מאמר שיטה

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של D. discoideum שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

DOI:

10.3791/54730

⸱

2 בדצמבר 2016

 , 
1Max-Planck Institute for Molecular Cell Biology and Genetics

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הוקמה לאחרונה כמערכת לחקר קיפול שגוי של חלבונים ופרוטאוסטזיס. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה חדשה מבוססת הדמיה לחקר צבירת חלבונים המושרה על ידי טמפרטורה ותגובת הלחץ התאית ב-D. discoideum.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אורח החיים המורכב של האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הופך אותו למודל רב ערך לחקר תהליכים ביולוגיים שונים. לאחרונה הראינו כי D. discoideum עמיד להפליא בפני צבירת חלבונים וניתן להשתמש בו כדי לקבל תובנות על מערכת בקרת איכות החלבון בתא. עם זאת, השימוש ב-D. discoideum כמערכת מודל מציב מספר אתגרים לגישות ניסיוניות מבוססות מיקרוסקופיה, כגון התנועתיות הגבוהה של התאים ורגישותם לרעילות לאור. האחרון מתגלה כמאתגר במיוחד בעת חקר הומאוסטזיס חלבון, שכן ההשפעות הפוטוטוקסיות יכולות לגרום לתגובת לחץ תאית ובכך לשנות את התנהגות מערכת בקרת איכות החלבון.

עליית טמפרטורה היא דרך נפוצה לגרום למתח תאי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה הניתן לבקרת טמפרטורה, המאפשר התבוננות בהפרעות הנגרמות על ידי טמפרטורה ב-D. discoideum. יתר על כן, כאשר מיושם בטמפרטורת צמיחה רגילה, פרוטוקול הדמיה זה יכול גם להפחית באופן ניכר את רעילות האור, ובכך לאפשר הדמיה בעוצמות גבוהות יותר. זה יכול להיות שימושי במיוחד בעת הדמיית חלבונים עם רמות ביטוי נמוכות מאוד. יתר על כן, הניידות הגבוהה של התאים מחייבת לעתים קרובות רכישת שדות ראייה מרובים כדי לעקוב אחר תאים בודדים, ויש לאזן את מספר השדות מול מרווח הזמן וזמן החשיפה הרצויים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Discoideum Dictyostelium הם אמבות בודדות חיים בקרקע הניזונים חיידקים ומיקרואורגניזמים אחרים, אשר נתפסים על ידי phagocytosis. יש לה מחזור חיים ייחודי מדהים כי כבר שטח גדול של מחקר מאז גילויו 1. הריבית בשלב המוקדמת של התפתחות רבה-תאית 2 ואת הבסיס המולקולרי של chemotaxis 3 הושלמה בקרוב על ידי מחקרי התמקדות תנועתיות תא, קוטביות בתא, חסינות מולדת. בנוסף, ד discoideum הוצג כמערכת מודל 4,5 המחקר הביו-רפואי.

לאחרונה, הקמנו ד discoideum כמערכת חדשה ללמוד את בקרת איכות חלבון (PQC) 6,7 המערכת. Proteome שלה הוא מועשר בחלבוני צבירה נוטה כמו-פריון, אשר מציב אתגר בפני בקרת איכות חלבון 8. כדי לחקור האם ד discoideum פתחה מנגנונים מולקולריים מיוחדים לשלוט AG ביותר שלהgregation נוטה proteome חקרנו את ההתנהגות של חלבוני סמן נוטה צבירה הוא בתנאי צמיחה נורמלים במהלך מתח. בתנאי עקה, כגון עומס החום, שניתן להשתמש בהם כדי להגביר את קצב חלבון misfolding 9. לכן, חיפשנו מערכת שבה נוכל לגרום שינויי טמפרטורה ובמקביל לעקוב אחר ההתנהגות של חלבונים סמן. לשם כך, אנו בשילוב הדמית תא חי עם חימום מבוקר פלטייה באמצעות כנס במה תרמי (תא קירור). שיטה זו אפשרה לנו לשמור על טמפרטורה קבועה ואחידה וכן לגרום לשינוי טמפרטורה מהיר, עדיין מדויק.

