הפרעות בקצב לב בירושה לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות המשנות את מסירת השטח של תעלות יונים אחד או יותר. הנה, אנחנו מתאימים זרימת cytometry מבחני לספק כימות של ביטוי החלבון הכולל ותא יחסית משטח של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי בתאים TSA-201.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
קביעת פני התא יחסית והביטוי סה"כ של תעלות יונים רקומביננטי שימוש cytometry זרימה
במאמר זה
סיכום
תקציר
מוטציות תורשתיות או דה נובו בערוצים סלקטיביים של קטיון עלולות להוביל למוות לבבי פתאומי. לעתים קרובות מניחים ששינוי בסחר בקרום הפלזמה של חלבונים טרנסממברניים מרובי מתפרשים אלה, עם או בלי שינוי בשער התעלה, תורם באופן משמעותי לתהליך זה. לכן זה הפך להיות קריטי לפתח שיטה לכימות השינוי בביטוי פני התא היחסי של תעלות יונים לבביות בקנה מידה גדול. כאן, ניתן פרוטוקול מפורט לקביעת הביטוי הכולל היחסי ופני התא של תעלות סידן לבביות מסוג L CaV1.2 ותת-יחידות הקשורות לממברנה בתאי tsA-201 באמצעות מבחני ציטומטריה פלואורסצנטיים דו-צבעוניים. בהשוואה לשיטות איכותניות אחרות המבוססות על מיקרוסקופיה או מבוססות אימונובלוטינג, ניסויי זרימה ציטומטריה הם מבחנים מהירים, ניתנים לשחזור ובנפח גדול המספקים נקודות קצה ניתנות לכימות על דגימות גדולות של תאים חיים (הנעים בין 104 ל -106 תאים) עם מאפיינים תאיים דומים בזרימה אחת. המבנים תוכננו לבטא באופן קונסטרוקטיבי mCherry בקצה C התוך-תאי (ובכך לאפשר הערכה מהירה של ביטוי החלבון הכולל) ולבטא אפיטופ המגלוטינין חוץ-תאי (HA) כדי להעריך את ביטוי פני התא של חלבוני ממברנה באמצעות נוגדן מצומד פלואורסצנטי נגד HA. כדי למנוע שלילי כוזב, נערכו ניסויים גם בתאים חדירים כדי לאשר את הנגישות והביטוי התקין של אפיטופ HA. הנוהל המפורט מספק: (1) תכנון של מבני DNA מתויגים (חומצה דאוקסיריבונוקלאית), (2) טרנספקציה מתווכת שומנים של מבנים בתאי tsA-201, (3) תרבית, קציר וצביעה של תאים לא חדירים וחדירים, ו-(4) רכישה וניתוח של אותות פלואורסצנטיים. בנוסף, העקרונות הבסיסיים של זרימה ציטומטרית מוסברים ותכנון הניסוי, כולל בחירת פלואורופורים, טיטרציה של נוגדן HA וניסויי בקרה, נדון ביסודיות. גישה ספציפית זו מציעה כימות יחסי אובייקטיבי של הביטוי הכולל ופני התא של תעלות יונים שניתן להרחיב לחקר משאבות יונים ומובילי קרום פלזמה.
מבוא
מאמר זה מספק assay אמין לדווח הביטוי שטח פני התא היחסי של חלבונים בממברנה כגון תעלות יונים לידי ביטוי בתאים רקומביננטי באמצעות טכנולוגית cytometry הזרימה הקיימת. תעלות יונים הן חלבונים בממברנה נקבוביים יוצרים שאחראים לשליטת אותות חשמליים על ידי gating את זרימת יונים על פני קרום התא. הם מסווגים על ידי מנגנון הפעלה, טבע, סלקטיביות של מינים יון העוברים דרך הנקבוביות שבו הם נקודתיים. ברמה התאית ורקמות, והנתיבים יון מקרוסקופית דרך תעלות יונים הם תוצר של biophysical (gating ו חלחול), ביוכימיות (זירחון), ו biogenesis (סינתזה, glycosylation, סחר, השפלה) נכסים 1. כל התהליכים הללו הוא ייחודי לכל סוג של תעלות יונים, והוא מותאם ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. בונה DNA Tagged כפלים
- הכנס את epitope HA (YPYDVPDYA) ב והמקשר התאי של α2δ1 Ca V בין D676 ו- R677 על ידי mutagenesis באתר ביים (איור 3 ב) 20. השתמש קדימה פריימר gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC הפוך acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC פריימר.
