מאמר שיטה

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

DOI:

10.3791/54673

⸱

11 בנובמבר 2016

 ,  ,  , 
1Department of Medical Specialties, Division of Endocrinology, Diabetes, Hypertension and Nutrition, Diabetes Center, University of Geneva Medical School, Institute of Genetics and Genomics in Geneva (iGE3), 2Population Epidemiology Unit (UEP), Community Medicine, Geneva University Hospital

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים הגדרות לניטור במקביל ביולומינסנציה צירקדית ופעילות ההפרשה של תאי איים אנושיים וצינורות שריר ראשוניים. לשם כך, השתמשנו בהעברת גן לנטי-ויראלי של מדווח שעון ליבת לוציפראז, ואחריו סנכרון במבחנה ואיסוף מדיום זרימה על ידי פריפוזיה רציפה של תאים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שעוני יממה הם פונקציונליים בכל היצורים רגישים לאור, המאפשרים עיבוד לעולם החיצוני על ידי צופה שינויים סביבתיים יומיים. התקדמות ניכרה בהבנת הקשר ההדוק בין השעון הביולוגי ואת רוב ההיבטים של פיזיולוגיה נעשתה בתחום בעשור האחרון. עם זאת, לחשיפת הבסיס המולקולרי העומד בבסיס הפונקציה של מתנד היממה בבני אדם נשאר של האתגר הגבוה ביותר טכנית. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של גישה ניסויית לטווח ארוך (2-5 ימים) הקלטת פליטת אור ואיסוף בינוני יצוא ב תאים ראשוניים אדם מתורבתים. לשם כך, יש לנו transduced תאים ראשוניים עם כתב בלוציפראז lentiviral כי הוא תחת שליטה של ​​מקדם גן שעון ליבה, אשר מאפשר הערכה במקבילה של הפרשת הורמון פליטת אור יממה. יתר על כן, אנו מתארים את התנאים לשבש את השעון הביולוגי בתחום יחסי הציבורתאים אנושיים imary ידי transfecting CLOCK מיקוד siRNA. התוצאות שלנו על תקנת היממה של הפרשת אינסולין על ידי איי לבלב אנושיים, ואת הפרשת myokine ידי תאי שריר שלד אנושיים, מובאות כאן כדי להדגים את יישום מתודולוגיה זו. הגדרות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את האיפור המולקולרי של שעונים היקפים אדם כדי לנתח את השפעת הפעילות שלהן על תאים ראשוניים בתנאים פיסיולוגיים או pathophysiological.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מערכת תזמון היממה (מלטינית "Circa דיאם") התפתחה בכל היצורים הרגישים לאור, כמו מנגנון הסתגלות לכיוון הסיבוב העצמי של כדור הארץ. ביונקים, היא מאורגנת באופן היררכי, המקיפה את השעון המרכזי, אשר ממוקם בגרעין suprachiasmatic של ההיפותלמוס הגחון, ואת פריפריה (או עבדים) מתנדים כי הם פעילים באיברים שונים. יתר על כן, מתנדים העצמיים מתמשך אוטונומית תאים אלה הם פונקציונליים כמעט בכל תא בגוף 1. אותות photic לייצג אות סינכרון דומיננטי (צייטגבר) עבור נוירונים SCN, ואילו אותות עצביים הלחות הנפלט SCN לאפס את השעונים ההיקפיים. במקצבים שאר-פעילות בנוסף, שמניעים במחזורי האכלה-צום בתורם, הם synchronizers נוסף על שעונים היקפיים 2. לפי ההבנה הנוכחית שלנו, את האיפור המולקולרי של שעון הליבה מבוסס על תעתיק ו Translaלולאות משוב תזונתיות, אשר שמורות בין אורגניזמים. מהווה את activators תעתיק BMAL1 ושעון, אשר יחד להפעיל שעתוק של גני PER ולבכות שעון ליבה השליליים. רמות גבוהות של PER וחלבוני CRY תמנענה שעתוק שלהם באמצעות עיכוב של מתחם BMAL1 / שעון. בלופ עזר מורכב של קולטנים הגרעיניים REV-ERBs ו RORs, אשר גם לווסת את השעתוק של BMAL1 ושעון. יתר על כן, אירועי posttranslational כוללים זירחון, sumoylation, acetylation, O-GlcNAcylation, שפלה וכניסת גרעין של חלבוני שעון הליבה מייצגים שכבה רגולטוריות חשובה נוספת בביסוס מחזור התנודה 24 שעות 3.