הדמית תא חי משמשת ללמוד מגוון של תהליכים ביולוגיים ד discoideum. עם זאת, גישה זו עומדת בפני שתי מגבלות עיקריות. ראשית, התאים להציג תנועתיות גבוהה נוטים להגר אל מחוץ לשדה הראייה, ובכך המעקב של תאים בודדים לעתים קרובות דורש הדמיה של שטח גדול. ניידות התא יכוללהיות מופחת על ידי כיסוי 10 אגרו, עם זאת, תנאים אלה אינם מתאימים הדמיה לטווח ארוכה בשל ירידה כדאיות. שנית, ד תאי discoideum להראות רגישות גבוהה במיוחד רעילות צילום, שתוצאתה עיגול תא מעצר mitotic 11. פרוטוקולים קודמים לטפל בבעיה זו על ידי תוספת של ascorbate כמחסל רדיקלי וצמצום חשיפה פעמים 12. האחרון יכול להיות קריטי אם החלבון של העניין מתבטא ברמות נמוכות ומראה אות קרינה חלשה. המחברים גם מציעים לספק טמפרטורה קבועה של 21 מעלות צלזיוס או על ידי הדמיה בחדר ממוזג או באמצעות תיבות דגירת בקרת טמפרטורה, אשר מכסות את הבמה האובייקטיבית מיקרוסקופ 12.

כאן, אנו מתארים שיטה עם בקרת טמפרטורה משופרת באמצעות תא קירור נקבע על 23 מעלות צלזיוס. במהלך הדמית ההגדרה שלנו משפר באופן משמעותי את ההתנגדות רעילה צילום. זהמאפשר את השימוש של פעמי חשיפה גבוהות ועוצמות אור עירור גבוהות. זה הוא בעל חשיבות מיוחדת במהלך ההדמיה זמן לשגות, כפי מרווחי הזמן צריך להיות מאוזן בקפידה מול מספר המשרות צילמו את זמן החשיפה לשמש. האפשרות להגדיל את מספר משרות צלמו גם מאפשרת כיסוי של אזור הדמיה רחב יותר ומקל מעקב של תאים בודדים על פני תקופה ארוכה של זמן.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תא הכנה

  1. תאי גידול
    1. לגדול ד תאים discoideum במדיום AX ב 23 ° C תחת אור בצלחות בתרבית רקמה. אל תשאיר את התאים בצפיפויות גבוהות מעל 75% confluency.
      הערה: לקבלת מענה מיטבי לחום מתח, תאים צריך להיות בשלב הצמיחה המעריכית וצריך לא הגיעו בשלב נייח.
    2. היום לפני ההדמיה, תאים התפצלו בינוני קרינה נמוך (LFM) 1 x 10 4 תאים / מיליליטר.
      הערה: שלב זה הוא הכרחי כדי להפחית קרינת רקע הנגרם על ידי מדיום AX. זמן הדגירה יכול להיות מופחת למינימום של 2 שעות. עם זאת, שלפוחית ​​נלקחה במדיום AX עדיין יכולה ליצור כמה אות רקע לאחר 2 שעות.
  2. תאי הכנות לקראת מיקרוסקופיה
    1. לפני ההדמיה, תאי קציר מהצלחת רקמות LFM ולהעביר מספר מספיק של תאים לתוך מנות תחתיות זכוכית.
      הערה: בדרך כלל,1 x 10 5 תאים / המ"ל מספיק; עם זאת, אם הגדרת הניסוי דורשת תקופות הדמיה ארוכות (יותר מ -8 שעות), מספרים סלולריים צריכים להיות מותאמים בקפידה, כמו ד תאי discoideum יעברו לעבוד מעגל ההתפתחות ולהתחיל להזרים המצרפי אם מספרים סלולריים הם גבוהים בעוד מזינים נמוכים.
    2. אפשר התאים להסתפק 20 דקות. הסרת תאים שאינם התיישבו בזהירות על ידי החלפה הבינונית בשימוש עם מדיום חדש.

הדמיה 2.

