הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Conrad M. Tenenbaum; Elizabeth R. Gavis

doi:10.3791/54670

הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הסרה של

8.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54670

⸱

2 בנובמבר 2016

Conrad M. Tenenbaum¹ , Elizabeth R. Gavis¹

¹Department of Molecular Biology, Princeton University

במאמר זה

סיכום

מחקרים של המורפוגנזה העצבית באמצעות arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (da) נוירונים ליהנות להדמיה באתרו של חלבונים עצביים ו אפידרמיס על ידי immunofluorescence. אנו מתארים הליך המשפר ניתוח immunofluorescence של דה נוירונים ותאי אפידרמיס סביב על ידי הסרת רקמת שריר מקיר גוף הזחל.

תקציר

נוירונים arborization הדנדריטים הזחל תסיסנית (דה) הם מודל פופולרי על חקירת מנגנוני המורפוגנזה העצבית. נוירונים דה להתפתח תקשורת עם תאי אפידרמיס הם מעצבבים ובכך יתרונות הניתוח שלהם להדמיה באתרו של שני החלבונים הביעו neuronally ו epidermally ידי immunofluorescence. שיטות מסורתיות של הכנת פילת זחל לניסויי immunofluorescence להשאיר על כנו את רקמת השריר שמכסה את רוב קיר הגוף, הצגת מספר אתגרי הדמית חלבונים עצביים ו אפידרמיס. כאן אנו מתארים שיטה להסרת רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה מאפשר הדמיה של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר יחס אות לרעש, ומקל על שימוש במיקרוסקופ ברזולוצית סופר ללמוד דה פיתוח נוירון.

מבוא

נוירונים arborization הדנדריטים זחל תסיסנית (da) לספק מודל ערך ללימוד פיתוח עצבי בשל amenability שלהם מניפולציה גנטית ואת הקלות שבה הם יכולים להיות צלמו. עצב סנסורי אלה כבר סייע בזיהוי מסלולים רבים השולטים דנדריט morphogenesis ^1-3.

ארבע כיתות של דה נוירונים (אני בכיתה - IV) המעצבבים האפידרמיס הזחל. נוירונים אלה שיוותרו בין קרום במרתף ואת האפידרמיס, עם הדנדריטים שלהם ויוצרים מערכים דו מימדי בעיקר ^4,5. של ארבע כיתות, נוירונים דה IV סוג יש סוכות מסועפת מאוד ביותר, כמו עצב סנסורי של בעלי חיים אחרים, פירוט של סוכות אלה מחייב גורמים פנימיים כמו גם רמזים מרקמות שכנות, במיוחד האפידרמיס, להתפתחותם ^6-9 .

מחקרים כדי לקבוע כיצד כגון עצבי עובדה נוספת עצביתORS לשלוט תועלת המורפוגנזה דנדריט מהיכולת לזהות ביטוי חלבון באתרו על ידי immunofluorescence. לציפורן החיצוני של הזחל הוא בלתי חדיר נוגדנים, אבל מניעה זו היא להתגבר בקלות על ידי הכנת פילת זחל באמצעות שיטות לנתיחה ומבוססות ^10,11. עם זאת, רקמת השריר בגוף הקיר שנמצאה רק פנים אל הקרום במרתף מציגה מספר אתגרים כלפי להדמיה של נוירונים דה ותאי אפידרמיס. ראשית, רקמת השריר, אשר הקווים ביותר של קיר הגוף, מטשטשים אותות ניאון מאוד שמקורם ברקמה עצבית או אפידרמיס. זה מפחית באופן משמעותי את יחס האות לרעש במדגם. שנית, חלבונים רלוונטיים רבים עשויים לבוא לידי ביטוי ברקמת השריר כמו גם בתאי העצב או האפידרמיס. אותות קרינת נגזרות שריר זה עשוי זיהוי מעורפל נוסף של אות קרינה מן הנוירון או האפידרמיס. לבסוף, ההתקדמות בטכנולוגיות מיקרוסקופיה לאהדמית יתר w של דגימות ברזולוצית המשנה דיפרקציה וכן עשויה להיות מועילה במיוחד הבחנת הלוקליזציה של חלבונים אשר מתבטאים בנוירונים והסביבה תא אפידרמיס ^12,13. עם זאת, הדמיה באמצעות הטבות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה מ איתות חזקה יחס רעש בסמיכות של המדגם כדי coverslip. בנוסף הפחתת יחס האות לרעש, מרחקי שריר קיר גוף הזחל דה נוירונים מן coverslip, וכך להגביל את רזולוציית תמונה המשופרת שניתן להשיג עם שיטות מיקרוסקופיה סופר-רזולוציה. מלבד אתגרים לניתוח immunofluorescence, רקמת שריר מציגה מחסום הקלטת אלקטרו מן עצב סנסורי בקיר גוף הזחל. הסרתו ולכן הטבות מניפולציה הנוירופיזיולוגיים של עצב סנסורי ^14.

