כלים כדי ללמוד את התפקיד של HMGB1 חלבון אדריכלי בעיבוד בסילוף Helix, DNA ספציפיים באתר Interstrand Crosslinks

סיכום

ניתן להשיג נזק ממוקד ל-DNA על ידי קשירת גורם מזיק ל-DNA לאוליגונוקלאוטיד היוצר טריפלקס (TFO). באמצעות TFOs ששונו, ניתן לחקור אסוציאציות חלבון ספציפיות לנזק ל-DNA ושינוי טופולוגיית DNA בתאים אנושיים על ידי שימוש במבחני משקעים חיסוניים של כרומטין שונה ומבחני סלילת על של DNA המתוארים כאן.

תקציר

קבוצת תיבת 1 ניידות גבוהה (HMGB1) חלבון הוא חלבון אדריכלי הלא היסטון כי הוא מעורב בויסות תפקידים חשובים רבים בגנום, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, ותיקון דנ"א. HMGB1 נקשר מעוות מבחינה מבנית DNA עם זיקה חזקה יותר מאשר ב-דנ"א הקנונית. לדוגמה, מצאנו כי HMGB1 נקשר ל- DNA interstrand crosslinks (ICLs), אשר קוולנטית לקשר בין שני גדילי הדנ"א, לגרום לעיוות של הסליל, וכל עוד יוסיפו מתוקנות יכול לגרום מוות של תאים. בשל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, כמה סוכנים וישכנע כיל משמשים כיום תרופות כימותרפיות במרפאה. בעוד יוצרי כיל סוכנים להראות העדפות עבור רצפים בסיס מסוים (למשל, 5'-TA-3 "הוא האתר crosslinking המועדף psoralen), הם בעיקר לגרום נזק לדנ"א באופן בלתי מבוקר. עם זאת, על ידי קוולנטית צימוד הסוכן וישכנע כיל על oligonucleotide יוצרי טריפלקס (TFO), אשר נקשר ל- DNA בתוך ספציפי ברצףבאופן, נזק לדנ"א ממוקד יכולה להיות מושגת. כאן, אנו משתמשים TFO מצומדות קוולנטית על 'קץ 4'-hydroxymethyl-4,5' 5, 8-trimethylpsoralen (HMT) psoralen ליצור כיל אתר ספציפי על פלסמיד מוטציה-הכתב להשתמש ככלי ללמוד את שינוי, עיבוד, ותיקון אדריכלי של נגעים DNA מורכב על ידי HMGB1 בתאים אנושיים. אנו מתארים טכניקות ניסוי להכין ICLs TFO-מכוון על פלסמידים כתב, וכדי לחקור את הקשר בין HMGB1 עם ICLs המכוונת TFO בהקשר הסלולר באמצעות מבחני immunoprecipitation הכרומטין. בנוסף, אנו מתארים מבחני supercoiling DNA להעריך שינוי אדריכלי מסוים של דנ"א פגום על ידי מדידת כמות פניות superhelical הציג על פלסמיד psoralen-crosslinked ידי HMGB1. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אחרים המעורבים בעיבוד ותיקון ICLs TFO מכוונת או נזק לדנ"א ממוקדים אחרים בכל שורת תאים של עניין.