הערה: הפרוטוקול יכול לשמש במערכות רחב בתחום כמו גם setups מיקרוסקופיה confocal. שימוש תיבת דגירת בקרת טמפרטורה מכסה את היעדים ואת במת מיקרוסקופ הוא מועיל, עדיין לא חיוני בקרת טמפרטורה. הטמפרטורה של תיבת הדגירה מוגדרת הטמפרטורה הגבוהה ביותר השתמשה בניסוי, למשל, ל -40 מעלות צלזיוס אם עומס חום מתבצע. אחרת, את הטמפרטורה מוגדרת 256; C. שינויי טמפרטורה צריכות להתבצע מראש על מנת לאפשר למערכת להסתגל, כמו שינויי הטמפרטורה במהלך ההדמיה יכולים להשפיע על המוקד.
הערה: במהלך הדמיה, הטמפרטורה נשלטת באמצעות תא קירור. טמפרטורת ברירת המחדל עבור הדמית תאים שאינם הדגיש היא 23 מעלות צלזיוס. תנאי עומס חום, הטמפרטורה גדלה בהתאם לרמה הרצויה. אלמנט פייזו בתא הקירור יכול להגיב מהר מאוד אל משמרת הטמפרטורה. עם זאת, ההתמקדות של התמונות תשתנה במקצת (זה יכול לסטות עד 20 מיקרומטר בהתאם במשמרת הטמפרטורה). לפיכך refocusing הידנית נדרשת בתוך הדקות הראשונות של רכישת תמונה, אלא אם מיקרוסקופ המשמש מצויד עם דגש אוטומטי חומרה.

  1. תמונת רכישה בתנאים שאינם הדגישו
    1. תאי תמונה בתנאים שאינם הדגיש ב 23 ° C, לרכוש מינימום של 6 שדות מבט (FOVs).
      הערה: מצב ללא מתח יכול להיות visualizאד או על ידי הקלטת זמן לשגות קצר (5-30 דקות) או רכישת סטילס נציג. עבור כל קו תנאי או תא לרכוש מינימום של 6 שדות מבט (FOVs).
      הערה: במקרה תאים בודדים הם בעלי עניין, למקם את התאים המתאימים באמצע FOV ולהקליט סדרת אריח 3 x 3 עם FOV המכיל את התאים של עניין באמצע ד. תאי discoideum הם ניע ועלולים להעביר מתוך FOV. עם זאת, סדרת האריח 3 x 3 מגדילה את השטח בחן באופן פוטנציאלי על ידי התא של עניין והוא נשאר למעקב לתקופות זמן לשגות של ~ 6 שעות.
    2. רוכשת Z- ערימות של 7 מיקרומטר מקסימלית 1-0.25 מיקרומטר צעדים כדי ללכוד את כל נפח התא.
    3. לרכוש תמונה בשדה בהיר התייחסות להעריך את המספר הכולל של תאים.
  2. תמונת רכישה עבור עומס חום
    1. כוון את הטמפרטורה של חדר הקירור עד 30 מעלות צלזיוס על פי הוראות היצרן.
    2. לאחר תצוגת הטמפרטורה הגיעה לערך הרצוי, ולמקד ידני בערוץ השדה הבהיר ולבדוק כל FOVs שנרשם לפני תחילת הזמן לשגות.
    3. התחל זמן לשגות עבור 4 שעות של עומס חום עם מרווח זמן של 5-10 דקות בין נקודות זמן. בדוק אם נכונה התמקדות במהלך רכישת שתי נקודות בפעם הראשונה.
  3. תמונת רכישה במהלך התאוששות
    1. לאחר עומס החום, להפחית את הטמפרטורה בחזרה ל -23 מעלות צלזיוס, ולחכות תצוגת טמפרטורה להתאים ולמקד באופן ידני.
    2. שיא זמן לשגות סרטים ב שלב ההחלמה במשך 8-10 שעות ב 10-20 במרווחים דקות זמן. בדקו אם נכונו התמקדות במהלך הרכישה של הנקודה לראשונה.

ניתוח תמונה 3.

