ניטור מרחבי הפרדה Surface מיישבים אוכלוסיות מיקרוביאליות

Summary

תפקידו של מבחר (הפרדה מרחבית) בתרחישים האבולוציונית ניתן לבדוק באמצעות מערכות חיידקים פשוטה במעבדה המאפשרים נשלט התאמת הפריסה המרחבית. על ידי שינוי צפיפות התאים המייסדים, רמות מבחר שונות ניתן מדמיינות באמצעות זני חיידקים שכותרתו fluorescently ב biofilms המושבה של Bacillus subtilis.

Abstract

חיידקים מספקים מערכת מסקרנת לחקר אינטראקציה חברתית בין פרטים בתוך אוכלוסייה. זמני הדור הקצרים והליכי השינוי הגנטי הפשוטים יחסית של חיידקים מקלים על התפתחות תחום הסוציו-מיקרוביולוגיה. כדי להעריך את ההתאמה של מינים מיקרוביאליים מסוימים, ניתן לתייג ולעקוב אחר זנים נבחרים או נגזרותיהם המהונדסות גנטית בתוך אוכלוסייה אחת, באמצעות מיקרוסקופיה המותאמת עם מסנני פלואורסצנציה מתאימים. ניתן להשתמש במושבות מתרחבות של מינים מיקרוביאליים מגוונים על מדיה אגר כדי לנטר את ההתפלגות המרחבית של תאים המייצרים חלבונים פלואורסצנטיים ייחודיים.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לשימוש בזני חיידקים המייצרים חלבון פלואורסצנטי ירוק ואדום כדי לעקוב אחר סידור מרחבי במהלך התיישבות פני השטח, כולל תנועה קהילתית מונעת דגל (נחילים), התפשטות מתווכת צמיחה תלויה באקסופוליסכריד והידרופובין, והיווצרות ביופילם מורכב של מושבה. ניתן להשתמש בבודדים לא מבויתים של החיידק הגראם-חיובי, Bacillus subtilis כדי לבחון תכונות מסוימות של התפשטות פני השטח והשפעתן על התפלגות דו-ממדית על המדיום המוצק באגר. על ידי שינוי מספר התאים המשמשים להתחלת ביופילמים של מושבה, ניתן לשנות את רמות המבחר בקנה מידה מתמשך. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זמן-lapse כדי לחזות באינטראקציה בין פנוטיפים וגנוטיפים שונים ברמת מבחר מסוימת וכדי לקבוע את ההצלחה היחסית של כל אחד מהם.

Introduction

בעשורים האחרונים, חיידקים הוכרו קהילות חברתיות הקשורות מערכות אקולוגיות שונות על פני כדור הארץ ^1,2. בניגוד לתרבויות planktonic בשימוש בפועל במעבדה בכלל, חיידקים בסביבה להראות מגוון רחב של מבני קהילה מרחבית בהתאם להגדרה האקולוגית. מערכות חיידקים פשוטות יכולות להיות מנוצלות כדי להבין את כל ההשלכות של מבנים מרחביים על האבולוציה של אינטראקציות חברתיות ^3,4. פרסומים ב 2-3 השנים האחרונות תוך שימוש במערכות מודל האיקריוטים פרוקריוטים הדגישו את ההשפעה של מבנים מרחביים על היציבות של שיתוף פעולה בתוך אוכלוסיות חיידקים ^5-8. בנוסף, לחייב אינטראקציות בין חיידקים, למשל מטבולית צולבות האכלה, אולי גם לשנות את הפריסה המרחבית של השותפים באינטראקציה ^9-11. השפעת המבנה המרחבי במחקרים אלה נבחנת בעיקר באמצעות תאים נייחים מצורף משטח המאכלסים את כל כךbiofilms -called או במושבות גוברים על פני השטח של מדיום אגר. סחיפה גנטית וכתוצאה מכך מגוון מרחבית גבוה ניתן לצפות במושבות חיידקים שבו דלדול מזין בקצה של תוצאות רחבות בתיווך חלוקת תא בסדרה של צווארי בקבוק גנטיים גורם הסתברות קיבעון מקומי גבוהה עבור linages המשובט מסוים ^12. ניתן סחיפה גנטית ולכן מועסק על מנת לבחון את התפקיד של הפרדה מרחבית במושבות חיידקים.

בסביבה, biofilms קהילות multispecies מוקף ¹³ מטריקס פולימריים בהפקה עצמית. מבנה biofilm, פונקציה ויציבות תלויה רשת מורכבת של אינטראקציות חברתיות שבם אותות חליפי חיידקים, רכיבי מטריקס ומשאבים, או מתחרים ביניהם על מקום וחומרים מזינים באמצעות רעלים ואנטיביוטיקה. Subtilis Bacillus הוא אדמה שוכני חיידק מיישב-שורש מפתח מאורגן קהילות ביופילם ^14. באנלוגיה כדי חברתיחרקים, B. תאי subtilis להעסיק חלוקת אסטרטגית עבודה, פיתוח תת-אוכלוסיות של מפיקי מטריקס ו קניבלים, תאי ניע, נבגים רדומים סוגי תאים אחרים ^15,16. תהליך הבידול הוא דינמי ניתן לשנות על ידי תנאים סביבתיים ^17,18.

