ניתוח של ייבוא ​​חלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים מצמחים לחוצים

סיכום

כאן אנו מתארים שיטה חדשה ללמוד יבוא החלבון לתוך כלורופלסטים מבודדים תחת לחץ. השיטה היא מהירה וישירה, וניתן להחיל ללמוד את ההשלכות של תנאי לחץ שונים לייבוא ​​חלבון הכלורופלסט, ואת מנגנוני ויסות המקביל.

תקציר

כלורופלסטים הם אברונים עם תפקידים חיוניים רבים בצמחים, הכוללים לא רק פוטוסינתזה אבל מטבוליות אחרות רבות ופונקציות איתות. יתר על כן, כלורופלסטים הם קריטיים עבור התגובות הצמח לעקות א-ביוטיים שונים, כגון מליחות מדגיש האוסמוטי. הכלורופלסט עשוי להכיל עד חלבונים שונים ~ 3,000, שחלקם מקודדים על ידי הגנום משלה. עם זאת, הרוב המכריע של חלבונים הכלורופלסט מקודדים בגרעין מסונתז cytosol, וחלבונים אלה צריכים להיות מיובאים לתוך הכלורופלסט דרך translocons על ממברנות המעטפה הכלורופלסט. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי הייבוא ​​חלבון הכלורופלסט ניתן לווסת באופן פעיל על ידי מתח. כדי לחקור כגון רגולציה ביוכימית של יבוא חלבון בתנאי קיצון, פיתחנו את השיטה המתוארת כאן כהליך מהיר וברור שניתן להשיג בקלות בכל מעבדה. בשיטה זו, צמחים גדלים תחת אוורור נורמליns ולאחר מכן נחשף למצבי לחץ בתרבות נוזלית. חומר צמחי נאסף, כלורופלסטים הם מכן שוחררו על ידי המגון. את homogenate הגולמי מופרד על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות, המאפשר בידוד של כלורופלסטים ללא פגע. תשואה הכלורופלסט נבחנת על ידי ספירה, ו תקינות הכלורופלסט נבדקת במיקרוסקופ. עבור מבחני יבוא חלבון, כלורופלסטים מטוהרים מודגרת עם ³⁵ radiolabeled S בחלבונים מבשר מתורגם במבחנה, וניסויים מנות זמן נערכים כדי לאפשר השוואות של שיעורי הייבוא בין גנוטיפים בתנאי קיצון. אנו מציגים נתונים שנוצרו באמצעות שיטה זו אשר מראה כי שיעור יבוא חלבון לתוך כלורופלסטים מן מוטצית רגולטורית משתנה במיוחד בתנאי קיצון האוסמוטי.

מבוא

כלורופלסטים הם מאוד אברונים בשפע קיימות ברקמות הירוקות של צמחים. הם ידועים עבור תפקיד קריטי שלהם בתהליך הפוטוסינתזה, תהליך העושה שימוש באנרגיית אור כדי להמיר פחמן דו חמצני לסוכר ובכך לתמוך כמעט כל החיים על פני כדור הארץ ^1. בנוסף, כלורופלסטים (והמשפחה הרחבה של אברונים הקשורים שנקראים plastids) לשחק הרבה תפקידים חיוניים אחרים בצמחים, כוללים ביוסינתזה של חומצות אמינו, שומנים, פיגמנטים, ואת החישה של אותות סביבתיים כגון כוח משיכה ואתגר הפתוגן. פוטוסינתזה יוצרת (reactive oxygen species ROS) כמו תוצרים, אשר בנסיבות מסוימות יש תפקידים שימושיים, אבל אם overproduced יכולה לגרום השפעות מזיקות או אפילו קטלניות. ייצור יתר של ROS הוא קידם במיוחד על ידי תנאים סביבתיים קשים, וכך כלורופלסטים קשורים קשר הדוק התגובות מדגיש אביוטי, כגון מליחות מדגיש האוסמוטי ^2.

Chיש loroplasts מבנה מורכב. הכלורופלסט כל מוקף שכבה כפולה הממברנה חיצונית קראה את המעטפה, אשר מורכבת של ממברנות חיצונית ופנימית. מבחינה פנימית, יש מערכת קרום אחרת שנקראה תילקואיד, שבו תגובות האור של פוטוסינתזה להתרחש. בין שתי מערכות הקרום מתקיימת שיחת תא מימית את stroma, אשר מעורב קיבוע פחמן. הכלורופלסט עשוי להכיל עד ~ 3,000 חלבונים שונים, ואת הרוב המכריע של חלבונים אלה מסנתזים אותן cytosol בצורה מבשר צריך להיות מיובאים לתוך אברון דרך translocons חלבון המוקדש בממברנות המעטפה ^1. מעניין לציין, כי העבודה אחרונה הצביעה על כך יבוא הכלורופלסט חלבון מווסת באופן פעיל, ולכן הוא מסוגל להפעיל רמה חשובה של שליטה על proteome הכלורופלסט. לדוגמא, נמסר כי בשנת 2015 יבוא חלבון יכול להגיב ללחץ אביוטי דרך הרגולציה הישירה של השפע של הדואר translocon על קרום המעטפת החיצונית של כלורופלסטים (TOC) על ידי מערכת היוביקוויטין-הפרוטאזום ^3.