הערה: כדי לכמת את מספר תאי מחסה מוקדי cytosolic, להעריך את המספר הכולל של תאים ואת מספר התאים עם מוקדי cytosolic בכל זמןמִסגֶרֶת. בשל הקושי של פילוח תאים מתמונות שדה בהירים, כימות צריכות להתבצע באופן ידני. בחלק הבא, ניתוח נתונים מתואר עבור חבילת עיבוד תמונה חינם ((http://fiji.sc/Fiji). זה דורש את הפלאגין "מונה תא" (http://fiji.sc/Cell_Counter).

  1. הערכת מספר כולל של תאים
    1. טען את ערימת תמונה בשדה הבהירה (XYT) על ידי לחיצה על "קובץ" ו "פתח".
    2. פתח את תוסף "תא מונה" ( "תוספים" - "מונה תא"). טען את ערימת תמונה על ידי לחיצה על "אתחול".
    3. בחר את הסוג המתאים של מונים על ידי סימון התיבה המתאימה.
      הערה: שימוש מסוג 1 כמו דלפק עבור מספר כולל של תאים מסוג 2 כמו דלפק עבור תאים עם מוקדי cytosolic. לספור את כל התאים.
    4. שמור את הסמנים על ידי לחיצה על "שמור סמנים".
  2. הערכת מספר התאים עם מוקדי cytosolic
    1. טען את hyperstack תמונה הקרינה (XZYT) ( "קובץ" - "פתח") ולעשות הקרנת העוצמה המקסימלית באמצעות "Z-מקרן" (תמונה / ערימות).
    2. פתח את התוסף "תא המונה". טען את ערימת התמונה המתקבלת (XYT) על ידי לחיצה על "אתחול".
    3. טען את הסמנים על ידי לחיצה על "מרקרים טען".
      זהירות: שמות הקבצים של תמונת התייחסות ערימת הקרינה חייבים להיות זהים. במידת הצורך, לשנות בהתאם לפני אתחול מחסנית התמונה.
    4. בחר את סוג הסמן המתאים (ראה 3.1.3) ולספור תאים עם מוקדי cytosolic. הסמנים קיימים יכולים לשמש הדרכה לתפקיד של תאים בודדים.
    5. תחזר את מספר ספירות לכל פרוסה על ידי לחיצה על "תוצאות" ולשמור את הספירה במקום אחרת לחישובים נוספים.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול ההדמיה המתואר יכול לשמש כדי לנתח את ההתנהגות של חלבוני צבירה נוטה כמו-פריון ב האמבה ד discoideum במהלך עומס חום. איור 1 מציג את התפלגות Q103 חלבון polyglutamine-tagged GFP בתאים בתנאי צמיחה נורמלים (איור 1 א), אחרי 2 שעות של עומס חום על 30 מעלות צלזיוס (איור 1B) ואחרי 6 שעות של התאוששות מתח צמיחה בתנאי צמיחה נורמלית (איור 1 ג). עם עליית טמפרטורה מ -23 ° C עד 30 ° C, סמן GFP-Q103 מתמזג מתוך הפצה מפוזרת כדי punctate מבנים. עם שחרורו וצמיחת לחץ בטמפרטורה רגילה, מבנים אלה לפזר. חלוקים מחדש של Q103-GFP ההיווצרות של מוקדי cytosolic חום הנגרמת מתח ניתן לכמת באמצעות ניתוח תמונה. איור 2 א מראה את ניתוח FOVs הבודד באמצעות פיג'י ואת התוסף "Cell לדלפק ". איור 2B מראה את כימות של תגובת הלחץ החום. זה מראה כי גידול מוקדי Q103-GFP cytosolic במספרים עם עומס חום מתמשך. במהלך עקת חום, חלבון באיכות מלאה (PQC) המערכת הוא המום, ובכך aggregation- חלבונים נוטה כגון Q103 חלבון כמו-הפריון לא יכול להישמר במצב מסיס יותר ויותר המצרפי מוקדים cytosolic. התאים גם להראות עיגול מאפיין, כמתואר באיור 1B. צמצום מוקדי cytosolic לאחר הסרת הלחץ עולה כי מצטברים חלבונים הם מומסים.