הנה שיטה להסרה ידנית של רקמת שריר זחל תסיסנית מתוארת. אנו מראים כי p הפרוטוקול שלנוהדמיה immunofluorescence ermits של חלבונים כי הם מוסתרים אחרת על ידי רקמת שריר, משפר את יחס אות לרעש להדמיה של נוירונים דה IV בכיתה, ומאפשר את השימוש במיקרוסקופ סופר-רזולוציה להפלות יחסים מרחבית טובה יותר של חלבונים ומבנים הסלולר דה נוירונים האפידרמיס.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: ההליך להסרת שריר (איור 1) הוא שינוי של שיטות שתוארו קודם לכן להכנת פילת זחל. השלבים שקודמים אחרי הסרת שריר מתוארים בקצרה ואת הקורא נקרא בעבודה קודמת ^{10, 11} לתיאורים מפורטים יותר.

1. לנתח זחל מלוח קר

הכין דילול עובד של מלוחים HL3.1 הקרים ¹⁵ או Ca הקר ^{2 +} ללא HL3.1 מלוח ¹¹ (טבלה 1). מניחים את הזחל בצלחת אלסטומר סיליקון עם מי מלח קר מספיק כדי לכסות את החלק התחתון של המנה.
הערה: ראה דיון לגבי הבחירה מלוחה.

1x HL3.1 מלוח (pH 7.2)

5 HEPES מ"מ

70 מ"מ NaCl

5 מ"מ KCl

1.5 מ"מ CaCl ₂ (להשמיט עבור Ca ²⁺ מלוחים -חינם)

4 מ"מ MgCl ₂

10 מ"מ NaHCO ₃

5 trehalose מ"מ

115 סוכרוז mM

סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C

הערה: מחק רכב חרקי hemolymph

רכב טבלת 1. קרה מלוחה.

מקם את הזחל עם למעלה בצד הגחון. המשטח הגחון של הזחל יכול להיות מזוהה על ידי חגורות dentical הבטן בצד הגבי על ידי צינורות לקנה הנשימה הזחל העיקרי פועל מן הקדמי אל האחורי. מתחו את הזחל בכיוון הקדמי, האחורי ולהצמיד את הראש והזנב עלאלסטומר סיליקון לנתח צלחת באמצעות סיכות חרקים. השתמש במספריים לנתח בסדר לחתוך לאורך קו האמצע הגחון, החל בקצה אחד מתקדם לעבר הקצה השני.
הערה: כיוון זה משמר את האשכול הגבה למד הנפוצה של דה נוירונים.
לאחר הזחל הוא חתך פתוח, להצמיד מארבע כנפות כדי בצלחת לנתח כאילו לפתוח ספר. שימוש במלקחיים כדי לתפוס ולהסיר איברים פנימיים כולל מערכת העצבים המרכזית, המעיים, ואת קנה הנשימה. התאם סיכות חרקים כך הפילה מתוחה אבל לא נמתח מקסימאלי.
הערה: שרירים מעוגנים אל קיר הגוף בגבולות מגזריים. למרות שרירים המכסים את רוב קיר הגוף, הם נעדרים אזור צר ליד קו האמצע הגבה.

הסרת שרירים 2.

אתר את קו האמצע הגבי של הזחל, שבו רקמת שריר תיאור. יישור שיניים מלקחיים אחת כזאת שזה יכול להיות מוכנס מתחת רקמת שריר בכיוון השטוח ביותר האפשרי.
מתחיל בקו אמצע הגב, ליד הגבול הקדמי של המגזר, החלק בזהירות את שן המלקחיים בין השרירים האפידרמיס, מקפיד לצמצם מגע בין המלקחיים האפידרמיס.
משוך את המלקחיים כלפי מעלה כדי לשבור את החיבור של השריר אל קיר הגוף בשלב עוגן אחד. חזור על תהליך זה עבור חמי קטע הנותרים (ים) של עניין.
הערה: פרוטוקול זה מייעל שימור האחורי של כל שדה דנדריט נוירון דה. כדי לשמר את החלק הקדמי של השדה דנדריט, עדיף להכניס את שן מלקחיים בקצה האחורי של כל פלח.
להתאים מחדש סיכות חרקים כך פילת הזחל נמתחה מקסימלי לכל הכיוונים.
תקן את הפילה בזמן שהוא עדיין מוצמד אל הצלחת לנתח באמצעות פורמלדהיד 4% קרים, מוכן טרי PBS במשך 25 דקות.
לשטוף 5 פעמים PBS.
שימוש במלקחיים כדי להתרחק רקמות שריר בזהירות מנקודות העוגן הנותרים, מקפיד למזער contact עם האפידרמיס.
ביטול הצמדה ולהסיר את פילה מצלחת לנתח לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בצע את כל הכביסה הבאה, חסימה, והצעדים המכתימים immunofluorescence, כפי שתואר לעיל ^11.