ראיות מצטברות נובעות ממחקרים במודלים של מכרסמים ומדגישות את התפקיד הקריטי של מערכת היממה בתיאום פונקציות מטבוליות האנדוקרינית 4-5. מספר largדואר בקנה מידה ניתוח transcriptome עולה כי האכלה - צום מחזורים לשחק תפקיד מרכזי הסנכרון של מתנדים היקפי 6-8. בהסכם עם המחקרים הללו, metabolomic וניתוח lipidomic במכרסמים ובבני אדם חשפו כי מספר רב של מטבוליטים להתנדנד ברקמות, פלזמה, ורוק באופן היממה 9-11. חשוב לציין, רוב ההורמונים להפגין מקצבי היממה בדם 5,12-13. יתר על כן, שעוני יממה של ההורמון המקביל בייצור רקמות היקפיות עשויים לווסת הפרשת הורמון מקומי. תאים אוטונומיים מתנדים יממה תוארו מכרסם ותאי לבלב אנושיים 14-16. מתנדים אלה ממלאים תפקיד חיוני בוויסות transcriptome לבלב ולתפקד 15,17-18. יתר על כן, הפרשת myokine ידי myotubes השלד האנושי הודגמה לאחרונה להציג דפוס היממה, אשר מווסתת על ידי oscillato תאים אוטונומייםrs פעיל בתאים אלה 19.

מספר גישות ללימוד מקצבי יממה בבני האדם in vivo היו בשימוש נרחב. למשל, מלטונין פלזמה או רמות קורטיזול וכן טמפרטורת פני עור החזי (הנסקרת ב אזכור 3,20) נחקר להעריך שעוני יממה אנדוגני. למרות ששיטות אלו מאפשרות ללמוד תנודות יממה מערכתיות in vivo, הם רחוקים מלהיות מספקים הערכה אמינה של מקצבי יממה אוטונומיים חופשיים פועלים באיברים וברקמות שונים. אף על פי כן, דיסקציה כזה מן הרגולציה המערכתית תהיה כלי חיוני להבנת ההשפעה הספציפית של שעון מולקולרי תאי על תפקודם של תאים אלה. לכן, במאמץ ניכר, שבו בוצע עד לפתח גישות אמינות לחקר שעוני אדם תאים בתרבית הנציחו או עיקריים המסונכרנים במבחנה. חשוב לציין, זה הוכח כימאפייני שעון נמדדים תאי פיברובלסטים עור בתרבית ראשוניים מקרוב לשקף את מאפייני שעון הפרט של האורגניזם כולו 21. התפתחות כתבי יממת פלורסנט bioluminescent מאוד התקדמה גישה זו 22-27. יתר על כן, שעוני תא ראשוניים לומדים כי נגזרים איברים היקפיים שונים מאפשרים חקירת התכונות המולקולריות של שעוני רקמות ספציפיות אדם 3,5,16,19-20,28. לפיכך, הערכת שעוני יממת explants הראשוני במבחנה מסונכרנת או תאים, באמצעות כתבי bioluminescent, מייצג שיטה שימושית מאוד ללמוד את האיפור המולקולרי של שעונים היקפים אדם והשפיעו על תפקוד איברים.

במאמר זה, נציג פרוטוקולים מפורטים להערכת ביטוי גני יממה בתאי איון עיקרי אדם שריר השלד מסונכרן במבחנה, כמו גם את ההשפעה של שעון סלולארי אוטונומיהפרעה על תפקוד הפרשה של תאים אלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצהרת אתיקה: מניפולציות הכלולים בפרוטוקול זה אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים האוניברסיטאי ז'נבה ועל ידי IV EST ועדת SUD האתי (סכם 12/111) 19. איי אדם בודדו לבלב התורמים מוות מוחי רב-איבר מרכז ההשתלות איילט בבית החולים האוניברסיטאי של ג'נבה (שווייץ) כפי שתואר על ידי אותנו אזכור 16,18, או להשיג ממקור מסחרי.