איכות ההדמיה רגישה צפיפות התא הראשונית. איור 3 מראה דוגמא של תאים לאחר התאוששות מתח, השוואת צפיפות תא ראשונית מתאימה (איור 3 א) ו צפיפות תא ראשונית גבוהה (איור 3). אם צפיפות התאים הראשונית היתה גבוהה מדי, כוכב תאיםטד כדי ליצור זרמי כמתואר איור 3B. זה המטיל קשיים על כימות הבאים בתור התאים עברו מן המטוס מוקד.

השיטה המתוארת ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר שינויי מושרה טמפרטורה כפי שתואר לעיל. זה יכול לשמש גם כדי להפחית רעילות צילום כאשר הדמיה בטמפרטורת הצמיחה פיזיולוגי. איור 4 מציג השוואה של תא צילמו ב 23 מעלות צלזיוס (איור 4 א) תא הקירור ותאי צילמו ללא בקרת טמפרטורה בחדר ממוזג, להגדיר עד 25 ° C (איור 4B). עם חשיפה מתמדת לאור העירור, תאים לעגל כלפי מעלה כאשר לא צלמו בתנאי בקרת טמפרטורה. שינוי זה בצורת התא הוא המציין מתח.

figure-results-1
איור 1: טרונג> חלבונים Aggregation נוטה כמו-הפריון לשנות ההפצה הסלולרי שלהם במהלך עומס החום. מתויג GFP אקסון huntingtin polyglutamine עשירי 1 (Q103) באה לידי ביטוי constitutively ב AX2-214 ד תאי discoideum (אות ה- GFP מתוארת בטבלת בדיקה גונית אפור הפוכה). (א) בתנאי צמיחה נורמלים ב 23 ° C, Q103-GFP מופץ מתפזר ברחבי הציטופלסמה. (ב) אחרי שעה 2 של עומס החום על 30 מעלות צלזיוס, Q103-GFP מתמזגת לתוך מוקדים cytosolic (חצים אדומים). התאים להראות שינוי צורה אופייני לעגל כלפי מעלה. (ג) עם שחרורו וצמיחה מתח ב 23 ° C, מוקדי cytosolic מתמוססים. לאחר 6 שעות, ללא מוקדים cytosolic ניתן לצפות. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

page = "1"> figure-results-2
איור 2: כימות של היווצרות מוקדי cytosolic חום נגרמת (א) ניתוח של תאים באמצעות החבילה בעיבוד תמונות חינם פיג'י ואת התוסף "מונה Cell".. הסכום הכולל של תאים (סוג 1, סמני דלפק כחולים) נקבע בתמונה בשדה הבהירה. הסמנים נטענים בערוץ-GFP ואת מספר התאים עם מוקדי cytosolic (סוג 2, סמני דלפק אדומים) נקבע. (ב) כימות של מוקדים לאחר 3 שעות של עומס החום על 30 מעלות צלזיוס ו -3 שעות של התאוששות מתח ב 23 ° C (n = 4 שדות מבט, שגיאה בר = SD). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של זה דמות.

figure-results-3
g> איור 3: השפעת צפיפות התאים על הדמיה לטווח ארוך זמן לשגות (א) תאים צילמו בצפיפויות התא הראשוני <10 5 תאים / מ"ל.. אחרי 3 שעות של עומס חום על 30 מעלות צלזיוס ו -6 שעות של התאוששות מתח ב 23 ° C, תאים עדיין להישאר במחזור וגטטיבי ומתחלק. רק כמה תאים לצאת מישור המוקד. (ב) תאים צילמו בצפיפויות התא הראשוני> 10 6 תאים / מ"ל. לאחר 9 שעות של הדמיה (הגדרות כמו א), תאים נכנסו מעגל ההתפתחות והחל הזרמה וצבירה. תאים של המצרפים לא ניתן להבחין בבירור. חלק גדול של תאים יוצא המטוס מוקד ולא ניתן לנתח. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