מבוא

טריפלקס יוצרי oligonucleotides (TFOs) לאגד דופלקס DNA בצורה רצף ספציפי באמצעות מליטה מימן Hoogsteen ליצירת מבנים משולשת הסליל ^1-5. הטכנולוגיה טריפלקס נעשה שימוש כדי לחקור מגוון של מנגנונים biomolecular, כגון שעתוק, תיקון נזק DNA, גן מיקוד (הנסקרת ב אזכור ^6-8). TFOs נעשה שימוש נרחב כדי לגרום נזק לאתר ספציפי על פלסמידים כתב ^9,10. המעבדה שלנו ואחרים השתמשו בעבר TFO, AG30, קשור מולקולה psoralen לגרום crosslinks interstrand DNA ספציפיים לאתר (ICLs) בגן supF על פלסמיד pSupFG1 ^5,10-12. ICLs הם ציטוטוקסיים מאוד כשהפצעים קוולנטית crosslink שני גדילי דנ"א, וכל עוד יוסיף מתוקן, יכול לחסום שעתוק גנים ומסכל מכונות שכפול הדנ"א ^13,14. בגלל הפוטנציאל ציטוטוקסיות שלהם, סוכנים וישכנע כיל שימשו תרופות כימותרפיות לטיפולשל סרטן ומחלות אחרות ^15. עם זאת, העיבוד ותיקון ICLs בתאים אנושיים אינו מובן היטב. לפיכך, הבנה טובה יותר של המנגנונים המעורבים בעיבוד של ICLs בתאים אנושיים עשוי לעזור לשפר את היעילות של משטרי כימותרפיות מבוססי כיל. TFO-induced ICLs ביניים תיקון שלהם יש פוטנציאל לגרום לעיוותים מבניים משמעותיים סליל הדנ"א. עיוותים כאלה הן מטרות סבירות עבור חלבונים אדריכליים, אשר נקשרים ל- DNA המעוותת עם זיקה חזקה יותר מאשר ה- DNA דופלקס B-צורה הקנונית ^16-20. הנה, למדנו את שיוכה של חלבון אדריכלי בהיקף הנרחב ביותר, HMGB1 עם ICLs בתאים אנושיים באמצעות immunoprecipitation הכרומטין (שבב) מבחנים על פלסמידים-crosslinked psoralen וזיהיתי לחיקוי עבור HMGB1 בויסות את הטופולוגיה של DNA פלסמיד-crosslinked psoralen ב אנושי lysates תאים סרטניים.

HMGB1 הוא שופע מאוד בכל מקום בגוף לידי ביטוי שאינו שלוהטון חלבון אדריכלי הנקשרת דנ"א פגום מצעים DNA מובנים לחילופין עם זיקה חזקה יותר מאשר DNA B-הצורה הקנונית ^17-20. HMGB1 מעורב בתהליכים מטבוליים כמה DNA, כגון שעתוק, שכפול הדנ"א, תיקון דנ"א ^16,21-23. אנחנו הוכחנו בעבר כי HMGB1 נקשר TFO המכוונת ICLs במבחנה עם זיקה גבוהה ^20. יתר על כן, אנו הוכחנו כי חוסר HMGB1 הגדיל את עיבוד מוטגנים של ICLs TFO-ביים HMGB1 מזוהה תיקון כריתת נוקלאוטיד (NER) שיתוף גורם ^23,24. לאחרונה, מצאנו כי HMGB1 קשור TFO המכוונת ICLs בתאים אנושיים והגיוס שלה נגעים כאלה תלוי חלבון NER, XPA ^16. Supercoiling השלילי של DNA הוכח לקדם את ההסרה היעילה של נגעי DNA על ידי נר ^25, ומצאנו כי HMGB1 גורם supercoiling השלילי מועדף על יציקה המכילה כיל מכוון TFOמצעים באמצע (יחסית מצעים פלסמידים שאינם פגומים) ^16, מתן הבנה טובה יותר של פוטנציאל התפקיד (ים) של HMGB1 בתור גורם שיתוף NER. העיבוד של ICLs לא מובן לחלוטין בתאים אנושיים; וכך, טכניקות המבחנים שהפותחים מבוססות על הכלים המולקולריים המתוארים כאן יכולים להביא לזיהויו של חלבונים נוספים המעורבים תיקון כיל, אשר בתורו עשוי לשמש מטרות תרופתיות כפי שאפשר לנצל כדי לשפר את היעילות של כימותרפיה לסרטן.