1. הכנת תרבית תאים ראשונית

  1. בידוד איילט הלבלב האנושי, דיסוציאציה והתרבות
    הערה: מעיל כל צינור, קצה פלסטיק או פיפטה עם קונוט רפואי מעבדות המחקר (CMRL) בינוני כדי למנוע איים או תאים איון יידבקו אל פני השטח פלסטיק, מה שעלול להוביל לאובדן משמעותי של חומר התא.
    1. יום אחד לפני איון תא דיסוציאציה להוסיף 1 מ"ל של תאי מטריקס laminin-5-עשיר (נגזר 804G תאים כמו descriמיטת התייחסות 29) לכל צלחת 3.5 סנטימטר. לפני ציפוי תאים, לשאוב את מטריקס ולשטוף המנה 3 פעמים עם מים דו-distillated סטרילי. אפשר צלחת לייבוש מתחת לארון זרימה למינרית במשך 5 דקות.
    2. בתוך בארון זרימה למינרית, להפיץ איים שהושג עם המדיום CMRL לתוך 15 מ"ל צינור (ים). צנטריפוגה ב 272 XG במשך 5 דקות.
    3. לשאוב supernatant, ולאחר מכן resuspend גלולה ב 1 מ"ל של תמיסת מלח שנאגרו פוספט של סטרילית Dulbecco (DPBS) מחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס ללא סידן ומגנזיום. צנטריפוגה ב 272 XG במשך 5 דקות.
    4. לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה ב 1 מ"ל של DPBS.
    5. כדי לספור את המספר הכולל של איים, pipet 10 μl ההשעיה איון 1 מ"ל לתוך 3.5 ס"מ מנה חדשה. ספירת איים על ירידה של כ -10 μl מתחת למיקרוסקופ ומתוך זה לחשב את המספר הכולל של איים ההשעיה איון 1 מ"ל. להוסיף 14 מ"ל של DPBS ו צנטריפוגות ההשעיה תא אחד יותרזמן קצר 272 XG במשך 5 דקות.
    6. עבור תא דיסוציאציה איון, לשאוב supernatant ולהוסיף 1 מ"ל של תמיסת ניתוק התא לתקופה מקסימלית של 1,000 ושווי איון (IEQ). מניחים את הצינור בתוך אמבט מים ב 37 ° C בעדינות מערבבים את איים על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים בכל דקה, במהלך 6-10 דקות.
      הערה: כדי לבדוק את איכות העיכול, pipet ירידה של 2 μl של השעיה על זכוכית שקופית ולבדוק תחת מיקרוסקופ שכל התאים מופרדים היטב, וכי אין כפילויות או גוש תאים נותרו.
    7. עצור את התגובה על ידי הוספת 14 מ"ל של קר CMRL עם ספקים (10% בסרום שור העובר (FBS), 1% של dipeptide L-alanyl-L- גלוטמין, 1% פניצילין, סטרפטומיצין (P / S), 1% gentamycin, 1 פירובט נתרן%). צנטריפוגה ב 425 XG במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ולהוסיף 15 מ"ל של מדיום CMRL אל התא גלולה.
    8. Resuspend גלולה בנפח קטן של CMRL עם ספקים. ספירת התאים תחת מיקרוסקופ באמצעות hemocytoמטר, להתאים את עוצמת הקול CMRL כדי להשיג ריכוז התא של ~ 650, 000 תאים / מ"ל.
    9. Pipet 3 מופרדים טיפות של 100 μl כל מן ההשעיה תא התפזרו שהושגו בשלב 1.1.8 בצלחת 3.5 ס"מ מצופה מראש עם laminin.
      הערה: תאים לצרף צלחת ב כ -24 שעות.
    10. דגירת תאים (איור 1 א) בתוך חממה בתרבית רקמה על 37 מעלות צלזיוס בתא לח. שינוי המדיום של תא טיפות כל 2-3 ימים על ידי aspirating 100 μl מכל טיפה וטיפה והחלפתו הנפח הזהה של מדיום חדש.
  2. תרבות myoblast ראשונית אדם ומבחין לתוך myotubes
    1. דגימת רקמה, בידוד תא בלווין תרבות myoblast
      הערה: ביופסיות שריר התקבלו מהקבוצה של אטיין Lefai (INSERM, ליון, צרפת) 19.
      1. לטהר myoblasts השלד הראשוני בהתאם לנוהל שתואר לעיל 30.
    2. התמיינות pmyoblasts האדם rimary לתוך myotubes
      1. קח בקבוקון אחד (1 x 10 6 תאים) של myoblasts האנושי מאוחסן בחנקן נוזלי להפשיר תאים במהירות על ידי הצבת את הבקבוקון למשך 30 שניות עד 1 דקות באמבט מים ב 37 ° C עם תסיסה.
      2. Pipet התאים (1 מ"ל) לתוך 24 מ"ל של מדיום הגידול מורכב HAM F-10 השלימו עם 20% FBS, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו- B. amphotericin 0.2%
      3. צנטריפוגה 5 דקות ב 150 x ז.
      4. הסרת תאים supernatant ו resuspend עם 15 מ"ל של מדיום הגידול טריים לכל 2.5 x 10 5 תאים.
      5. פלייט לפחות 2.5 x 10 5 תאים לכל בקבוק חסיד F75. שמור את myoblasts חממת תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
      6. לאחר התאים מגיעים 60-80% confluency, לנתק את התאים עם טריפסין-EDTA 0.05% למשך 1-2 דקות צלחת אותם ב 2 מ"ל של מדיום הגידול על מנות חסיד 3.5 ס"מ פטרי.
      7. לאחר שהגיע למפגש, הסר את מדיום הגידול.
      8. הפעל את פרוטו הבידולcol של myoblasts האדם לתוך myotubes ידי culturing אותם 2 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 1 גרם / ליטר של גלוקוז, 2% FBS, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו -0.2% amphotericin B (בינוני בידול) חממת תא 37 ° C ו 5% CO 2. שנה את בינונית כל 2 עד 3 ימים.
        הערה: myotubes בדרך כלל נוצר תוך 7-10 ימים.
      9. בדוק התמיינות תאים שריר מתחת למיקרוסקופ (איור 2 א) על ידי התבוננות היתוך של myoblasts לתוך myotubes polynucleated 19.