שימוש כלורופלסטים מטוהרים בחלבונים מבשרים המסונתז במבחנה, יבוא חלבון ניתן מחדש במבחנה ^4,5. לפיכך, שיטות חוץ גופייה ניתן להשתמש כדי להעריך את שיעורי יבוא צמחים מוטנטים שונים ^6, אשר כבר פועל מתוך תפיסה ביקורתית לניתוח רכיבים המשוערים של מכונות יבוא חלבון על גילוי המנגנונים יבואו חלבון והרגולציה שלה. יתר על כן, יכול להיות מעובד כלורופלסטים עם חלוקה נוספת או העיכול פרוטאז, הבאים במבחנה יבוא, אשר יכול להקל על מחקרים על לוקליזציה המשנה organellar ואת הטופולוגיה של חלבונים הכלורופלסט ^7,8.

כדי לחקור את הסדרת יבוא החלבון על ידי מתח, יש לנו שונה שיטת הבידוד הכלורופלסט השגרה שלנו כמו נתארכאן. חשוב לציין, כלורופלסטים בודדו מצמחים שהתפתחו על Murashige הסטנדרטי Skoog (MS) אגרו בינוני במשך 8 ימים ולאחר מכן מועברים לתוך במדיום נוזל MS השלים עם לחץ, מתן טיפול מתח קצר יחסית, מבוקר. התשואה וכשירותו של כלורופלסטים מבודדים מצמחים הלחץ שטופלו כאלה עולים בקנה אחד עם הזרם ב assay יבוא חלבון במבחנה ^3. בנוסף פרוטוקול הבידוד הכלורופלסט, אנו מציגים שיטת השגרה שלנו ליבוא חלבון במבחנה, אשר הוכיח להיות חזק והיא בשימוש נרחב ^3,9-12.

פרוטוקול

צמיחה 1. של צמחים ארבידופסיס לטיפול מתח

1. הכן 1 ליטר של Murashige ו Skoog (MS) בינוני על ידי הוספת 4.3 גרם של תערובת מלח בסל MS, 10 גרם סוכרוז, 0.5 גרם 2- (N-morpholino) אתאן sulfonic חומצה (MES) כדי מים ללא יונים 1 ליטר, ולהתאים את ה- pH ל 5.7 עם אשלגן הידרוקסידי (KOH). הוסף 6 גרם של phytoagar חיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס.
   1. לפני התמצקות, לשפוך את המדיום לתוך צלחות פטרי עגול (בקוטר 9 ס"מ, גובה 1.5 ס"מ, עם 20 - 25 מ"ל MS בינוני לכל צלחת). אפשר הצלחות להתייבש במשך ~ 1 h במנדף זרימה למינרית לפני סגירת העפעפיים.
2. מניחים זרעים ארבידופסיס thaliana לתוך מבחנה 1.5 מ"ל עבור עיקור השטח על ידי הוספת 1 מ"ל של 70% (V / V) אתנול המכיל 0.02% (v / v) טריטון X-100 ומטלטל ברציפות למשך 5-10 דקות. עבור כל גנוטיפ / מצב, להכין 10 צלחות פטרי כל אחד נושא ~ 100 - 150 שתילים.
3. חכו כ -10 שניות עד הזרעים ליישבהחלק התחתון של הצינור, ולאחר מכן לבטל את supernatant ידי pipetting. הוסף 1 מ"ל של 100% אתנול, ולנער את הצינור שוב במשך 10 דקות.
4. הכן את מכסה המנוע זרימה למינרית ואילו הזרעים הם חיטוי. קח חתיכה אחת של נייר סינון לפי המדגם, לקפל אותו לשניים כדי להקל זריעה, ומשרים אותו אתנול 100% בתוך הכובע. המתן עד שהוא מתייבש לגמרי. שים לב אתנול 100% משמש שהוא מתאדה מהר יותר אתנול 70%.
5. מעבירים את הזרעים על הנייר סינון לפי pipetting באמצעות מ"מ 1 מ"ל פיפטה קצה לחתוך ~ 5 מסוף בסדר. ולאפשר להם להתייבש, שאמור לקחת כ -10 - 15 דקות.
6. זרע ~ 100 - 150 זרעים מעוקרים באופן שווה על כל צלחת MS הבינוני פטרי, ולאטום כל צלחת בעזרת פלסטר.
7. אחסן את הצלחות במהופכות על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 4 ד לעודד ולסנכרן נביטה. זרעים ישנים ייתכן שיהיו הצורך להשאיר יותר זמן (עד שבוע) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
8. מעביר את צלחות תא תרבית רקמה ולהשאיר אותם הפכו למעלה.לגדל את הצמחים במשך 8 ד תחת מחזור ארוך-יום (16 שעות 100 μmol · מ ^{'- 2} · s ^{- 1} אור, 8 שעות חושך) על 20 מעלות צלזיוס.
9. לטיפול מתח, כאשר הצמחים הם 8 ד ישנים, בשכונת הזרימה, ולהעבירם מן המדיום אגר, על ידי בעדינות מגרד אותם ביד עם כפפות מעוקר אתנול, לתוך בקבוק מעוקר של במדיום נוזל MS המכיל גורם הדחק (למשל , 200 מ"מ מניטול). הימנע ובה למעלה מ בינוני אגר. מכסה את פי הבקבוק עם רדיד מעוקר לאפשר לצמחים לגדול באותם התנאים כמו בשלב 1.8 עבור ד 2 נוסף על שייקר מסלולית עם רעד עדין (~ 100 סל"ד).