הנה, גישה יעילה כדי להעריך את היעילות של היווצרות כיל TFO מכוונת ב- DNA פלסמיד על ידי denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose נדונה. יתר על כן, באמצעות פלסמידים המכילים את ICLs TFO-המכוון, טכניקות כדי לקבוע את הקשר של HMGB1 עם פלסמידים פגועים כיל בהקשר הסלולר באמצעות מבחני שבב שונים תואר. בנוסף, שיטה קלילה ללמוד שינויי טופולוגי הציגו ידי הדואר אדריכלי חלבון HMGB1, במיוחד על מצעים פלסמיד פגועי כיל lysates התא האנושי נקבע על ידי ביצוע מבחני supercoiling באמצעות דו מימדי ג'ל אלקטרופורזה agarose. הטכניקות המתוארות ניתן להשתמש כדי לקדם את ההבנה של המעורבות של תיקון דנ"א וחלבונים אדריכליים בעיבוד של ניזק לדנ"א ממוקד על פלסמידים בתאים אנושיים.

אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים להקמת ICLs psoralen אתר ספציפי TFO-מכוון על פלסמיד דנ"א, וצ'יפ פלסמיד עתידי supercoiling מבחני לזהות חלבונים מקשרים עם הנגעים, וחלבונים אשר משנים את הטופולוגיה DNA, בהתאמה. מבחנים אלה יכולים להיות שונים כדי לבצע עם סוכנים מזיקים אחרים לדנ"א, TFOs, מצעים פלסמיד, שורות תאים יונקות עניין. למעשה, הראינו כי יש לפחות פוטנציאל אחד זיקה ייחודית גבוהה TFO מחייב אתר בתוך מכל גן מבואר בגנום האנושי ^26. אֵיךפעם, לבהירות תיארנו טכניקות אלה לשימושם של psoralen מצומדות TFO ספציפיים (pAG30) על פלסמיד מוטציה-עיתונאי ספציפי (pSupFG1) בתאים אנושיים U2OS כפי שכבר מנוצל מוקהרג'י & ואסקז 2016 ^16.

פרוטוקול

1. הכנת ICLs מכוונת TFO על מצעים פלסמיד

1. דגירה כמויות equimolar של pSupFG1 פלסמיד ^10,11 DNA (DNA פלסמיד 5 מיקרוגרם הוא נקודת התחלה טובה) עם psoralen מצומדות TFO AG30 ב 8 μl של חיץ מחייב טריפלקס [גליצרול 50%, 10 מ"מ טריס (pH 7.6), 10 מ"מ MgCl _2] ו dH ₂ O לנפח סופי של 40 μl בצינור ענבר. מערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירת התגובה על אמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות.
2. לחמם את מנורת UVA כדי להבטיח פלט מלוא העוצמה. מניח את התגובה טריפלקס על סרט פרפין, ומניח את סרט פרפין על קרח תחת מנורת UVA (365 ננומטר). מקום מסנן מיילר בין מנורת התגובה.
3. UVA מקרין על מינון כולל של 1.8 J / cm ^2. אחסן את הדגימות ב 4 ° C לשימוש נוסף.
   זהירות: תלבש משקפי מגן נאותים ובגדים עם הקרנת UVA.
4. Linearize 200 ננוגרם של פלסמיד מוכן לעיל עם מחדשאנזים הִצָרוּת R1 אקו בהיקף כולל 20 μl באמצעות היצרן סיפק חיץ 10x. חום לפגל האנזים במשך 20 דקות ב 65 מעלות צלזיוס. ספין את הדגימות למשך 10 דקות ב XG 10,000 ולאחסן ב 4 ° C..
5. כן 50x חיץ אלקליין [1.5 M NaOH, 50 חומצת המ"מ Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)]. הוסף 0.5 מ"ג של agarose 50 מ"ל DH ₂ O. מרתיחים לפזר את agarose ולמקם אותו באמבט מים C ° 50.
6. לאחר הטמפרטורה של agarose מומס הוא עד 50 מעלות צלזיוס, להוסיף 1 מ"ל של חיץ 50x אלקליין, לערבב אותו ואז לשפוך את הג'ל לתוך מגש ג'ל. לאפשר זמן הג'ל לחזק בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
7. הוסף 4 μl של 0.5 מ 'EDTA אל 20 μl של דגימת DNA לינארית דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הוסף חוצץ טעינת ג'ל אלקליין 6x (300 מ"מ NaOH, 6 מ"מ EDTA, 18% (w / v) פוליסכריד משקל מולקולרי גבוה, 0.06% Bromocresol הירוק ב DH ₂ O) על דגימות וכדי סולם DNA 1 kb.
   הערה: חשוב להשתמש חיץ טעינת ג'ל 6x אלקליין, אנא ראה דיון.
9. דגימות טענו על ג'ל בחדר הקר ולהפעיל לילה חיץ אלקליין 1x (12-16 שעות) בשעה 3.2 וולט לסנטימטר. לאחר דגימות נכנסו ג'ל, מניחים צלחת זכוכית על גבי ג'ל כדי למנוע ממנה צף.
10. לנטרל את דגימות על ידי השריית את הג'ל במאגר נטרול [1 M טריס-Cl (pH 7.6), 1.5 M NaCl, 3 נתרן אצטט M (pH 5.2)] במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.
11. הכתם ג'ל עבור DNA עם 4 μl של ברומיד ethidium 1% (EtBr) ב 50 מ"ל מים עבור שעה 1 בטמפרטורת החדר. Destain עם מים במשך 15 דקות. דמיינו את ה- DNA באמצעות מערכת הדמיה.
    זהירות: EtBr הוא mutagen חזק והוא יכול להיספג דרך העור. יש להימנע ממגע ישיר עם EtBr.

