מיקרוגליה (תאים חיסוניים של המוח), משמשים כחיישן ביולוגי חלופי כדי לקבוע כיצד ננו-חלקיקים משפיעים על רעילות עצבית. אנו מתארים סדרה של ניסויים שנועדו לבחון את תגובת המיקרוגליה לננו-חלקיקים וחשיפה של נוירונים היפותלמוסיים לסופרנטנט ממיקרוגליה מופעלת כדי לקבוע רעילות עצבית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Microglia בתור biosensor סרוגייט לקביעת Nanoparticle neurotoxicity
במאמר זה
סיכום
תקציר
ננו-חלקיקים המצויים במזהמי אוויר יכולים לשנות פרופילים של נוירוטרנסמיטורים, להגביר דלקת עצבית ולשנות את תפקוד המוח. לכן, הבדיקה המתוארת כאן תסייע בהבהרת תפקיד המיקרוגליה בדלקת עצבית ובמחלות ניווניות. השימוש במיקרוגליה, תאי חיסון של המוח, כחיישן ביולוגי חלופי מספק תובנה חדשה לגבי האופן שבו תגובות דלקתיות מתווכות עלבונות עצביים. כאן, אנו משתמשים בקו תאי מיקרוגליה של עכברים אימורטליים, המכונה BV2, ומתארים שיטה לחשיפה לננו-חלקיקים באמצעות ננו-חלקיקי כסף (AgNPs) כסטנדרט. אנו מתארים כיצד לחשוף מיקרוגליה לננו-חלקיקים, כיצד להסיר ננו-חלקיקים מסופרנטנט, וכיצד להשתמש בסופרנטנט ממיקרוגליה מופעלת כדי לקבוע רעילות, תוך שימוש בהישרדות תאי ההיפותלמוס כמדד. בעקבות חשיפה ל-AgNP, הפעלת מיקרוגליה BV2 אומתה באמצעות בדיקת אימונוסורבנט מקושר לאנזים גורם נמק גידול אלפא (TNF-α) (ELISA). הסופרנטנט סונן כדי להסיר את ה-AgNP ולאפשר לציטוקינים ולגורמים מופרשים אחרים להישאר במדיה המותנית. לאחר מכן נחשפו תאים היפותלמוסיים לסופרנטנט ממיקרוגליה המופעלת על ידי AgNP והישרדות הנוירונים נקבעה באמצעות מבחן פלואורסצנטי מבוסס רזזורין. טכניקה זו שימושית לשימוש במיקרוגליה כסמן ביולוגי חלופי של דלקת עצבית וקביעת ההשפעה של דלקת עצבית על סוגי תאים אחרים.
מבוא
זיהומים סביבתיים, במיוחד אלה של הטווח ננו-חלקיקים (NP) (1 - 20 בקוטר ננומטר), נקשרו להשמנה ומחלות ניווניות אחרות בשל היכולת לחצות את מחסום דם מוח 1-3. חשיפה גבוהה לזיהום עלולה לגרום לדלקת במערכת העצבים המרכזית כולל ההיפותלמוס 1. מנגנון אפשרי אחד שבו זה מתרחש יכול להיות באמצעות הפעלת המושרה ננו-חלקיקים של microglia (תאי מערכת החיסון במוח) 4. מחקרים קודמים השתמשו במודלים vivo כדי לחקור את ההשפעות של צירופים על בריאות המוח אשר זמן רב, יקר, ובאופן ישיר לא לענות על השאלה של איך צירופים להשפיע microglia. Microglia לשחק תפקיד רב במערכת העצבים המרכזית, כולל תחזוקה של microenvironment המוח ובתקש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תחזוקת תא תרבות microglial
- תרבית תאים בינוני חמה (בינוני הנשר השונה של Dulbecco; DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / neomycin (PSN) ל -37 מעלות צלזיוס.
- השג מלאי קפוא של תאים microglial BV2 ב מעבר 18 - 25 מ אחסון ב -80 ° C. במהירות להפשיר תאים 37 באמבט מים מעלות צלזיוס.
