M. L. Microglial activation and chronic neurodegeneration. Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).
  21. Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways. Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).
  22. Gifford, J. C., et al. Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis. Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).
  23. Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4. Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).
  24. Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor. Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).
  25. PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755 (2004).
  26. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  27. McCarthy, R. C., et al. Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta. J Neuroinflammation. 13, (2016).
  28. Schauer, J. J., et al. Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers. Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).
  29. Kleeman, M. J., et al. Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode. Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).
  30. Borm, P. J., et al. The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC. Part Fibre Toxicol. 3, (2006).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

BV2ELISA TNF alpha

מאמרים קשורים