2. Transfection ו- Immunoprecipitation של מכוונת TFO כיל מוצרים המכילים פלסמידים בתאים אנושיים

1. פלייט 400,000 בתאי יונקים (למשל, U2OS oתאי steosarcoma) לכל 60 צלחת מ"מ הבינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עובר (FBS) ללא אנטיביוטיקה 24 שעות לפני transfection. תאים דגירה לילה בשעה 37 ° C עם 5% CO _2.
2. לפני transfection, תקשורת צמיחה חמה בופר פוספט (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. מומלץ לחמם את מגיב transfection לטמפרטורת החדר.
3. דגירת 30 μl של מגיב transfection עם 500 μl של תקשורת צמיחת 1x (תערובת 1) ו -2 מיקרוגרם של פלסמידים TFO מכוונות המכיל כיל 500 μl של תקשורת צמיחת 1x (תערובת 2) צינורות תחתיים עגול 14 מיליליטר נפרד עבור 10 דקות ב טמפרטורת חדר.
4. להוסיף תערובת 1 לערבב 2, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה. דגירה של 25-30 דקות בטמפרטורת החדר.
5. שטוף תאים פעמים עם PBS החם. מוסיף את תערובת transfection בצורת טיפה חכמה הפצה באופן שווה על פני הצלחת של תאים. הוסף 1 מ"ל של התקשורת צמיחה לצלחת ולהביא את נפח סופי 2 מ"ל. מערבבים אנחנוll. מניחים את הצלחות תרבות 37 ° C חממה עם 5% CO ₂ למשך 4 שעות.
6. החלף את המדיה עם התקשורת צמיחה 3 מ"ל בתוספת 10% FBS, דגירה נוספת עבור 16 שעות. אין להשתמש באנטיביוטיקה.
7. פנקו את התאים עם 80 μl של פורמלדהיד טריים 37% לכל צלחת לריכוז סופי של כ 1% ו דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בהיעדר אור.
   זהירות: פורמלדהיד הוא רעיל צריך להיות מטופלים על פי הוראות הבטיחות שלה. פורמלדהיד החשיפה יכול לגרום נזק לעור, לעיניים ולדרכי הנשימה.
8. להרוות crosslinking פורמלדהיד על ידי הוספת 300 μl של גליצין המצונן (מסופק ערכות זמינות מסחרי) לכל צלחת הדוגרים במשך 5 דקות. הסר את המדיה ולשטוף פעמיים עם PBS קר, ולאחר מכן לאסוף תאים על ידי גירוד ב 1 מ"ל צונן (4 ° C) PBS לתוך צינור microcentrifuge. שמור על דגימות קרח בכל עת.
9. כן כדורי תא על ידי צנטריפוגה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דק 't 13,400 XG באמצעות צנטריפוגות שולחן בקירור. Pipet את supernatant ומניח התא גלול על קרח.
10. הומוגנית resuspend גלולה ב 1 מיליליטר צונן (4 ° C) הצפה (מסופק ערכות זמינות מסחרי) דגירה על קרח למשך 10 דקות. מערבבים מדי פעם על ידי צינור היפוך. תאים גלולים כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
11. הומוגנית resuspend גלולה ב 1 מ"ל צונן (4 ° C) מאגר B (מסופק ערכות זמינים מסחרית) דגירה על קרח למשך 10 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך. תאים גלולה ידי צנטריפוגה כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