.jpg "/>
איור 4:. השפעת בקרת טמפרטורה על תופעות phototoxic (א) תאים צילמו במשך 10 דק 'עם בקרת טמפרטורה ב 23 ° C: 6 שדות מבט, Z- מחסנית (ריווח 0.5 מיקרומטר, מדגם עובי 8 מיקרומטר), זמן לשגות (סה"כ זמן 10 דקות, לשגות 1 דק '), ערוץ GFP (0.07 זמן החשיפה msec, 10% עוצמת הלייזר), ערוץ RFP (0.1 זמן חשיפה msec, עוצמת הלייזר 10%). והתא לא מראה סימנים של שינויים מורפולוגיים מאפיין הקשורים ללחץ phototoxic. (ב) תאים צילמו במשך 10 דק 'ללא בקרת טמפרטורה (באותם תנאים כמו A). תאי מפגיני סימנים של עיגול מושרה phototoxic, המציין מתח. בר סולם = 10 מיקרומטר. התאים היו צלמו על מערכת המבוססת על מיקרוסקופ עם מטרת 100x / 1.4 צמצם מספרי (NA). התמונות נאספו עם מצלמת CCD כמו 1,024 x 1,024 קבצים פיקסל באמצעות 1 x 1 binning.4large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול המתואר כאן יכול לשמש כדי לחקור את ההתנהגות של חלבון מסוים של ריבית בתגובה ללחץ חום נגרם. העלאת הטמפרטורה ל -30 מעלות צלזיוס דווחה כדי לעורר תגובה חום מתח בתנאים אלה את הכדאיות של ד discoideum מצטמצם במידה ניכרת.

שינויים
הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי להשוות את ההתנהגות של חלבונים שונים באותם תנאי המתח. לשם כך, תאי מבטאי חלבונים שונים עם התג פלורסנט באותו מועברים לתוך מנות רבות גם, כגון ארבע מנות קאמריות (סעיף 1.3.1). הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם על תאי שיתוף לבטא חלבונים עם סמנים שונים, כגון GFP או RFP. זה יכול להיות למשל להשתמש כדי לפקח על התנהגותם של מרכיבים שונים של בקרת איכות חלבון (PQC) המערכת. תאים להביע את סמן צבירה מתויג GFP ורכיבי PCQ RFP-tagged שונים ניתן לצפות באמצעות היטב רביםהשביע הדמיה. הדבר מבטיח אותם תנאי המתח (מהירות העלאת טמפרטורה / ירידה, משכו זמן ירידת טמפרטורת גידול /) ומאפשר מחקרים השוואתיים.

יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מערכת PQC על תגובת עומס חום. הפעילות של הרכיבים יכולה להיות מווסתת על ידי שינוי רמות ביטוי באמצעות כלים גנטיים כגון נוק-אאוט או ביטוי יתר או באמצעות מעכבים ספציפיים זמינים מסחרי 6. הפרוטאזום יכול להיות מעוכב על ידי הוספת MG132 (100 מיקרומטר) או lactacystin (10 מיקרומטר) אל מדיום הגידול. המלווה Hsp90 יכול להיות מעוכבים באמצעות geldanamycin (6 מיקרומטר) או radicicol (10 מיקרומטר). המלווה Hsp70 יכול להיות מעוכב עם VER-155,088, למרות שאנחנו לא יכולים לאשר את היעילות של העיכוב במסגרות הניסיוניות שלנו עד כה. מעכבים יש להוסיף יום אחד לפני הדמית התאים וטופחו במשך 14 שעות.

Criti צעדי cal בתוך הפרוטוקול
השלב הקריטי להערכת הפרעות החומות נגרם הוא המדינה של התאים לפני ניסוי ההדמיה. מחקרים הראו כי תאי שמרים לרכוש עמידות מגוון של לחצים סביבתיים בשלב נייח 13. אנו הבחנו גם היענות מינימלית עומס החום מיושם אם ד תאי discoideum הגיעו שלב נייח לפני ההדמיה. לכן, שמירה על מספר תא קבוע <5 x 10 5 תאים / מיליליטר הוא קריטי.