2. RNA התערבות קטנה (siRNA) Transfection

  1. siRNA Transfection של תאי איילט אנוש
    הערה: פרוטוקול transfection מתבצע טיפות של 100 μl ביום הבא לאחר ניתוק התא (שלבים 1.1.1-1.1.10).
    1. לשאוב 100 μl של המדיום CMRL מכל טיפה וטיפה ולהחליפה נפח זהה של בינוני Essential מינימלי ללא בסרום (MEM) 2 hrלפני transfection ידי pipetting.
    2. להכין תערובת MEM המבוסס של מגיב transfection ו -50 ננומטר של היעד siRNA (siClock) או 50 ננומטר של ללא מיקוד siControl פי הוראות היצרן.
      1. לקבלת מנה אחת עם 3 טיפות להכין שני צינורות 1.5 מ"ל עם 200 μl של כל MEM.
      2. הוסף אחד של צינורות אלה 4 μl של מגיב transfection.
      3. הוסף את μl צינור 1 השני של של פתרון המניות siRNA המתאים (20 מיקרומטר).
      4. להתסיס שתי אלה צינורות לאט על שייקר מסלולית במשך 5 דקות ולאחר מכן מערבבים את התוכן של הצינורות יחד ו להתסיס במשך 20 דקות יותר.
    3. לשאוב 100 μl של ממ מכל טיפה וטיפה ולהחליפה באותו נפח של תערובת transfection שהושגו בשלב הקודם על ידי pipetting.
    4. החלף את פתרון transfection עם מדיום CMRL לאחר 4 שעות של דגירה על 37 מעלות צלזיוס. חזור על שלבים 2.1.1-2.1.3 למחרת מחדש transfection התא.
  2. siRNA Transfection של myotubes אנוש
    1. לפני transfection, להחליף את מדיום (ראה שלב 1.2.2.8) עם 2 מ"ל של מדיום בידול טריים לכל 3.5 ס"מ פטרי צלחת.
    2. בתוך צינור 1.5 מ"ל סטרילי, להכין תערובת של 20 ננומטר siRNA (siControl או siClock), אשר תואמת 2.4 μl של פתרון siRNA 20 מיקרומטר, ו -12 μl של מגיב transfection מדולל 100 μl של מדיום בידול. דגירה הפתרון בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עם תסיסה עדינה.
    3. תאים Transfect עם 114.4 μl של תמהיל siRNA לכל 3.5 ס"מ פטרי תאים בצלחת ומניחים בתוך אינקובטור בתרבית רקמה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 למשך 24 שעות.