12. Resuspend התאים שוב 200 μl מקורר הצפת B. הוסף 2 μl של nuclease Micrococcal (MNase) ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. מערבבים התגובה מדי פעם על ידי מצליף את הצינורית. עצור את התגובה MNase על ידי הנחת הצינור על הקרח והוספת 40 mM EDTA. תאים גלולים כמו קודם (ראה שלב 2.9 לעיל).
13. תאים Resuspend ב 100 immunopr הכרומטין 1x μlחיץ ecipitation (שבב) חיץ (מסופק ערכות זמינות מסחרי) השלים עם מעכבי פרוטאז קוקטייל.
14. מניחים את התאים resuspended בתוך שפופרת microfuge בעלי קירות דקים. Sonicate הדגימות ידי צפת אותם על sonicator באמבט מים במשך 20 שניות ואחריו 20 דגירה שנייה על קרח. sonication חוזר על שלבי 9 פעמים כדי ליצור ~ 800-1,200 שברים נ"ב.
    1. עד 20 μl של דגימות sonicated להוסיף 3 μl 5 M NaCl ו 1 μl RNase א ומערבבים היטב על ידי vortexing ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. בהמשך לכך, להוסיף 2 μl proteinase K דגירה במשך שעה 2 ב 65 מעלות צלזיוס. לטהר את הדגימות באמצעות ערכת טיהור PCR. הפעל דגימות על ג'ל 1% agarose ולדמיין עם EtBr.
       הערה: עצמה המקסימלית של ה- DNA וכתוצאה מכך צריכה להיות או פחות מ -1,000 נקודות בסיס.
15. בשלושה צינורות נפרדים, להוסיף 30 μl של lysate בתוך שפופרת siliconized מראש צוננת ולאחר מכן להוסיף 70 μl של חיץ שבב 1x המצונן עם מעכבי פרוטאז הוסיפו. הוסף 1 μגרם של אימונוגלובולינים נגד G (IgG), H3 אנטי היסטון (כביקורת חיובית), או נוגדנים נגד HMGB1 אל צינורות בהתאמה. דגירת הלילה בחדר קר עם סיבוב רציף.
16. חרוזי החלבון G Resuspend הומוגנית בחדר הקר. הוסף 4 μl של חרוזי חלבון G לכל צינור דגירה במשך 2-4 אחר hr בחדר הקר עם סיבוב.
17. באמצעות מתלה מגנטית, גלולת החרוזים ולהסיר את supernatant. הוסף 200 μl חיץ 1x שבב מעורבבים עם מעכבי פרוטאז קוקטייל על הגלולה ולשטוף במשך 5 דקות בחדר הקר עם סיבוב. חזור על לשטוף פעמיים.
18. בצע אחת לשטוף נוסף עם חיץ 1x שבב מלח גבוה (המכיל 70 המ"מ NaCl).
19. Resuspend את הכדורים עם חיץ elution 160 μl (מסופק ערכות זמינות מסחרי) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם רוטציה למשך 30 דקות.
20. גלולת החרוזים ולאסוף את supernatant בצינור טרי. הוסף 6 μl של 5 M NaCl ו -2 μl של proteinase K, ו דגירה לילה בשעה 65מעלות צלזיוס.
21. לטהר את הדנ"א בעזרת ערכת טיהור מוצר PCR ו elute את ה- DNA באמצעות 50 μl DH ₂ O.
22. בצע PCR ¹⁶ תגובות באמצעות ערכות פריימר לאזור (ים) של עניין, ולפתור את המוצרים על ג'ל 1% agarose מוכתם EtBr.