2. ביצוע חלבון מבשר על ידי במבחנה תמלול / תרגום

הערה: פרוטוקול זה מניח את השימוש photosystem ארבידופסיס שאני למקטע מבשר D (pPsaD) כתבנית / preprotein, אבל השיטה תואמת עם אחרים.

1. Clone רצף הקידוד (CDS) של pPsaD לתוך אתר השיבוט המרובה (MCS) של וקטור pBlueScript II SK (או כל וקטור דומה אחר עם אמרגן T7 upstream) ^13. לטהר את הפלסמיד (pBSK-pPsaD) באמצעות ערכת בידוד DNA ולאמת את הרצף על ידי רצפי DNA.
   הערה: כל הצעדים הללו בטכניקות שיבוט מולקולריות רגילות.
2. קבע את ריכוז ה- DNA פלסמיד pBSK-pPsaD באמצעות ספקטרופוטומטר להגדיר למדוד ספיגה ב 260 ננומטר. לדלל את הפלסמיד לריכוז סופי של 10 ng / μL.
3. הפעל 20 μL PCR (35 מחזורים) באמצעות פלסמיד בדילול כתבנית. הכן את התגובה כדלקמן: 2 μL 10 × חיץ פולימראז, 2 μL 2 מ"מ dNTPs, 1 μL 5 פריימר קדימה מ"מ M13 (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 μL 5 פריימר הפוכה מ"מ M13 (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 μL בדילול פלסמיד pBSK-pPsaD, 1 פולימראז U תקי, ומים מזוקקים כדי להפוך את התגובה הכולל נפח עד20 μL. השתמש בתכנית PCR רגילה, כדלקמן: 95 ° C, 5 דקות; 35 מחזורים של [95 ° C, 30 שניות; 56 מעלות צלזיוס, 30 שניות; 72 ° C, 30 שניות); ו -72 מעלות צלזיוס, 5 דק '.
4. הפעל 5 μL של מוצר ה- PCR על 1% (w / v) agarose ג'ל חיץ טה (Tris-HCl, pH 7.6, 20 מ"מ חומצה אצטית, 1 mM EDTA) כדי לוודא הגברה נכונה של cDNA, ולכמת את הרלוונטיות ביחס להקת סטנדרטים כדי לאשר את הריכוז. אחסן את שאר המוצר ב -20 מעלות צלזיוס במשך יישומים נוספים.
5. הכן תגובה 50 μL בעזרת מערכת תרגום / מבוסס תעתיק lysate ארנב reticulocyte ללא תא תואם עם ה- DNA PCR, כדלקמן: 40 μL lysate reticulocyte ממערכת שעתוק / תרגום, 2.5 μL רדיואקטיבי ^[35 S] מתיונין, 11 μCi / מ"ל (פעילות ספציפית:> 1,000 Ci / mmol), מים מזוקקים סטריליים 2.5 μL, ו -5 מוצר μL pPsaD PCR (100 - 800 ng).
   זהירות: יש להשתמש בכפפות, ביגוד מעבדת גלאס בטיחותses בעת טיפול בחומר רדיואקטיבי. לפקח לטהר את משטח העבודה והציוד. השלך את כל פסולת רדיואקטיבית במיכל פסולת מאושר.
6. דגירה התגובה במשך 90 דקות באמבט מים C ° 30. עצור את התגובה על ידי נחת המדגם על קרח.
7. הסר 1 μL של התגובה כמדגם הבדיקה (באותו נפח גם יכול לשמש פקד קלט עבור צעד 5.7) לצורך אימות על ג'ל אלקטרופורזה polyacrylamide סולפט dodecyl נתרן תקן (SDS-PAGE) ואחריו autoradiography, fluorography או הדמיה זרחן. תוצאה טובה מסומנת על ידי התצפית של להקה ייחודית וחזקה המתאימה המשקל המולקולרי של pPsaD (~ 23 KD). אחסן את שאר התגובה ב -80 מעלות צלזיוס במשך יישומים נוספים.