3. הקלטה פליטת אור היממה לטווח ארוך רציף הנערכת במקביל להערכת הפרשת הורמון בתאים ראשוניים אדם חי

  1. היכרות עם כתבי פליטת אור יממה לתוך תאים ראשוניים אדם על ידיתמרת lentiviral
    הערה: כל הנהלים עם חלקיקי lentiviral חייבים להתבצע במתקן ברמה 2 בטיחות ביולוגי לנקוט אמצעי זהירות נוספת לעבודה עם סוכנים המהווים סכנה פוטנציאלית מתונה לאנשים ואיכות הסביבה.
    1. הכן חלקיקים lentiviral הכתב על ידי שיתוף transfecting וקטור pLenti6.4 עניין / R4R2 / V5-DEST / Bmal1 לוק או pLV156-Per2-dLuc (המכונה Bmal1-לוק Per2-לוק, בהתאמה,) פלסמיד 31 עם וקטורים lentiviral pMD2G ו psPAX לתאים 293T בשיטת polyethylenimine (עבור נוהל מפורט ראה התייחסות 16).
    2. לכיל את חלקיקי lentiviral שהושגו (פרטים על טיטרציה ניתן לקבל http://lentilab.unige.ch/). עבור ניסויים נוספים, השתמש lentiviruses עם טיטר החל אפריל 10 - מאי 10 יחידות transducing [TU / μl].
    3. מאכל מקום עם תאי איון אדם או myoblasts האדם (ב 30-50% confluency) בתוך תא הזרימה למינריתet ולהחליף בינוני עם 2 מ"ל של מדיום חדש CMRL בתוספת (ראה שלב 1.1.7) או מדיום הגידול (ראה שלב 1.2.2.2), בהתאמה.
    4. חישוב ריבוי זיהום (משרד הפנים) (חלקיקים זיהומיות כלומר (transducing יחידות) / מספר התאים).
    5. Transduce תרבות התא הראשונית על ידי pipetting פתרון lentivirus כדי בצלחת כדי לקבל משרד פנים = 3 (למשל, עבור 65,000 תאים מצורפים להוסיף 3 μl של פתרון הווירוס עם כייל של 6.5 x 10 -4 עד 100 ירידה בינונית μl).
    6. דגירה לילה חממה בתרבית רקמה. שנה בינונית למחרת.
      הערה: transduce תאי איון אדם לפחות 4 ימים לפני הקלטת פליטת אור על מנת להשיג ביטוי מספיק של לבנות את הכתב. Myoblasts הם transduced בשלב ההתרחבות, אז גדל מפגש, ובהמשך מובחן לתוך myotubes.
  2. במבחנת הסנכרון של תאים ראשוניים אדם
    1. להוסיף 10 מיקרומטר של מפעיל cyclase adenylyl ב 2 מ"ל של מדיום לכל 3.5 ס"מ פטרי צלחת המכילה תאים ראשוניים transduced בעבר בשלב 3.1.5.
    2. דגירה של 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס חממת תרבית תאים.
    3. שינוי המדיום המכיל את מפעיל cyclase adenylyl עם 2.5 מ"ל של המדיום הקלטה המכיל 100 מיקרומטר לוציפרין.
      הערה: עבור תאים איון אדם להשתמש CMRL בתוספת 10% FBS, 1% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycin; עבור myotubes האדם להשתמש פנול אדום - DMEM חינם עם 1 גרם / גלוקוז L בתוספת 2% FBS, 2% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו- B. amphotericin 0.2%

4. הערכה מקבילה של הקלטת פליטת אור יממה ופרופילי הפרשת הורמון בתאים ראשוניים פרשת אדם המסונכרן