יתר על כן, מספרים סלולריים גבוהים יכולים לגרום מעבר מהמעגל וגטטיבי של ד Discoideum למעגל התפתחותית, ובכך מפעיל מסלולים רעבים, אשר עלול להוביל לתגובה שונה לחום מתח. אם מספרים סלולריים גבוהים מתקבלים שלב ההחלמה לאחר עומס חום, הזרמה ותאי צבירה יכולים להפריע ניתוח נתונים שעליהם בנויי התאים לנוע מחוץ לפוקוס (ראה איור 4).

תוכן "> הגבלת הטכניקה
ההפסד של המוקד הוא צוואר הבקבוק של הפרוטוקול. במהלך שינויי טמפרטורה, במישור המוקד יכול להעביר באופן דרסטי, המחייב refocusing ידני פרק זמן מיד לאחר לשינוי הטמפרטורה. הקפצתי את הפוקוס לפעמים יכול להיות קיצוני מדי בכדי להתגבר עליהם על ידי פוקוס אוטומטי תוכנה, במיוחד אם הזמן בין נקודות הזמן הוא גבוה. עם זאת, אם מיקרוסקופ המשמש מצויד פוקוס אוטומטי חומרה, צוואר הבקבוק הזה ניתן לעקוף.

משמעות של הטכניקה ביחס שיטות קיימות
לשם השוואה עם setups קיים כגון השימוש של חדרים ממוזגים, תיבות דגירת בקרת טמפרטורה מכסות את היעדים ואת הבמה מיקרוסקופ או בשלבי בקרת טמפרטורה וצווארוני מטרה, השימוש בתא קירור מספק שליטה מדויקת יותר של הסביבה טֶמפֶּרָטוּרָה. פלטייה האלמנט בתא הקירור יכול לשמור על TEM קבוע והאחידperature ברחבי ההתקנה הניסיונית. ב setups הקלסית, הבדלי טמפרטורה מקומיים עשויים להוביל לתוצאות תצפית שונות. יתר על כן, הוא יכול להגיב במהירות במהירות לשינויים מושרים הטמפרטורה, בעוד setups הקלסית להסתגל לאט מאוד לשינויי טמפרטורה מושרות, במיוחד הורדת הטמפרטורה. פלטייה אלמנט בתא הקירור יכול גם לכסות טווח טמפרטורה רחב יותר (15-40 מעלות צלזיוס) מ setups הקלאסית, שבה הטמפרטורות להגיע כמו 15 מעלות צלזיוס או 40 ° C הוא מאוד קשה.

Discoideum Dictyostelium הוא רגיש במיוחד רעילות צילום. מחקרים קודמים השתמשו ascorbate כמו נבלות להפחית רעילות צילום. עם זאת, תקופות הדמיה ארוכות דורשות תוספת נוספת. יתר על כן, השימוש ascorbate מוגבל ללימודים בהן מנגנון הריבית אינו מושפע תוסף נוגד חמצון. אנו מציעים כי הדמיה שבשליטת הטמפרטורה יכולה לשמש חלופה apprאוח למזער רעילות תמונה וניתן לשלבו עם תוספת של ascorbate להפחית רעילות נוספת.

תופעות phototoxic ניתן למזער על ידי מתן טמפרטורה קבועה ואחידה של 23 ° C באמצעות תא קירור. תאים הדמיה באמצעות בקרת טמפרטורה להראות פחות סימנים של רעילות צילום, עיגול תא כזה, במשך פרק זמן ארוך יותר. זה גם מאפשר הדמיה עם עוצמות גבוהות, מרווחי זמן קטנים יותר או יותר שדות נוף (FOVs).

יישום כללי
עומס חום בטמפרטורות גבוהות הוכח לעורר תגובת לחץ חום שונה 14. לכן, הגדלת הטמפרטורה ל 34 מעלות צלזיוס או 37 ° C עלולה לגרום תגובה שונה. בנוסף לחץ הטמפרטורה מיושם, משך מצב מתח מסוים יכול להיות שונה כדי לחקור את התגובה המיידית או הסתגלות לטווח ארוך לחום מתח.