3. בידוד כלורופלסט

1. הכן את הפתרונות המניות הבאות:
   1. הכן בידוד כלורופלסט הצפת (מ.ח., 2x): 0.6 M סורביטול, מגנזיום כלוריד 10 מ"מ(MgCl _2), 10 מ"מ אתילן גליקול Tetraacetic חומצה (EGTA), חומצה ethylenediaminetetraacetic 10 מ"מ (EDTA), סודיום ביקרבונט 20 מ"מ (NaHCO _3), 40 מ"מ 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic חומצה (HEPES) ; להסתגל 8.0 pH עם KOH. כן 2 ליטר של מ.ח. 2x, לעשות aliquots ולשמור אותם ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך, או 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר. כדי להפוך 1x מ.ח., לדלל את 2x מ.ח. 1: 1 עם מים מזוקקים; זה יכול להיות מוכן טרי ביום ניסוי בידוד הכלורופלסט.
   2. הכן HEPES-MgSO ₄ חיץ -Sorbitol (HMS, 1x): 50 מ"מ HEPES, 3 מגנזיום סולפט מ"מ (MgSO _4), 0.3 M סורביטול; להסתגל 8.0 pH עם נתרן הידרוקסידי (NaOH). הכן 400 מ"ל של חיץ, לעשות aliquots ולשמור אותם ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך, או 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר.
2. לנהל את כל ההליכים הבאים בחדר הקר או על קרח. Precool כל הפתרונות, מכשירים, ציוד, הרוטורים לפני starting.
3. הכן שיפוע צפיפות רציפה על ידי ערבוב 13 מ"ל Percoll, 13 חיץ מ"ל 2x מ.ח., ו -5 גלוטתיון מ"ג צינור צנטריפוגות 50 מ"ל, centrifuging את התערובת על g 43,000 × למשך 30 דקות (בלם כבוי) ב 4 ° C. לאחר צנטריפוגה, להתמודד עם הצינור בזהירות כדי למנוע הפרעה השיפוע ולשמור על הקרח לשימוש מאוחר יותר.
4. העברת 100 מ"ל של 1x מ.ח. לכל גנוטיפ / תנאי מבחנה L 1.
   1. הסר את השתילים ממדיום נוזלי ידי להטות אותם לתוך מסננת, ולהעביר אותם לתוך מבחנה המכילה אחר-מ.ח.; אז, יש לשטוף את הרקמה עם מ.ח. להסיר כל מדיום נוזל שיורים לפני והחלפתו 100 מיליליטר של מ.ח. טרי.
5. עבור המגון, להשתמש סך של 100 מ"ל של 1x מ.ח. לדגימה בחמישה סיבובים רצופים של הומוגניות, כל סיבוב באמצעות 20 מ"ל של מ.ח. טרי שנערך מבחנה 50 מ"ל.
   1. לסיבוב הומוגניזציה הראשון, להעביר את רקמות הצמח לתוך 50 כוס המ"ל ביד, המאפשרחיץ החזקה קודם לנקז בין האצבעות. נסה להשתמש ביותר של הרקמה בסיבוב הראשון, אבל לוודא שהוא שקוע עם חיץ; אם הדבר אינו אפשרי, להציג הרקמה בשימוש הנותרים בסיבוב השני.
6. מניחים בדיקה של homogenizer רקמה לתוך רקמות homogenize עם שני פולסים של 1 - 2 של כל אחד. סנן את homogenate דרך שתי שכבות של בד סינון לתוך צינור צנטריפוגות 250 מ"ל ידי סחיטה עדינה. שמור את תסנין, ולהעביר את הרקמה חזרה 50 כוס מ"ל.
7. מניח aliquot שני 20 מיליליטר מ.ח. לתוך 50 כוס המ"ל, הוספה כל רקמה נותרת לא בשימוש בסיבוב הראשון של הומוגניות, וחזור על הצעדים המגון וסינון. לכן, חזור על שלבים 3.5 ו -3.6 עד שכל 100 מ"ל של מ.ח. נוצל עד (כלומר, 5 aliquots של 20 מ"ל), ולשלב את filtrates שהתקבל.
8. צנטריפוגה homogenate ונקווה ב 1000 g × 5 דקות (הבלם על) בשעה 4 ° C, ויוצקים מעלאת supernatant מייד לאחר השלים צנטריפוגה, נזהר שלא להפריע את הכדור. Resuspend גלולה ב supernatant שיורי השאיר את הצינור על ידי התססה הצינור בעדינות על הקרח. אל resuspend נמרצות על ידי pipetting או vortexing.
9. בעדינות להעביר את homogenate אל החלק העליון של שיפוע הצפיפות הרציף התערובת של העוגיות, בעזרת פיפטה פסטר ליישם אותו דרך הקיר של הצינור מקבל. הימנע מפריע השיפוע. צנטריפוגה ב הרוטור מתנדנד דלי ב 7,800 גרם × במשך 10 דקות (בלם כבוי) ב 4 ° C..
   הערה: שתי להקות ירוקות ניתן לראות את השיפוע לאחר צנטריפוגה: הלהקה התחתונה מכילה כלורופלסטים ללא פגע, והלהקה העליונה מכילה כלורופלסטים שבורים.
10. מחק את הלהקה העליונה על ידי pipetting, ולאחר מכן להעביר את הלהקה הנמוכה עם פיפטה פסטר לתוך צינור צנטריפוגות טרי 50 מיליליטר, שמירה על נפח של עד 8 מיליליטר לכל שיפוע.
11. הוסף ~ 25 מ"ל של 1x HMS חיץ לתוך הצינור להפוך את הצינור פעמיים to לשטוף את Percoll מן כלורופלסטים. מניחים את הצינור שוב הרוטור מתנדנד דלי צנטריפוגות ב 1000 גרם × 5 דקות (הבלם על) בשעה 4 מעלות צלזיוס.
12. יוצקים את supernatant בזהירות resuspend גלולה הכלורופלסט של HMS שיורי השאיר את הצינור בעדינות על ידי התססה את הצינור על הקרח. הוספת 100 נוסף - 300 μL של HMS במידת צורך (בהתאם לגודל של הגלולה ואת הספירה בסעיף 4), אבל משתדל לא לדלל את המדגם יותר מדי.
    1. שמור את כלורופלסטים על הקרח. בכל פעם לפני כלורופלסטים משמשים ליישומים במורד הזרם, לנער את הצינור כדי resuspend אותם. תמיד להשתמש קצה פיפטה לחתוך (עם נקבוביות מוגדלות) להעביר את כלורופלסטים.