- בעדינות להעביר תאים בבקבוק פרק 75 סנטימטר 2 המכיל 10 מיליליטר תא תקשורת ותרבות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אנו מראים כי הפונקציה microglia בתור biosensor פונדקאית עבור תגובת המוח חלקיקים באמצעות פרוטוקול לעיל. התוצאות שלנו כוללות מדידה מן ההשפעות הרעילות של הפעלת microglial על מוות של תאים עצביים במורד זרם. איור 1 מדגימה זרימת עבודה של הפרוטוקול להפעיל המיקרוגליה לקבוע אם ציטוקינים המופרשים להפחית כדאיות של נוירונים ההיפותלמוס. הפרשת TNF-α הוגדלה משמעותית בעקבות חשיפת AgNP (איור 2). כאשר נוירונים ההיפותלמוס נחשפים למדיה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
מחקרים אחרונים תומכים בכך שחשיפה סביבתית תורמת להשמנת יתר ולמחלות ניווניות אחרות 11,12. עם זאת, טכניקות ששימשו במחקרים קודמים גוזלות זמן ויקרות. שיקולים כלכליים, מערכות אספקה רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית, סוגיות אתיות עם שימוש נרחב במודלים של בעלי חיים in vivo , וקושי לתרגם ממצאים לייעוץ בריאותי משמעותי הם כמה מהאתגרים העיקריים שעיכבו את ההתקדמות בחקר רעילות עצבית הנגרמת על ידי NP 13. לכן, השימוש בחיישן ביולוגי חלופי מיקרוגליאלי במבחנה הפך לכלי חיוני לחשיפה סביבתית לנוירוטוקסינים
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין קונפליקטים לחשוף.
תודות
עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לענייני חיילים משוחררים בארה"ב BLR&D IK2 BX001686 (ל-TAB), ומענקים מאוניברסיטת מינסוטה למזון בריא, המכון לחיים בריאים (ל-CMD, JPN ו-TAB) וקרן המחקר והחינוך הרפואי ליוצאי צבא מינסוטה (ל-TAB). אנו מודים לד"ר פיליפ מרמבו (מכון פיינשטיין למחקר רפואי, מנהאסט, ניו יורק) ול-Weihua Zhao (בית החולים המתודיסטי ביוסטון, טקסס) על אספקת קו התאים BV2.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <תאים חזקים/ריאגנטים | |||
| תאי מיקרוגליה של עכבר (BV2) | אוסף קו תאים בין>מעבדתי (גנואה, איטליה)ATL03001 | ||
| קו תאי היפותלמוס של עכבר בוגר mHypoA-1/2 | סלוטיונס ביוסיסטמס בע"מ | CLU172 | |
| דולבקו s Modified Eagle' s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| סרום בקר עוברי | PAA Labs | A15-751 | |
| פניצילין/סטרפטומיצין/ניאומיצין | תרמו פישר סיינטיפיק | 15640-055 | |
| טריפסין-EDTA | תרמו פישר | 25200056 | |
| ננו-חלקיקי כסף (20 ננומטר) | Sigma-Aldrich | 730793 | |
PrestoBlue Cell Reagent | Invitrogen | A13262 | |
| עכבר TNF- ואלפא; ELISA Max Delux | Biolegend | 430904 | |
| ליפופוליסכריד | סיגמא-אולדריץ' | L4391 | |
| נתרן ציטראט | סיגמא-אולדריץ' | S4641 | |
| <חזק>שם | <חזק>חברה | <חזק>מספר קטלוגי | <חזק>הערות |
| <חזק>ציוד | |||
| 96 W, פוליסטירן שחור, תרבית תאים מטופלת, עם מכסה, | Sterile Thermo Fisher Scientific | ||
| Amicon Ultra-0.5 עם קרום Ultracel-10 EMD | Millipore | UFC501008 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | מכשירים מולקולריים | M5 | |
| Falcon 50 מ"ל צנטריפוגה חרוטית צינורות | Corning, Inc | 14-432-22 | |
| מסנני תאי פלקון 70 μ m | Corning, Inc | 08-771-2 | |
| צנטריפוגה שולחנית 5430 | Eppendorf | 22620560 |
מקורות
- Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease. Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).
- Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. Physiological daily inhalation rates for health risk asse....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