Agarose ג'ל אלקטרופורזה 3. Assay Supercoiling ו -2 ממדי

1. הכן חיץ סינתזה תיקון דנ"א (45 מ"מ Hepes-KOH, pH 7.8; 70 מ"מ KCl; 7.4 מ"מ MgCl _2; 0.9 מ"מ DTT; 0.4 mM EDTA; 2 מ"מ ATP, 20 מיקרומטר dNTPs, גליצרול 3.4% ו -18 אלבומין מיקרוגרם שור) . חנות ב -80 מעלות צלזיוס. הפשרה על קרח לפני השימוש להוסיף 40 phosphocreatine מ"מ ו 2.5 מיקרוגרם פוספוקינאז קריאטין.
2. הכן 10x חיץ supercoiling [500 מ"מ טריס (pH 8.0), 500 מ"מ NaCl, 25 מ"מ ₂ MgCl, 1 mM EDTA], ולאחסן בטמפרטורת החדר.
3. Linearize 300 ננוגרם של DNA pSupFG1 פלסמיד supercoiled לחלוטין באמצעות 1 μl אני topoisomerase Vaccinia (5-15 U / μl) עם 1xחיץ supercoiling בריאקציה 10 μl. דגירה את התערובת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
4. להפשיר תמצית תא ללא הלה ²⁴ על קרח. כדי פלסמידים רגוע לחלוטין, להוסיף 25 μl הלה תא ללא לחלץ תיקון DNA חיץ סינתזה. לערבב היטב. הוסף 1 μl נוסף של Vaccinia topoisomerase שאני לתערובת, דגירה במשך שעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
5. לסיים את התגובות על ידי הוספת סודיום דודציל סולפט (SDS) (1% ריכוז סופי) ו proteinase K (0.25 מ"ג / הריכוז הסופי מ"ל). לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות.
6. עופרת ג'ל agarose 1% עם 1x טריס Borate EDTA חיץ (TBE). להוסיף צבע טעינת דנ"א לטעון את התגובות ישירות על גבי ג'ל לפחות זה מזה 4 נתיבים. הרץ את הג'ל במשך 8-10 שעות ב 2 V / ס"מ TBE 1x (מימד 1) בטמפרטורת החדר כדי לפתור את topoisomers.
   הערה: כן פתרון מניות 5x TBE ב 1 ליטר של DH ₂ O על ידי הוספת 54 גרם של טריס בסיס. 27.5 גרם של החומצה הבורית 20 מ"ל של 0.5 מ 'EDTA (pH 8.0).
7. כן 2 ליטר של 1xTBE עם 3 מיקרוגרם / מ"ל-פוספט chloroquine. משרים את הג'ל 200 מ"ל של פתרון זה עבור 20 דקות. מכסים את המגש ג'ל עם רדיד אלומיניום.
8. כדי electrophorese הג'ל במימד השני, להפוך את הג'ל 90 ° בצורה כיוון השעון ולהפעיל אותו במשך 4-6 שעות ב 2 V / ס"מ chloroquine המכיל 1x TBE לפתור את supercoils חיוביות ושליליות.
9. כתם ג'ל עם EtBr במשך שעה 1 על כיסא נדנדה. Destain ג'ל עם DH ₂ O למשך 15 דקות ולאחר מכן לדמיין את ההפצה התרמית של topoisomers באמצעות תרמי.

תוצאות

כינונה של כיל מכוון TFO הוא קריטי עבור המבחנים מבוססים פלסמיד, אשר משמשים כדי לחקור את התפקידים של חלבונים אדריכליים בעיבוד כיל בתאים אנושיים. Denaturing ג'ל אלקטרופורזה agarose הוא דרך קלילה כדי לקבוע את היעילות של היווצרות כיל מכוונת TFO. פלסמידים מחסה ICLs TFO מכוונת להגר עם ניידות איטי דרך מטריקס ג'ל agarose (איור 1 א ', מסלול 3) כשמשווים את פלסמידים שליטה בלתי-crosslinked (איור 1 א', מסלול 2). כימות densitomet...