ניתוח 4. של התשואה התקינות של כלורופלסטים

1. הוסף 5 μL של כלורופלסטים מבודדים 495 μL של 1x HMS חיץ בתוך שפופרת 1.5 מ"ל, ואז לערבב בעדינות על ידי צינור היפוך להשיג דילול 1: 100.
2. PlaCe כוס כיסוי על גבי תא ספירת haemocytometer. לאט פיפטה ~ 40 - 60 μL של ההשעיה הכלורופלסט מדולל לתוך הפער בין הזכוכית המכסה ובית הנבחרים והיד עוד נטויה. באמצעות מיקרוסקופ שלב בניגוד עם מטרת 10X או 20X, כלורופלסטים שלמים מתבוננים סביבי, בהיר מוקפים בהילה של אור.
   הערה: תחת מיקרוסקופ, ישנו אזור ספירה 1 מ"מ ² עם 25 ריבועים גדולים, כל 16 ריבועים קטנים המכילים במרכז תא הספירה.
3. ספירת כלורופלסטים ב 10 ריבועים גדולים. מספר כלורופלסטים לכל מ"ר גדולים צריך להרוויח בממוצע בין 10 ל 30. אם מעט מדי או יותר מדי כלורופלסטים נוכחים, להתאים את הגורם לדילול (שלב 4.1 לעיל) בהתאם, לחזור על התהליך.
4. לחשב את מספר כלורופלסטים לכל מ"ל (ריכוז) כדלקמן: n (המספר הממוצע של כלורופלסטים לכל מ"ר גדול המחושב בשלב 4.3) × 25 (המספר הכולל של ריבועים גדולים) × 100 (גורם לדילול) × 10 ⁴ (גורם קנה מידה להביע נתונים לכל 1 מ"ל, מאז נפח מעל 25 ריבועים הוא 0.1 מ"מ ^3).
5. חישוב התשואה בפועל של כלורופלסטים ידי הכפלת הריכוז על ההיקף הכולל של השעיה הכלורופלסט שהושגו בשלב 3.12. בדרך כלל, יותר מ -50 × 10 ⁶ כלורופלסטים ניתן להשיג.

5. יבוא חלבון כלורופלסט

1. הכן את הפתרונות המניות הבאות:
   1. הכן 10x חיץ HMS: 500 HEPES מ"מ, 30 מ"מ MgSO _4, ו -3.0 M סורביטול; להסתגל 8.0 pH עם NaOH. הכן 50 מ"ל של חיץ זה, aliquot, ולאחסן ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך ב 4 ° C עבור אחסון לטווח קצר.
   2. הכן חיץ להפסיק יבוא: 50 mM EDTA מומס חיץ 1x HMS. הכן 50 מ"ל של חיץ זה, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
   3. הכן חיץ טעינת חלבון 2x: 60 מ"מ טריס- HCl, pH 6.8, 10% (v / v) גליצרול, 2% (w/ V) SDS, 0.005% (w / v) כחול bromophenol. הפוך 50 מ"ל, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. רק לפני השימוש, להוסיף 100 μL של 1 M 1,4-dithiothreitol (DTT) עד 900 μL של חיץ.
2. כדי להפעיל מנות זמן עם 3 בזמן נקודות, להכין 3 צינורות שכל אחת מהן מכילה aliquot 130 μL של חיץ עצור ייבוא, ולהשאיר אותם על הקרח. כן תגובת יבוא 450 μL בצינור 2 מיליליטר (מחיר גנוטיפ / מצב). להפשיר את כל החומרים רק לפני השימוש.
   1. לקבלת תגובת יבוא אחד, משתמשים בדרך כלל 10 × 10 ⁶ כלורופלסטים בנפח μL; למשל, אם ריכוז הכלורופלסט הוא 2.5 × 10 ⁸ / מ"ל, השתמש 40 μL ההשעיה הכלורופלסט. שלושה בזמן נקודות תצטרך 3 × μL (כלומר, 120 μL בדוגמה שלנו).
   2. מערבבים את מרכיבי התגובות על הקרח לפי הסדר הבא: מים מזוקקים (כדי להפוך את הנפח הכולל 600 μL), B μL 10x חיץ HMS (בהתאם B = [600-3 × א] / 10; כלומר, 48 בדוגמא שלנו), 12 μL1 M חומצה gluconic (מלח אשלגן), 6 μL 1 ₃ M NaHCO, 6 μL 20% (w / v) BSA, 30 μL 100 מ"מ אדנוזין 5'-אדנוזין מלח מגנזיום (MgATP), 24 μL 250 מתיונין מ"מ (לא רדיואקטיבי ), ו -30 μL מבשרים חלבון. מיד לפני תחילת התגובה ייבוא, להוסיף 3 × μL של כלורופלסטים ומערבבים בעדינות על ידי הקשה על הצינור.
3. דגירה צינור התגובה של 25 מעלות צלזיוס באמבט מים מתחת ל -100 μmol · מ ^{'- 2} · s ^{- 1} אור. לפעמים קפיצי את הצינורות כדי resuspend כלורופלסטים.
4. כדי לערוך מנות זמן, לסגת 130 aliquots μL מן התגובה בזמן-הנקודות הנדרשות בטווח ליניארי של יבוא, שבמשך pPsaD הוא עד ~ 12 דקות (4, 8- ו -12 דק 'מועדים לפי שעון מתאימים במקרה הזה). תקופת הטווח ליניארי יכולה להשתנות עבור חלבונים שונים ^14. לכן, הוא הציע לבדוק כל preprotein הבודד לפני לייעל tהוא מועד לפי שעון.
5. מיד עם הנסיגה, להעביר כל aliquot 130 μL לצינור של חיץ להפסיק לייבא קר כקרח, מערבבים בעדינות על ידי הקשה על צינור, ולשמר את כל צינורות על הקרח עד זמן כמובן הושלמה.
6. צנטריפוגה כל הדגימות למשך 30 שניות ב 12,000 × g בתוך microfuge, לבטל את supernatants ידי pipetting, וכדוריות resuspend ב 15 μL של 2x חיץ טעינת חלבון ידי vortexing.
7. לנתח את כל הדגימות בתוספת שליטת קלט pPsaD (המכיל מקבילת pPsaD עד 10% מהסכום הוסיף לתגובת כל יבוא, משלב 2.7) על ידי ¹⁵ הדמית SDS-PAGE ו autoradiography, fluorography או זרחן סטנדרטי. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה לכמת ולנתח את התוצאות. כדי לספק אינדיקציה יעילה יבוא, את כמות החלבון מיובא גנוטיפים שונים / תנאים ניתן להעריך על ידי מדידת הרדיואקטיביות הקשורים לכל להקה בוגרת.