  1. הגדרה לטווח ארוך קונסטנט Perifusion הקלטת פליטת אור עבור תאים ראשוניים אדם.
    הערה: כאשר פסקים עובדיםIDE בארון זרימה למינרית, נקו את כל משטחי מגע ולהגביל חשיפה של תרבויות או בינוני עד באוויר כדי למנוע זיהום.
    1. כדי להכין את המדיום perifusion, להוסיף 100 מיקרומטר של luciferin למדיום.
      הערה: עבור תאים איון אדם להשתמש CMRL בתוספת 10% FBS, 1% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 1% gentamycin; עבור myotubes האדם להשתמש פנול אדום - DMEM חינם עם 1 גרם / גלוקוז L בתוספת 2% FBS, 2% L-alanyl-L- גלוטמין dipeptide, 1% P / S, 0.5% gentamycin ו- B. amphotericin 0.2%
    2. בתוך בארון זרימה למינרית, לפתוח את 3.5 ס"מ מנות המכיל את בתרביות תאים ראשוניים transduced, טרנספקציה מסונכרן (תאים איון או myotubes) כפי שתואר לעיל. הכנס כמוסים מתכתי סטרילי (שפותח בבית) (איור 1B2) לתוך מנות 3.5 סנטימטרים המצוידות זרם סיליקון / צינורות חיבור בזרימה (איור 1B1 / B5).
    3. מניחים את הכלים על פלטפורמת והמדידה l 37 ° Cight חזק חממה. תקן את הכלים לפלטפורמה באמצעות מתאם screwable (איור 1B3). הכנס את צינורות זרם / בזרימה של מערכת perifusion לתוך צינורות סיליקון המתאימים של הכובע (איור 1B1 / B5) ולהגדיר את המהירות של המשאבה בקצב זרימה של ~ 0.5 מיליליטר של מדיום לכל 1 hr.
    4. פתח את שפותחו באופן עצמי התוכנה בטפטוף-biolumicorder שמתעדת את אותות מהצינור מכפיל (PMT) גלאי. בחר את הספרייה שבה הנתונים יאוחסנו ולהתחיל פליטת אור רציף הקלטת כל מנה על ידי לחיצה על הסמל "התחל".
      הערה: לחילופין לתוכנה בטפטוף-biolumicorder, תוכניות אחרות (למשל LumiCycle), שניתן להשתמש בהם כדי להקליט אותות גלאי PMT.
    5. מניחים צלחות תרבית הרקמה 6-גם סטרילי בתיבה אוסף על הקרח.
    6. פתח את תוכנת בקרת שולט העיתוי של הבורר האוטומטי בין הבארות האוספות. הגדרת זמן window של אוסף בינוני (sec). התחל אוסף של המדיום יצוא כל 4 שעות (14,400 שניות; ~ 2 מ"ל לכל נקודת זמן) על ידי לחיצה על סמל "לרוץ".
    7. העבר ולמדוד את מדיום יצוא מכל אוסף היטב לתוך 2 סטרילי מ"ל הצינורות על ידי pipetting. שמור צינורות במקפיא -20 מעלות צלזיוס לפני תחילת השלב הבא. חזור על שלבים 4.1.5-4.1.6 כל 24 שעות.
    8. עצור את הקלטת פליטת אור ואת הזרימה הבינונית על ידי לחיצה על הסמל "עצור" על התוכנה המתאימה. הסר את הפקקים המתכתיים לשאוב את המדיום שיורית מן הכלים.
    9. על מנת לנרמל את ערכי חלבון המופרש שהושגו בניסויים שונים, או לחלץ DNA (נורמליזציה לפי תוכן הדנ"א הגנומי myotubes 19), או להוסיף 1 מ"ל של חיץ חומצה אתנול תמוגה (נורמליזציה לפי תוכן הורמון הכולל תאים איון 18) אל כלי אוכל.

5. איילט הורמון ו Myokine מדידת רמות היצואבינוני מתקבל על ידי Perifusion בלתי פוסק של תאי האנדוקרינית ראשוני אדם

  1. אִינסוּלִין
    1. לכמת רמות אינסולין בזאלי במדיום היצוא מהעת-נקודות הנצברות באמצעות assay immunosorbent enzyme-linked אינסולין אנושי ערכה (ELISA) בעקבות הוראות היצרן.
    2. לנרמל את נתוני הנפח המוחלט של מדיום שנאסף בכל טוב ואל תוכן האינסולין הכולל, מופק בתאים שטופלו בחומצה-אתנול בסוף הניסוי (שלב 4.1.9) 18.
  2. Interleukin-6 (IL-6)
    1. לכמת הבסיס IL-6 רמות בטווח הבינוני היצוא מהעת-נקודות הנצברות באמצעות ערכת ELISA אדם IL-6 בהתאם להוראות היצרן.
    2. לנרמל את נתוני הנפח המוחלט של מדיום שנאסף כל טוב לתוכן הדנ"א הגנומי בסוף הניסוי (שלב 4.1.9).