3. רכב את פילת הזחל

ראשית להסיר את הראש והזנב באמצעות מספריים לנתח גלם על מנת להפוך את המדגם שטוח ככל האפשר. הר פילה על coverslip ב antifade mountant עם המשטח הפנימי של פילה מול coverslip.
מקום שקופית מיקרוסקופ על coverslip ולחץ בעדינות כדי לפזר את ההרכבה בינונית. תהפכו את השקופית מיקרוסקופ שוב לאטום את coverslip בשקופית באמצעות לק. ניתן לאחסן שקופיות ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אנו להדגים את התועלת של הליך ההסרה שריר לשיפור יחס אות לרעש בניסויים immunofluorescence לשתף לדמיין חלבונים צומת septate Coracle (קורה) ו דיסקים-גדול (DLG) יחד עם נוירונים דה IV בכיתה שכותרתו עם סמן קרום CD4- tdTomato.

קורה כבר השתמשו בעבר כדי לזהות שטחים שבהם דה דנדריטים נוירון מוקפים על ידי תאי אפידרמיס והוא אחד הגורמים אפידרמיס רבים זיהו כי נחקרו בשיתוף עם morphogenesis ותפקוד ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הנה פרוטוקול מתואר על הסרה ידנית של רקמת שריר מן פילת זחל תסיסנית. פרוטוקול זה משנה תאר טכניקות לנתיחת זחל בעבר ^10,11. לאחר הזחל גזור בצלחת אלסטומר סיליקון, קו אמצע הגב ממוקם. ראש חץ מלקחיים יחיד, באורינטציה האפשרית השטוח שלה, מוכנס בזהירות בין רקמת השריר ואת האפידרמיס, ליד קו האמצע הגבה. המלקחיים בעדינות נמשכים כלפי מעלה כדי רקמת שריר נפרדת מן נקודת עוגן אחד בכל מגזר זחל של עניין. פילה הזחל הוא קבוע אז בפורמלין קר שלאחריו מלקחיים המשמשים שוב למשוך את השריר מנק...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

החוקרים אין לי מה לחשוף.

תודות

אנו מודים גארי לאייבסקי לדיונים מועילים על מיקרוסקופיה. עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקים R01GM061107 ו R01GM067758 כדי ERG

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Dumont #5 פינצטה	אלקטרונים מדעי מיקרוסקופיה	72701-D
מספריים מיקרו, 8 ס"מ, ישרים, 5 מ"מ, קצות 0.1 מ"מ	World Precision Instruments	14003
Sylgard 184 ערכת אלסטומר סיליקון	Dow Corning	3097358-1004	לניתוח צלחות
סיכות חרקים אוסטרליץ, 0.1 מ"מ	Fine Science Tools	26002-10
Fostec 8375 מקור אור	Artisan Technology Group	62792-4
Zeiss Stemi 2000	Carl Zeiss Microscopy
Vectashield antifade הרכבה בינונית	Vector Laboratories	H-1000	למיקרוסקופיה קונפוקלית
Prolong Diamond antifade mountant	Life Technologies	P36970	למיקרוסקופיה תאורה מובנית
מיקרו כיסוי זכוכית, 22 x 22 מ"מ, מס' 1.5	VWR	48366-227
שקופיות מיקרוסקופ סופרפרוסט פלוס, 25 x 75 x 1.0 מ"מ	פישרברנד	12-550-15
עכבר נוגדנים נגד קורקל	מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה	C615.16	supernatant, מדלל 1:50
עכבר נגד דיסקים נוגדנים גדולים	מחקרים התפתחותיים בנק היברידומה	4F3	supernatant, מדלל 1:50
ארנב נוגדן נגד dsRed	Clontech		632496 לדלל 1:1,000
נוגדן נגד ארנב עזים, Alexa Fluor 568 מצומד	ThermoFisher	Scientific A-11011	לדלל 1:1,000
נוגדן נגד עכברים עזים, Alexa Fluor 488 מצומד	ThermoFisher Scientific	A-11001	מדלל 1:500

מקורות

Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D. Drosophila larval NMJ dissection. J Vis Exp. (24), (2009).
Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111(2011).
Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Larva של Drosophila הסרת רקמת שריר נוירונים בעלי הסתעפות דנדריטית מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה דימוג קונפוקאלי הכנת פילה של זחלים ויזואליזציה של חלבון אפידרמלי