- Subclone רצף cDNA של α2δ1 V HA Ca מתויג לתוך וקטור ביטוי pmCherry-N1 היונק נועד לבטא את החלבון התמזג N- הסופית של mCherry בין אתרי SACI ואת סאלי (איור 3B) 20.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מאמר זה מתאר פרוטוקול אמין לכמת פנים כולל ותא של תעלות יונים רקומביננטי לידי ביטוי TSA-201cells ידי זרימת שני צבעים cytometry assay. כדוגמה, פני התא ביחס וביטוי החלבון הכולל היה לכמת עבור α2δ1subunit ע"א. על מנת לבצע את זרימת שני צבעי cytometry assay, Ca V α2δ1 תויג כפליים להביע HA epitope ללא ניאון תאי שיכול להיות מזוהה על ידי נוגדן אנטי HA FITC- מצומדות ו fluorophore mCherry מכונן פלורסנט התאי. ספקטרום עירור ופליטה עבור.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Assay cytometry מבוסס זרימה זו יושם בהצלחה על מדידת רמות פן כולל ותא היחסיים של fluorescently שכותרתו יוצרי הנקבוביות הקשורים יחידות המשנה של ערוצי סידן מגודר מתח 14,22,26. עדיף להשתמש כאשר חוקרים את ההשפעה של מוטציות גנטיות וכך מחייב כי עוצמת הקרינה הפנימית של המבנה fluorescently שכותרתו מתויג wild-type להיות לפחות 10 עד פי 100 גדול יותר עבור עוצמת הקרינה של לבנות מתויגות שכותרתו fluorescently . במקרה המסוים הזה, לבנות mCherry-Ca V α2δ1-HA המתואר כאן הניב או.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
אנו מודים למר סרג' סנשל ולד"ר ז'אק ת'יבודו על שיתוף המומחיות שלהם והענקת גישה לפלטפורמת הזרימה ומיון התאים שלהם. עבודה זו הושלמה עם מענק תפעולי 130256 מהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות, מענק סיוע מקרן הלב והשבץ הקנדית, ותמיכה מ-"Fondation de l'Institut de Cardiologie de Montréal" ל-L.P.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Q5 ערכת מוטגנזה מכוונת אתר | New England Biolabs | E0554S | בערכת מוטגנזה מכוונת אתר של QuickChange (Agilent, #200523). |
| שפופרות 1.5 מ"ל | Sarstedt | 72-690-001 | |
| שפופרות 15 מ"ל | סרסטדט | 62-554-002 | |
| צנרת Tranfer חד פעמית מדורגת | VWR | 160001-192 | |
| צלחת תרבית 100 מ"מ | קורנינג | 430167 | לתרבית סטנדרטית של תאי HEKT. |
| צלחת תרבית 35 מ"מ | פלקון | 353001 | לתרבית סטנדרטית של תאי HEKT. |
| פיפטה סרולוגית 1 מ"ל | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| פיפטה סרולוגית 5 מ"ל | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| פיפטה סרולוגית 10 מ"ל | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| פיפטה סרולוגית 25 מ"ל | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| מדיום הגלוקוז הגבוה של Dulbecco | Life Technologies | 12100-046 | חם ב 37 & דג; C אמבט מים לפני השימוש. |
| סרום בקר עוברי, מאושר, מושבת בחום, ממקור ארה"ב | Life Technologies | 16140-071 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ליפופקטמין 2000 | Life Technologies | 11668-019 | לטרנספקציה ליפוזומלית. ניתן להחליף בטרנספקציה של סידן פוספט. |
| Opti-MEM I סרום מופחת Medium | Life Technologies | 31985-070 | חם ב-37 מעלות; C אמבט מים לפני השימוש. |
| טריפסין-EDTA (1x) 0.05%, פנול אדום | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 מ"ל מיקרו-שפופרות | Sarstedt | 72.690.001 | |
| פוספט חוצץ מלח 1x | פישר | BP661-10 | יכול להיות "תוצרת בית". |
| נוגדן מצומד Anti-HA FITC | Sigma | H7411 | |
| IgG1& FITC נוגדן לבקרת איזוטיפים | Sigma | F6397 | |
| BD ערכת פתרון קיבוע/פרמיביליזציה ציטופיקס/ציטופרם | Biosciences | 554714 | קיבוע/חדירה. תמיסת פרמיביליזציה/שטיפה, יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. |
| המציטומטר | פישר | 49105161 | |
| טריפן בלו | פישר | 15250061 | כדי לגשת לכדאיות התא. |
| מיקרוצנטריפוגה מקוררת, 5430R | Eppendorf | ||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | ציטומטר זרימה. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | לניתוח נתונים. |
מקורות
- Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
- Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defec....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
