Method Article

חזותי תדר Stromule עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

DOI:

10.3791/54692

⸱

November 23rd, 2016

 ,  , 
1Plant Gene Expression Center, Agricultural Research Service, USDA, 2Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתוארים פרוטוקולים לחקירת הדינמיקה של סטרומולים של כלורופלסט, הצינורות המלאים בסטרומה המשתרעים מפני השטח של כלורופלסטים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

סטרומולים, או "צינוריות מלאות סטרומה", הן הרחבות צרות וצינוריות מפני השטח של הכלורופלסט הנצפות באופן אוניברסלי בתאי צמחים אך תפקידיהן נותרים מסתוריים. לצד תשומת הלב הגוברת לתפקידם של כלורופלסטים בתיאום תגובות הצמח ללחץ, העניין בסטרומולים והקשר שלהם לדינמיקת איתות כלורופלסט גדל בשנים האחרונות, בסיוע התקדמות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ופלואורופורים של חלבונים המאפשרים הדמיה מהירה ומדויקת של דינמיקת סטרומולים. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבדיקת תדירות סטרומולה בכלורופלסטים האפידרמיסיים של Nicotiana benthamiana, מערכת מודל מצוינת לחקירת הביולוגיה של סטרומולה כלורופלסט. אנו מספקים גם שיטות להדמיית סטרומולים של כלורופלסט במבחנה על ידי מיצוי כלורופלסטים מעלים. לבסוף, אנו מתארים אסטרטגיות דגימה וגישות סטטיסטיות לניתוח הבדלים בתדירות סטרומולים בתגובה לגירויים, כגון לחץ סביבתי, טיפולים כימיים או השתקת גנים. חוקרים יכולים להשתמש בפרוטוקולים אלה כנקודת התחלה לפיתוח שיטות חדשות לניסויים חדשניים כדי לחקור כיצד ומדוע כלורופלסטים מייצרים סטרומולים.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כלורופלסטים הם אברונים דינמיים בתאי צמחים האחראים לפוטוסינתזה ולשורה של תהליכים מטבוליים אחרים. מסלולי איתות מהכלורופלסט משפיעים באופן משמעותי גם על הפיזיולוגיה וההתפתחות של הצמח, ומתאמים את תגובות הצמח לעקה סביבתית, פתוגנים ואפילו צורת עלים1-6. לאחרונה, ביולוגים התעניינו בהיבט לא מובן היטב של מבנה הכלורופלסט: סטרומולים, צינורות דקים מאוד מלאים בסטרומה המשתרעים מפני השטח של הכלורופלסט7.

הפונקציות הביולוגיות של סטרומולים נותרו לא ידועות, אם כי ידוע שתדירות הסטרומולים משתנה בתגובה לגירויים סביבתיים7-9, וסטרומולים עשויים להיות מסוגלים להעביר מולקולות איתות בין אברונים6. כל סוגי הפלסטידים (לא רק הכלו....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: עבור פרוטוקול זה, התמקדנו מנסה לאמוד תדירות stromule באפידרמיס של נ benthamiana משאיר. כמה שורות מהונדסות יציבות נוצרו, שניתן להשתמש בם למטרה זו, כולל 35S PRO: FNRtp: EGFP 13 ו NRIP1: 6 Cerulean. שתי שורות אלה מראים ביטוי חזק של fluorophores ב stroma הכלורופלסט של עלים גדלו תחת מגוון רחב של מצבים. לחלופין, fluorophores במיקוד הכלורופלסט עשוי לבוא לידי ביטוי זמני ב נ benthamiana באמצעות Agrobacterium טרנספורמציות 13. זהו פחות אידילי הקווים המהונדסים, מאז חדירות Agrobacterium להשרות כמה תגובות הגנה בסיסיות ב נ bent....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה שימש כדי להמחיש תדירות stromule ביום ובלילה של cotyledons של נ צעירים שתילי benthamiana. פרוסות מתוך ערימת z- מוזגו לתוך תמונה אחת (איור 1 א). למטרות חזותיות, הדימוי הזה היה אז desaturated ונהפך, כך stroma מופיע שחור (איור 1B). כלורופלסטים תויגו גם כחסר stromules (כוכבית ירוקה) או שיש לפחות אחד stromule (כוכבית מגנט). 87 כלורופלסטים אפידרמיס דמיינו, 33 יש stromules. לפיכך, תדר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאשר חוקרים stromules, שלושה גורמים חשובים חייבים להיחשב לכל אורכו: (i) מניפולציה של רקמות הצמח חייב להישמר עד למינימום הכרחי, (ii) מערכת הניסוי חייבת להישמר עקבית, וכן (iii) אסטרטגיות דגימה חייבות להיות מתוכננות בקפידה כדי להבטיח חזק, מנותחי נתונים לשחזור.

Stromules להפליא דינמי: הם יכולים להאריך לסגת במהירות לנגד עיניו של משקיף תחת מיקרוסקופ. יתר על כן, תדירות stromule משתנית באופן משמעותי בתגובת מגוון רחב של ט.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.O.B. ו-A.M.R. נתמכו על ידי מלגות קדם-דוקטורט מהקרן הלאומית למדע.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HepesSigma-AldrichH3375
NaOHFischer-ScientificS320-1
SorbitolSigma-AldrichS1876
EDTAFischer-BiotechBP121
MnCl2Sigma-Aldrich221279
MgCl2Sigma-AldrichM0250
KClSigma-AldrichP3911
NaClSigma-AldrichS9625
סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי קארל זייס בע"מ דגם: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)Sigma-Aldrich21879 
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)EMDMX1458-6
Waring blenderWaring דגם: 31BL92
פיג'יfiji.scתוכנת קוד פתוח לניתוח תמונות ביולוגיות

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koussevitzky, S., et al. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression. Science. 316 (5825), 715-719 (2007).
  2. Burch-Smith, T. M., Brunkard, J. O., Choi, Y. G., Zambryski, P. C. PNAS Plus: Organelle-nucl....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Stromule FrequencyFluorescence MicroscopyChloroplast IsolationConfocal MicroscopyStromule VisualizationNicotiana BenthamianaChloroplast StromulesStromule AnalysisStromule FormationStromule Dynamics

Related Articles