תוצאות

ניסוי יבוא הכלורופלסט חלבון למשל עם 3 נקודות זמן מוצג באיור 1. PsaD הוא ~ 18 KD רכיב של photosystem חשפתי אל stroma, עם טופס מבשר של ~ 23 KD ^16. PsaD נבחרה כאן עבור assay יבוא החלבון במבחנה כי הרמות היציבות שלה הן גבוהות של מוטצית SP1, ביחס WT, בתנאי קיצון, דבר המצביעה על שינוי יעילות היבוא שלה המוטציה ^3. מוטצית SP1 נושאת פגם וסת חשוב של מכונות יבוא חלבון הכלורופלסט - את SP1 החלבון ^3. עבור כלורופלסטים מבודדים מצמחים הגדלים בתנאים רגילים, לא היה הבדל ברור ביבוא PsaD בין SP1 ו- WT (מידע לא מוצג) ^3. עם זאת, באמצעות השיטות שתוארו כאן כדי להעריך ייבוא ​​PsaD לתוך כלורופלסטים מבודדים אוסמוטיצמחים הדגישו, הבדל ברור זוהו. בעוד צפינו ההצטברות של טופס החלבון הבוגר באופן תלוי-זמן עם גנוטיפים הם, שיעור יבוא היה נמוך משמעותי עבור כלורופלסטים WT מאשר כלורופלסטים SP1 (איור 1), אשר עולה בקנה אחד עם תוצאות ניסויים עד כה ^3, וחושף תפקיד חשוב לחלבון SP1 בוויסות יבוא הכלורופלסט של PsaD בתנאי קיצון.

איור 1. חלבון Assay היבוא שנעשה בעזרת כלורופלסטים מבודדים מצמחים הגדלים בתנאי קיצון אוסמוטי. כלורופלסטים בודדו מתוך WT 10 יום בן (Col-0) ו צמחי ארבידופסיס מוטצית SP1 גדלו בתנאי מתח (200 המ"מ מניטול) עבור 2 ד. (א) יבוא חלבון נערך באמצעות ^[35 S] -methionine שכותרתו pPsaD ואפשר להמשיך במשך 4, 8 ו -12 דקות לפני הניתוח על ידי SDS-PAGE ו הדמית זרחן. במקביל, שליטת קלט 10% pPsaD המהווים במבחנה מתורגמת חלבון (IVT) נותח. המבשר (מראש) ובוגרת (מחצלת) צורות pPsaD מסומנות, כאשר בין לבין יש שתי להקות מתאימות סביר מוצרי תרגום קטועים או proteolyzed בגלל האינטנסיביות שלהם לא השתנתה במהלך הזמן (*). (ב) כדי להשוות את שיעורי היבוא לתוך כלורופלסטים מצמחי WT ו SP1 גדלו בתנאי מתח, האינטנסיביות של כל להקה המתאימה חלבון בוגר מיובא הייתה לכמת. כל הנתונים הם מבוטאים באחוזים של כמות החלבון מיובא כלורופלסטים מצמחי WT לאחר 12 דקות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

הראינו לאחרונה כי יבוא חלבון הכלורופלסט ניתן לווסת באופן פעיל על ידי מתח, שהוא חיוני לתפקוד וצומח הכלורופלסט הישרדות ^3. במחקר זה, כדי לפקח תקנה כזו, שינינו בידוד הכלורופלסט שלנו ובשיטות assay יבואו במבחנה על מנת לאפשר הערכה של קיבולת יבוא הצמחים הגדלים בתנאי מתח. התוצאות הצביעו על תפקיד חשוב עבור SP1 בתקנה יבוא חלבון הכלורופלסט.