באופן כללי, הפרוטוקול המתואר יכול להיותהתרחב מערך רחב של יישומים. מאחר בקרת הטמפרטורה המדויקת מפחיתה באופן משמעותי אפקטים לתמונה רעילה, הפרוטוקול ניתן להשתמש במסגרות הדורשות זמני חשיפה גבוהים ו / או עוצמות אור עירור גבוהות, למשל, המאפשרים הדמית חלבונים עם רמת ביטוי נמוכה, או בשילוב עם מרווחי זמן קצרים בין הדמיה, למשל, במהלך ההדמיה זמן לשגות. זה גם יכול להיות יתרון עבור הדמיה חפצה פורש התא כולו, למשל, microtubules, כמו הגדרות אלה דורשים מספר גבוה של z-חלקים אופטיים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין תודות.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AX בינונילבינוניAXM0102
LoFlo בינונילבינוניLF1001
MG132סיגמאC2211
לקטציסטיןסיגמאL6785
Geldanamycinסנטה קרוזsc-200617
RadicicolSanta Cruzsc-200620
MatTek disch 35 מ"מתאגיד MatTekP35G-1.5-14-Cצלחת הדמיה תחתונה מזכוכית
צלחת תרבית תאים CellViellגריינר627870צלחת הדמיה תחתונה זכוכית בעלת 4 תאים
תנור חימום/מצנן שלב תרמי הכנס WarnerIstrumentsTB-3/CCD
בקר טמפרטורה דו קוטביWarner IstrumentsCL-100
מערכת קירור נוזליוורנר מכשיריםLCS-1

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bonner, J. T. Evidence for the Formation of Cell Aggregates by Chemotaxis in the Development of the Slime Mold Dictyostelium Discoideum. Journal of Experimental Zoology. 106 (1), 1-26 (1947).
  2. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Developmental Biology. 391 (1), 1-16 (2014).
  3. Nichols, J. M. E., Veltman, D., Kay, R. R. Chemotaxis of a model organism: progress with Dictyostelium. Current Opinion in Cell Biology. 36, 7-12 (2015).
  4. Williams, J. G. Dictyostelium finds new roles to model. Genetics. 185 (3), 717-726 (2010).
  5. Müller-Taubenberger, A., Kortholt, A., Eichinger, L. Simple system - substantial share: The use of Dictyostelium in cell biology and molecular medicine. European Journal of Cell Biology. 92 (2), 45-53 (2013).
  6. Malinovska, L., Palm, S., Gibson, K., Verbavatz, J. M., Alberti, S. Dictyostelium discoideum has a highly Q/N-rich proteome and shows an unusual resilience to protein aggregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2620-E2629 (2015).
  7. Malinovska, L., Alberti, S. Protein misfolding in Dictyostelium: Using a freak of nature to gain insight into a universal problem. Prion. 9 (5), 339-346 (2015).
  8. Schneider, K., Bertolotti, A. Surviving protein quality control catastrophes - from cells to organisms. Journal of Cell Science. 128 (21), 3861-3869 (2015).
  9. Dobson, C. M. Protein folding and misfolding. Nature. 426 (6968), 884-890 (2003).
  10. Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis. Methods in cell biology. 28, 347-356 (1987).
  11. Graf, R., Rietdorf, J., Zimmermann, T. Live cell spinning disk microscopy. Microscopy Techniques. 95, 57-75 (2005).
  12. Samereier, M., Meyer, I., Koonce, M. P., Graef, R. Live Cell-Imaging Techniques for Analyses of Microtubules in Dictyostelium. Methods in cell biology. 97, 341-357 (2010).
  13. Herman, P. K. Stationary phase in yeast. Current opinion in microbiology. 5 (6), 602-607 (2002).
  14. Loomis, W. F., Wheeler, S., Wheeler, S. Heat shock response of Dictyostelium. Developmental Biology. 79 (2), 399-408 (1980).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Dictyostelium discoideumHeat Stress ResponseProtein Quality ControlTemperature controlled ImagingLive Cell ImagingCytosolic Foci AnalysisQ103 GFP MarkerPhototoxicity ReductionZ stack AcquisitionTime lapse Microscopy

מאמרים קשורים