דיון

ההיווצרות היעילה של ICLs TFO המכוונת תלויה בשני גורמים מכריעים: ראשית, רכיבי חיץ נכון (למשל, MgCl ₂₎ וזמן דגירה של TFO עם מצע DNA היעד שלה (תלוי הזיקה המחייבת של TFO למטרתה דופלקס, ועל ריכוזי בשימוש); ושנית, את המינון הנכון של UVA (365 ננומטר) הקרנה לגבש crosslinks psoralen ביעילות. היווצרות טריפלקס אופטימלית יכולה להיות מושגת על ידי שימוש TFOs מטוהר HPLC או ג'ל. זיהומי זיהום TFO עלולים להוביל מוצרי crosslinked לא רצויים, אשר עוד יכול לסבך את התוצאה הניסיונ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
5'HMT Psoralen-AG30	Midland Certified Reagent Co., מידלנד, טקסס	הזמנה מותאמת אישית	HPLC (או ג'ל) מטוהר
פשוט ChIP אנזימטי כרומטין IP ערכת	איתות תאים בע"מ.	9003	הפרוטוקול המוצע על ידי היצרן מותאם ל-IP של כרומטין ולא ל-IP של פלסמיד. נוגדני הבקרה IgG ו-H3 כמו גם חרוזי חלבון G ונוקלאז מיקרוקוקלי מסופקים על ידי היצרן.
GoTaq Green	Promega	M7122	PCR מאסטר מיקס
HMGB1 נוגדן Abcam		Ab18256
אשף ג'ל וערכת ניקוי PCR	Promega	A9281
מלח כלורוקווין-דיפוספט	סיגמא	C6628-50G	לאלקטרופורזה דו-ממדית של ג'ל אגרוז
EcoRI	ניו אינגלנד BioLabs	R0101S
GenePORTER transfection reagent	Genlantis	T201015
Vaccinia Topoisomerase I	Invitrogen	38042-024
Blak-Ray ארוך גל אולטרה סגול מנורה	Upland, CA	B 100 AP	UVA
מנורת EpiSonic רב תכליתי מעבד ביולוגי 1100	Epigentek	EQC-1100	סוניקטור אמבט
מים מסנן מיילר GE	בריאות מדעי החיים
Agarose	Sigma-Aldrich	A6111
BIO-RAD Chemidoc	BIO-RAD	XRS+	מערכת הדמיית DNA
Glycine	Fisher Scientific	BP381-500
37% פורמלדהיד	סיגמא-אולדריץ'	F8775-25ML	משמש לקישור צולב
Proteinase K	ניו אינגלנד Biolabs	P8107S
DMEM	ThermoFisher	11965092	מדיה לתרבית תאים
PBS	ThermoFisher	70013073	תרבית תאים
Trypsin-EDTA	ThermoFisher	25200056	תרבית תאים
ברומוקרסול ירוק	סיגמא-אולדריץ'	114-359	צבע טעינת DNA
צינורות סיליקון	פישר סיינטיפיק	02-681-320	צינור מיקרופוגה בעל שמירה נמוכה
Tris base	Fisher Scientific	BP152-1
חומצה בורית	Fisher Scientific	A74-1
EDTA	Fisher Scientific	BP24731
Photometer	InternationalLight Technologies	ILT1400-A	מדידת מינון UVA
<חזק>קווי תאים
אוסטאוסרקומה U2OS אנושית	ATCC	ATCC HTB-96	מתורבת על פי הספק המלצה
אדנוקרצינומה צוואר הרחם האנושית HeLa	ATCC	ATCC-CCL-2	מתורבת על פי הספק' s המלצה
פריימר קדימה פרוקסימלי	5′-gcc ccc ctg acg agc atc ac
פריימר הפוך פרוקסימלי	5′-tag tta ccg gat aag gcg cag cgg
פריימר קדימה דיסטלי	5′-aat acc gcg cca cat agc ag
פריימר הפוך דיסטלי	5′-agt att caa cat ttc cgt gtc gcc