מבחני יבוא קונבנציונליים במבחנה להשתמש בצמחים הגדלים על מצע אגר MS תקן ^6,17,18. במקרה של מוטצית SP1 המתואר כאן, מבחנים קונבנציונליים כגון לא לחשוף את כל הבדלים ביחס יבוא חלבון אל WT ^3. עם זאת, את התפקיד של SP1 בויסות יבוא חלבון מתגלה בבירור כאשר יבואו חלבון נבחן בתנאי קיצון באמצעות השיטות שתוארו לעיל (איור 1). אמנם זה מאיים לא ניתן יהיה להשוות נתוני יבוא ישירות assay בתנאי עקה עם אלה המתקבלים מבחנים קונבנציונליים (כמו השיטות להעסיק צמחים הגדלים בתרבית נוזל על מצע אגר, בהתאמה), השוואות בין מתח תנאים שאינם לחץ הם ריאליות ובלבד הצמחים גדלים כל במדיום התרבות באותו הנוזל, עם או בלי לחץ.

בהשוואה לטיפול הלחץ על המדיום אגר, בתרבות נוזל הוא יותר נוח לטיפול של מספר גדול של צמחים הדרושים מבחני יבוא חוץ גופית. יתר על כן, זה מקל על היישום האחיד של גורם דחק לכל הצמחים, וזה חשוב במיוחד עבור טיפולי לחץ לטווח קצר. השיטה המוצגת כאן יושמה ללמוד את הלחץ האוסמוטי באמצעות טיפול מניטול, אבל אפשר להפוך בקלות למגוון רחב של לחצים אחרים; למשל, מתח מלח לטווח קצר סטרס חמצוני, אשר דחק המקבילה יכול bדואר מיושם באופן דומה באמצעות בינוני MS נוזלי. עבור סוגים אחרים של לחצים, אנו מציעים את מידת הלחץ היא מותאמת ראשונה; מדי טיפולים קשים עלולים להיות השלכות שליליות על התשואה ו / או יכולת יבוא של אברונים המבודדים.

ישנם מספר צעדים חשובים בתוך הפרוטוקול שאליו אחד צריך להקדיש תשומת לב מיוחדת, כפי שיפורט להלן.

הריכוז אגר האופטימלי עבור מדיום MS יכול להיות שונה (0.6 - 0.9%, w / v) בהתאם ליצרן. לפיכך, מומלץ לבצע אופטימיזציה של ריכוז אגר אמפירית לפני תחילת הניסויים. המדיום לא צריך להיות כל כך רך כי היא נדבקת אל הרקמה ליד מדרגת הקציר (שלב 1.9), לא צריך להיות כל כך קשה כי זה מעכב התפתחות שורש צמח. ריכוז סוכרוז יכול גם להיות מותאם על פי הצמחים בשימוש. כשעובד עם מוטציות חולות במיוחד, בינוני MS בתוספת 2 - 3% (w / v) סוכרוז עשוי לעזור לצמחים לגדול טוב יותר. כאשר האפליקציהשוכב טיפולי לחץ, זה לא טוב להעביר צמחים ישנים מאוד למדיום הנוזלי (למשל> בן 14 ימים). הסיבה לכך היא כי השורשים המפותחים יותר של צמחים ישנים פגומים בקלות רבה יותר במהלך מסירה.

באשר למערכת תעתיק / תרגום, יש 2 מערכות עיקריות: אלה המבוססים על נבט חיטה, ואלה המבוססים על reticulocyte ארנב. ערכות אלה עשויים להשתמש בתבניות שונות, כגון פלסמידים לינארית, פלסמידים unlinearized, או מוצרים PCR. הערכות גם ספציפיות עבור T3, T7, ומקדמי SP6. ראוי לציין, כי הערכה אנו ממליצים כאן היא מתאימה רק לשימוש עם מוצרי ה- PCR ואת אמרגן T7. עם זאת, מסיבות לא ידועות, כמה preproteins radiolabeled עשה עם המערכת הזו לא יכול לעבוד ביעילות ב assay יבוא; במקרים כאלה, ניתן לשקול לנסות מערכת תמצית נבט חיטה או מערכת lysate reticulocyte מיועד תבניות פלסמיד. אפשר גם לשפר את התוצאה של מחדש שעתוק / תרגוםפעולה על ידי שינוי תנאי תגובה על פי המדריך של היצרן.

חשוב להתחיל בידוד הכלורופלסט מוקדם בבוקר (או בשלב מוקדם של מחזור האור של חדר הצמיחה) על מנת למנוע הצטברות של עמילן בתוך כלורופלסטים עקב פוטוסינתזה, אשר יכול לעכב את הבידוד של אברונים שלמים. הליך בידוד הכלורופלסט חייב להיעשות במהירות ללא עיכובים מיותרים, ואת כלורופלסטים המבודדים תמיד חייבים להישמר בקירור. זאת על מנת לסייע בהגנה מפני התצפית כי מבודדת כלורופלסטים יאבדו הכדאיות שלהם בהדרגה, וזה לא טוב. אם אתה משתמש מ.ח. מופשר חדש או חיץ HMS, הקפד לערבב למאגר היטב לפני השימוש כדי להשיג פתרון הומוגני. התנאים האופטימליים עבור המגון של חומר צמחי הוקמו באופן אמפירי, והוא יכול להשתנות אם homogenizer רקמות שונה משמש.