6. ניתוח בסיס נתוני יממה עבור Bioluminesדעך ופרופילי הפרשת הורמון

  1. ניתוח פליטת אור
    1. לנתח פרופיל פליטת אור באמצעות התוכנה המצורפת 19.
  2. ניתוח JTK מחזור
    1. לנתח פרופילי הפרשת הורמון ותוצאות הקלטת פליטת אור באמצעות אלגוריתם JTK_CYCLE 32.
    2. הגדר את רוחב תקופת היממה ב 20-24 שעות.
      הערה: במידה תנאי הניסוי נרשמו במקביל, ניתוח סטטיסטי לזווג ניתן לבצע כדי להשוות את הניסויים.
  3. ניתוח CosinorJ
    1. לחלופין, לנתח את הפרשת הורמון ופרופילי פליטת אור יממה באמצעות תוכנת CosinorJ 28.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת הפרשת הורמון איילט עם יממה במקביל הקלטת פליטת אור מן Perifused איילט אדם תאים

לאחר מתן אפיון מולקולרי ראשון של השעון הביולוגי, פעיל בתאי איון אדם 16, אנו שמטרתה הבוחן את השפעת שיבוש שעון על תפקוד איון שעתוק 18. הקמנו פרוטוקול transfection siClock יעיל בתאי איון אדם מפוזרים (ראה פרוטוקול לפרטים נ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההגדרות ניסיון המתואר כאן מורכבות משלוח lentiviral של כתבי פליטת אור יממה לתוך תאים ראשוניים אדם מתורבתים, ואחריו הסנכרון הבא במבחנת הקלטה רציפה של פליטת אור במשך כמה ימים, וניתוח מקביל של הפרשת הורמון ידי אותם תאים. הם מייצגים גישה יעילה עבור חקר מנגנונים מולקולריים והיבטים תפקודיים של שעוני יממת תאים ראשוניים אדם.

