Method Article

כימותים אוטומטיים וניתוח הליכי ספירה הניידת באמצעות תוספי ImageJ

DOI:

10.3791/54719

⸱

November 17th, 2016

 ,  , 
1Department of Biology, York University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר את הכימות של מיקרוגרפים המוציטומטריים והנדידה/פלישה באמצעות שני תוספים חדשים של ImageJ בקוד פתוח, מחשבון ריכוז תאים ומונה בדיקת הגירה. יתר על כן, הוא מתאר פרוטוקולי קליטת וכיול תמונה וכן דן בפירוט בדרישות הקלט של התוספים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המכון הלאומי ImageJ של בריאות היא חבילת תוכנת עיבוד תמונה רבת עוצמה, זמין באופן חופשי. ImageJ יש אלגוריתמי ניתוח חלקיקים מקיפים אשר ניתן להשתמש בם ביעילות למנות חלקיקים ביולוגיים שונים. כאשר כותבים מספרים גדולות של דגימות תאים, hemocytometer מציג צוואר בקבוק בכל הנוגע לזמן. כמו כן, ספירת ממברנות מבחני הגירה / פלישה עם דלפק תא תוסף ImageJ, למרות מדויק, הוא עבודה באופן יוצא מן הכלל אינטנסיבי, סובייקטיבי, לשמצה בשל גרימת כאב בפרקי יד. כדי לתת מענה לצורך זה, פיתחנו שני תוספים בתוך ImageJ למשימה הבלעדית של hemocytometer אוטומטיות (או נפח ידוע) ועוד היד נטויה תא הגירה / הפלישה. שני תוספים להסתמך על היכולת לרכוש micrographs באיכות גבוהה עם רקע מינימלי. הם קלים לשימוש אופטימיזציה עבור ספירה וניתוח מהיר של מדגמים גדולים עם כלי ניתוח מובנים כדי לעזור כיול של ספירות. על ידי שילוב של עיקרון הליבהים של מונה סלולארי עם ניתוח אלגוריתם ספירה אוטומטי שלאחר ספירה, זה מגדיל מאוד את הקלות שבה מבחני הגירה יכולים להיות מעובד ללא כל אובדן של דיוק.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בשנת ספירת תאים במבחנה היא טכניקה בסיסית חשובה במגוון רחב של ניסויים בתרבית רקמה. קביעת מספר התאים במדויק בתרבות חיונית שחזור ניסיוני 1,2 סטנדרטיזציה. ספירת תאים יכול להתבצע באופן ידני באמצעות hemocytometer וכן באמצעות מגוון של שיטות אוטומטיות, כל אחד עם יתרונות וחסרונות משלהם 3,4,5. רוב השיטות האוטומטיות ספירת תאים שייך לאחת משתי כיתות, אלה העושים שימוש עיקרון קולטר או cytometry זרימה. מונה קולטר לנצל התנגדות חשמלית תאים כדי לקבוע את מספר נייד וגודל. הם מהירים, מדויקים יותר זולים מאשר cytometers זרימה. עם זאת, הם משמשים לעתים נדירות עבור ספירת תאים רק בשל הניכר בעלויות שלהם לעומת ספירה י....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. מיקרוסקופ מתחם והגדרת מצלמה (מחשבון ריכוז תא)

  1. גברת בהירות הנורה עד מלא עם כפתור כוונון האור, לעבור העדשה האובייקטיבית 4X, ולהבטיח מסננים בניגוד השלב נבחרו.
    הערה: כל מיקרוסקופ לעומת שלב הפוך עבור בתרבית רקמה עם רקע כהה, למשל, בניגוד שלב PHP, ניתן להשתמש בעקבות הליכים מיקרוסקופ מצלמה רגילות.
  2. בתוך תוכנת מיקרוסקופ, להגדיר הגדרות לכידות תמונה לערכי ברירת מחדל.
    הערה: עיין במדריך למשתמש של מיקרוסקופ כדי למצוא את המיקום של הגדרות אלה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחשבון ריכוז התא

איור 1 מציג את התהליך הכולל של כיול CCC ורכישת תמונת ספיר. איור 1 א ו -1 B לתאר את תמונת כיול מרובע P וחישוב אורך P-מרובע בפיקסלים. CCC קובע ריכוז התאים בנפח נתון לפי הנוסחה:

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שלבים קריטיים, פתרון בעיות, ומגבלות