אם גנוטיפים צמחים שונים מכילים similaרמות כלורופיל r, כימות כלורופיל יכול לשמש כדרך חלופית לנרמל את דגימות לפני ביצוע מבחני יבוא. הכלורופיל ניתן לקבוע spectrophotometrically הבאים החילוץ של מדגם של כלורופלסטים מבודדים ב -80% (v / v) אצטון מימית ^19,20. עם זאת, אם מחירי יבוא הצמחים מראים תוכן כלורופיל שונה (למשל, מוטציות עם פנוטיפים לצהוב) יש להשוות, להשתמש במספר הכלורופלסט לספור לנרמל את דגימות הכלורופלסט ב מבחני היבוא. זה חשוב במיוחד כדי resuspend את כלורופלסטים ביסודיות בשלב 3.11. resuspension מספיק עלול לעזוב אגרגטים של כלורופלסטים, אשר יקשו לספור מספרים במדויק ובכך יפריע את הטעינה הנכונה בתגובות יבוא. אם צבירה חמורה נתפסת מתחת למיקרוסקופ (למשל, אגרגטים עם> 10 הכלורופלסט חברו יחדיו), ממשיך לרעוד המדגם הכלורופלסט על קרח עד aggregates יוסר. קל יותר resuspend את כלורופלסטים בנפח קטן של חיץ.

חשוב להיות מודע לכך תגובות יבואו חלבון (סעיף 5) חייבות להתנהל עם אמצעי זהירות מתאים בגלל האופי רדיואקטיבי שלהם. אמצעי זהירות הנדרש כוללת: לובש כפפות חד פעמיות, בגדי מעבדת משקפי מגן, ניטור decontaminating משטח העבודה וציוד, והשלכה של כל פסולת רדיואקטיבית במכל פסולת מאושרת. כמו כן יש לזכור כי הלחץ האוסמוטי הנכון הוא קריטי לשמירה על תקינות של כלורופלסטים במהלך התגובות יבוא, וזה נשמר בעיקר על ידי חיץ HMS. בגלל 10x HMS הוא צמיג, זה צריך להיות מחומם ראשון RT, ולאחר מכן מעורב באופן יסודי, וכן להחיל באמצעות קצה פיפטה לחתוך כדי להבטיח מדידה של כמויות מדויקות. ב תגובת היבוא, מתיונין קר מתווסף לעכב את ההתאגדות של מתיונין radiolabeled החופשי לתוך chloropl הקשורחלבונים אס באמצעות תרגום organellar במהלך שלב הדגירה, בעוד משמש BSA כדי למזער proteolysis על ידי מתנהג כמו מצע של פרוטאזות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מלח בסיס Murashige ו-Skoog	מלפורד	M0221
פיטואגר	מלפורד	P1003
2-(N-morpholino) אתאן חומצה סולפונית (MES)	מלפורד	B2002
טריטון X-100	פישר	BPE151-500
סרט כירורגי (למשל , Micropore, 3M)	3M	1530-1
נייר סינון	פישר	FB59023
Percoll	Fisher	10607095
אתילן גליקול חומצה טטראצטית (EGTA)	Sigma	E4378
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Fisher	D/0700/53
4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES)	Melford	B2001
בד סינון (Miracloth)	Calbiochem	475855
צינור צנטריפוגה 50 מ"ל	פישר	CFT-595-040M
בקבוק צנטריפוגה 250 מ"ל	פישר	CFT-891-V
פוליטרון (למשל , Kinematica PT10-35)	פישר	11010070
בדיקה פוליטרון (למשל , Kinematica PTA20S)	פישר	11030083
צנטריפוגה (למשל , Beckman Coulter Avanti JXN-26, עבור צינורות של 50 ו-250 מ"ל)	של Beckman Coulter	B34182
עבור 250  בקבוקי מ"ל (למשל , JLA-16.250)	רוטור בקמן קולטר	363930
בזווית קבועה ל-50  צינורות מ"ל (למשל , JA-25.50)	בקמן קולטר	363058
לצינורות של 50 מ"ל (למשל , JS-13.1)	בקמן קולטר	346963
עם תווית רדיו [35S] מתיונין	פרקין אלמר	NEG072002MC
מערכת תרגום נטולת תאים מבוססת ליזאט רטיקולוציטים ארנב (ערכה מהירה TNT T7 ל-PCR DNA)	מיקרוסקופ ניגודיות פאזה Promega	L5540
(למשל , Nikon Eclipse 80i)	לא זמין		של ניקון
(תא משופר Neubauer BS748)	Hawksley Technology	AC1000	0.1 מ"מ עומק, 1/400 מ"מ 2
כיסוי משקפיים	VWR	16004-094	22 מ"מ ופעמים; 22 מ"מ, עובי 0.13-0.17 מ"מ
1.5 מ"ל צינורות מיקרופוגה	Sarstedt	72.690.001
צינורות מיקרופוגה 2 מ"ל	Starlab	S1620-2700
מיקרופוגה (למשל , Eppendorf 5415D)	Eppendorf	לא זמין
ספקטרופוטומטר Nanodrop 2000 או דומה	Thermo Fisher	SPR-700-310L
חומצה גלוקונית (מלח אשלגן)	Fisher	22932-2500
סרום בקר אלבומין (BSA)	Sigma	A7906
MgATP	Sigma	A9187
מתיונין	Sigma	M6039
ברומופנול כחול	פישר	B/P620/44
גליצרול	פישר	G/0650/17
SDS	Fisher	S/5200/53
Tris Base	מלפורד	B2005
דיתיותרייטול (DTT)	תוכנת ניתוח תמונות Melford	MB1015
(למשל , מנתח תמונות Aida)	Raytest	לא זמין