איכות החומר התורם היא נושא חשוב להכנת תרביות רקמה העיקרית קיימא. איכות איי אדם יש להעריך ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים עמיתינו מאוניברסיטת ז'נבה: ז'אק פיליפ עבור הערות בונות על עבודה זו, Ueli Schibler לעזרה יסולא בפז עם התפתחות מערכת perifusion ועבור השראה מדעית, אנדרה ליאני עבור לאחר יזום תכנון, ייצור וביצוע של מערכת זלוף, Lesa-טכנולוגיה בע"מ החברה על הסיוע במערכת perifusion לטפטף-biolumicorder פיתוח תוכנה, ג'ורג Severi לסיוע עם הניסויים perifusion, אורסולה Loizides-מנגולד לקריאת כתב היד באופן ביקורתי, ואן-מארי מכלוף להכנות lentivirus ; אטיין Lefai, סטפני Chanon ויוברט וידאל (INSERM, ליון) להכנת myoblasts העיקרי האדם; וכדי דומניקו בוסקו והתיירים Berney (מרכז השתלות איילט אדם, בית החולים האוניברסיטאי ז'נבה) למתן איי אדם. עבודה זו מומנה על ידי מס 'גרנט השוויצרי הקרן הלאומית למדע 31003A_146475 / 1, Sinergia השוויצרי הקרן הלאומית למדע מענק מס 'CRSII3-154405, romande Fondation לשפוך Diabete sur la משוכלל ונדיר, בו Hjelt קרן, et Fondation ארנסט לוסי Schmidheiny, וסוסייטה Académique דה ז'נב (CD).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Trypsin-EDTAInvitrogen25300-054לעיכול ביופסיית שרירים
DPBS ללא סידן ללא מגנזיוםInvitrogen14190-094
HAM F-10Invitrogen41550-021לתרבית מיובלסטים
FBSInvitrogen10270תוסף לתרבית בינונית
פניצילין-סטרפטומיציןסיגמאP0781-100תוספת למדיום תרבית
גנטמיציןאקסון A1492.0001תוסף למדיום תרבית
FungizoneInvitrogen15290-026אמפוטריצין B, תוספת למדיום תרבית
DMEM 1 גרם/ליטר גלוקוז + Na פירובט + גלוטמקס Invitrogen21885-025לתרבית myotubes
DMEM 1 גרם/ליטר גלוקוז -Na Pyruvate - glutamaxInvitrogen11880-028מדיום הקלטה עבור LumiCycle
GlutamaxInvitrogen35050-028L-alanyl-L-glutamine dipeptide, תוספת למדיום הקלטה
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-104פתרון ניתוק תאים, לדיסוציאציה של תאי איים
CMRLGibco21530-027מדיום תרבית לתאי איים
נתרן פירובטGibco11360-039תוסף למדיום תרבית
15 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן בבהירות גבוההפלקון352096
F75 בקבוקבז BD 353136
צלחת פטרי 3.5 ס"מ BD Falcon353001
FoskolinSigmaF6886Adenylyl cyclase activator, המשמש לסנכרון
LuciferinProlume LTD260150תוספת למדיום הקלטה
OptiMEM Invitrogen51985-026סרום מדיום חיוני מינימלי (MEM) המשמש להעברת תאי איים אנושיים
RNAiMAX ליפופקטמין מגיבInvitrogen13778-150מגיב טרנספקציה
HiPerFect מגיבQiagen301705מגיב טרנספקציה
ON-TARGET בתוספת siCLOCK smartpool DharmaconL-008212-00
ON-TARGET בתוספת siRNA לא ממוקד #1 (siControl)DharmaconD-001810-01
DNeasy Blood & ערכת טישו Qiagen69504עבור מיצוי DNA של צינורות
שריר ערכת RNeasy Plus Mini Qiagen74104למיצוי RNA של צינורות שריר
QIAמגרסה Qiagen79654למיצוי RNA של myotubes
2 מ"ל צינורות איסוףAxygen311-10-051לאיסוף המדיום עם
צלחת תרבית רקמות פריפוזיה, 6 בארותBD Falcon 353046לאסוף את המדיום עם
ערכת פריפוזיה RNeasy Plus Micro Qiagen74034למיצוי RNA של האי
ערכת ELISA מיידית אנושית IL-6 eBioscience88-7066-22
ערכת אינסולין אנושי MercodiaMercodia10-1113-01
חומצה הידרוכלורית, דקה, 37%, p.a.Acros organics124630010משמש להכנת מאגר ליזה (375 מ"ל אתנול + 7.5% HCl + 117.5% H2O)
אתנול (>99.8%)Fluka Analytical02860-1Lמשמש להכנת מאגר ליזה (375 מ"ל אתנול + 7.5% HCl + 117.5% H2O)
איים אנושיים למעבדותProdo
<חזק>שם<חזק>חברה<חזק>מספר קטלוגי><חזק>הערות
><חזק>ציוד:
צנטריפוגההראוסמגפוגה 1.0R
אמבט מיםVWR1112A  ב-37 מעלות;
מכסה המנוע של תרבות טיסומהיר יותר חממת תרבית SafeFastElite
TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 ב-37 מעלות; C, ללא מים עקב התקנת LumiCycle
חממת תרבית TissuHeraeusHeraCell 1505% CO2 ב-37 מעלות; C, ללא מים עקב התקנת LumiCycle
חממת תרבית TissuThermo ScientificHera Cell 150i5% CO2 ב-37 מעלות; C
ShakerHeidolph InstrumentsUnimax 1010לתסיסה של תערובת siRNA
LumiCycleActimetrics
תוכנת LumiCycleActimetrics
CosinorJEPFLזמין בחינם בכתובת: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/
Rheodyne titan MX ERC GmbHControl השולטת בתזמון המתג האוטומטי
ללא מגיב מחקר תוכנת תוכנת

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
  2. Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
  3. Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
  4. Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
  5. Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
  6. Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
  7. McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
  8. Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
  9. Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
  10. Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
  11. Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
  12. Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
  13. Hastings, M., O'Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
  14. Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
  15. Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
  16. Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
  17. Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
  18. Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
  19. Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
  20. Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95(2015).
  21. Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
  22. Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
  23. Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
  24. Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
  25. Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
  26. Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
  27. Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
  28. Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
  29. Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
  30. Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049(2015).
  31. Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023(2008).
  32. Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
  33. Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
  34. Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
  35. Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
  36. Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376(2010).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

siRNA

מאמרים קשורים