עצם טבעו של שיטות חישוביות אוטומטיות, במיוחד אלה של ניתוח חלקיקים, מחייבת היכולת המתמטית להגדיר חלקיקים אלה. כתוצאה מכך, את הדיוק של שני מחשבון נייד ריכוזיות דלפק assay ההגירה תלוי majorly על נאמנות תמונה, כלומר, כיצד מקרוב את התמונה שצולמה דומה מדגם תא או קרום assay הגירה. לכן בעל החשיבות העליונה לעקוב מיקרוסקופ ופרוטוקולי כיול תוכנה נלווה בצורה הטובה ביותר אפשרי. זה כולל הגבלת ר.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר הבריאות ל-CP (OR 142730 ו-OR 89931). ברצוננו להודות לילנה ברקיץ' על הרעיון הראשוני שלה לניתוח חלקיקים בינאריים ב-ImageJ.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
מדיה נוזלית קלאסית של HyClone: RPMI 1640 - עם L-גלוטמיןפישר ScientificSH3002702מצעי תרבית תאים 
סרום בוביאני עוברי (FBS)GIBCO BRLP00015אספקת מדיה
HTR8/SVneo קו תאים טרופובלסטתאים התקבלו מד"ר צ'ארלס גרהם (קווין' s University, Kingston, Canada)התוכנה נועדה לעבוד עם כל קו תאים.
טריפסיןGIBCO BRL27250-018מוכן כ-0.20% (w/v) ב-10 ומיקרו; M EDTA 1x PBS
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
צלחות תרבית תאים 10 ס"מSARSTEDT833902כל צלחות שטופלו בתרבית רקמות יתאימו
מוסיף ממברנה פוליאסטר Transwell - 8.0  ומיקרו; m גודל נקבוביותCostar 3422 הוזמן מפישר סיינטיפיק7200150עבור צלחות 24 בארות; גודל נקבוביות: 8.0 ומיקרו; m; קוטר 6.5 מ"מ; 0.33 ס"מ2 אזור גידול
HARLECO המטולוגיה כתמים וריאגנטים, EMD Millipore - Soluntions 1, 2 & 3EMD Millipore והוזמן מ- VWR65044A, B & סט כתמי C Hemacolor מורכב משלושה בקבוקי פולי של 500 מ"ל (16.9 אונקיות) וכולל מקבע מתנול (תמיסה 1), כתם אאוזין או חומצה (תמיסה 2), וכתם מתילן כחול או בסיסי (פתרון 3)
מוליך כותנהPuritan Medical806-WC
סכיני גילוח תעשייתיים חד-קצהVWR55411 - 055עובי: 0.30 מ"מ (0.012 אינץ')
שקופיות מיקרוסקופ - נקי מראש/רגילפישר סיינטיפיק12550A3מידות: 25 מ"מ x 75 מ"מ x 1.0 מ"מ
משקפי כיסוי פישרברנד - מלבנים מס' 1פישר סיינטיפיק12-545Eעובי: 0.13 עד 0.17 מ"מ; גודל: 50 מ"מ x 22 מ"מ
פישר כימי הרכבה בינוניתפישר סיינטיפיקSP15-500
Leica סטריאו מנתח מיקרוסקופLeica Microsystemsהמיקרוסופ מצויד במצלמת מיקרוסקופ Leica דגם MC170 HD ותוכנת המצלמה היא Leica App. Suite (LAS E2) גרסה 3.1.1 [בנייה: 490]. חלקי מיקרוסקופ:  דגם תאורת אור ספוט LED3000: MEB126, מנשא אופטי Leica M80 דגם M80, נכרומט אובייקטיבי 1.0X, WD=90  מ"מ דגם: MOB306 & אכרומט אובייקטיבי 0.32X, WD=303  מ"מ דגם: MOB315, מטרת וידאו 0.5X דגם: MTU-293
עוזר המציטומטרגרמניה 0.100 מ"מ עומק - 0.0025 מ"מ2
אולימפוס מיקרוסקופ אור הפוךתאגיד אולימפוסCKX41SFהמיקרוסופ מצויד בתוכנת Lumenera Infinity 1-2
2.0 Megapixel CMOS Color Camera & Camera היא אינפיניטי אנליזה גרסה 6.5.2
ארון זרימה למינרית 1300 סדרה A2Thermo Scientific דגם: 1375כל ארון זרימה למינרי לעבודת תרבית תאים יתאים 
חממת תרביות תאיםThermo Scientific דגם: 370כל חממת תרבית תאים תתאים - התאים תורבבו בסביבה לחה, 5% CO2, 37 ° C 
ImageJNIHגרסה 1.50eגרסה מינימלית נדרשת
Java Runtime Environmentגרסה 1.8.0_66גרסה מינימלית נדרשת
Oracle

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and Determining the Viability of Cultured Cells. J. Vis. Exp. (16), e752(2008).
  2. JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2016).
  3. Graham, M. D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

ImageJ PluginsCell CountingHemocytometer AnalysisMigration AssayParticle AnalysisAutomated CountingImage CalibrationColor ThresholdingCell Concentration CalculatorTC Plugin

Related Articles