אסטרטגיות של קולוניזציה שטח על ידי חיידקים ניתן להשפיע בקלות בתנאי מעבדה על ידי שינוי הריכוז אגר בתקשורת הצמיחה. ברמות נמוכות אגרו (0.2-0.3%), חיידקים מחסה שוטונים פעילים מסוגלים לשחות, תוך אגר חצי מוצק (0.7-1% אגרו) הופך לפשוט קהילה מונעת השוטון מתפשטת, שנקרא רוחשות ^19-21. בהעדר השוטון, זני חיידקים מסוימים מסוגלים לנוע על פני בינוני חצי מוצק באמצעות הזזה, התרחבות האוכלוסייה התלויה צמיחה כלומר בהנחייתם מטריקס exopolysaccharide ותרכובות hydrophobin המופרשים אחרים ^22-24. לבסוף, חיידקים אשר capablדואר של יוצרי מושבות פיתוח biofilm מורכבים מבחינה ארכיטקטונית על מדיום אגר קשה (1.2-2%) ^14,17,25. בעוד תכונות אלה נבחנות במעבדה על ידי התאמת התנאים בדיוק, בבתי גידול טבעי אלה אסטרטגיות משטח-הפצה אולי המעבר בהדרגה מאחד לשני בהתאם לתנאי הסביבה ^26. בעוד תנועתיות תא מבוססים הם קריטיים במהלך לתחילת עבודות הפיתוח ביופילם על הממשק הנוזל אוויר בשני חיידקים גראם-חיוביים -שלילית ^27, biofilms מושבה המורכב של B. subtilis אינם מושפעים המחיקה של תנועתיות flagellar ^28. עם זאת, הארגון המרחבי במהלך הפיתוח של B. biofilms מושבת subtilis תלוי בצפיפות של בידוד החיידקים בשימוש ליזום את ביופילם ^8.

כאן, אנו משתמשים ב subtilis להראות שהפרדה מרחבית במהלך הקולוניזציה משטח תלוי במנגנון של motili האוכלוסייה ברמהty (כלומר רוחשות או זזה), ופיתוח ביופילם המושבה תלוי צפיפות התאים המייסדים. אנו מציגים כלי מיקרוסקופ פלואורסצנטי שניתן ליישם כדי לפקח הצמיחה ביופילם מיקרוביאלי ברציפות, קולוניזציה משטח ומיון בקנה מידה מקרו. יתר על כן, שיטת כימות מוצגת לקבוע את שפע הזן היחסי באוכלוסייה.

Protocol

1. הכנה של התקשורת בתרבות, חצי מוצק אגר ו Biofilm צלחות, טרום תרבויות

1. הכנה בינונית נוהרות ו זזים
   1. ממיסים 2 גרם של לנוקס מרק (LB) ו -0.7 גרם של אגר אגר ב 100 מ"ל מים החליפו יון החיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. השתמש בנפחים קטנים (50-200 מ"ל) כדי לשפר שחזור בין הניסויים.
   2. מיד לאחר עיקור, לסגור את הפקק של הבקבוק בינוני עד להפחית את אידוי ומניחים חממה 55 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2.
   3. לאחר לחום בינוני יש מזג ל -55 ° C, לשפוך בינוני 20 מ"ל אגר LB לתוך צלחת 90 ​​מ"מ קוטר קלקר פטרי מתחת למכסה המנוע מעבדה סטרילית. בניסויים זמן לשגות, לשפוך בינוני 5 מ"ל אגר LB לכל 35 מ"מ צלחת בקוטר פוליסטירן פטרי.
   4. סגור את צלחת פטרי מיד לאחר לשפוך, מחסנית לא יותר מ -4 צלחות על גבי אחד את השני ולתת המדיום אגר לחזק לפחות שעה 1.
2. 2xSG הבינוני Pפיצוי על Biofilms קולוני
   1. ממיסים 1.6 גרם של מרק מזין, 0.2 גרם של KCl, 0.05 גרם של MgSO ₄ 7H ₂ O, ו -1.5 גרם של אגר אגר ב 100 מ"ל מים החליפו יון החיטוי במשך 20 דקות ב 120 מעלות צלזיוס. השתמש בנפחים קטנים (50-200 מ"ל) כדי לשפר שחזור בין הניסויים.
   2. מיד לאחר עיקור, לסגור את הפקק של הבקבוק בינוני עד להפחית את אידוי ומניחים את הבקבוק בתוך חממה 55 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה 2.
   3. לאחר לחום בינוני יש עונתיות עצמית ל -55 מעלות צלזיוס, להוסיף 0.1 מ"ל מסנן עיקור 1M Ca (NO _{3) 2} פתרון, 0.1 מ"ל מסנן לעקר 100 מ"מ MnCl ₂ פתרון, 0.1 מ"ל מסנן מעוקר 1 מ"מ FeSO ₄ פתרון, ו -0.5 מ"ל פתרון 20% גלוקוז סטרילי.
   4. במנדף מעבדה סטריליים, לשפוך בינוני SG 2x אגר 20 מ"ל לכל צלחת קלקר 90 מ"מ קוטר פטרי. בניסויים זמן לשגות, לשפוך בינוני 5 מ"ל אגר LB לכל 35 מ"מ צלחת בקוטר פוליסטירן פטרי.
   5. קלודואר צלחת פטרי מיד לאחר המזיגה, לערום את הצלחת על גבי אחד את השני, אך לא יותר מ -4 צלחות, ולתת המדיום אגר לגבש במשך שעה 1 לפחות.
3. הכנת תרבויות Starter
   הערה: ב subtilis 168, זנים נגזרים NCIB 3610 משמש השיטות המתוארות להלן constitutively לייצר חלבונים בירוק או באדום-הקרינה ותוארו לפני ^8,27. זנים מאוחסנים באופן שגרתי במקפיא -80 ° C.
   1. לחסן תרבויות המתנע ממניות -80 מעלות צלזיוס ב 3 מ"ל מדיום LB דגירה לילה (16-18 שעות) בשעה 37 ° C עם רעד אופקי (225 סל"ד). אין דגירה התרבות כבר מ -18 שעות כמו פרא מבודד של B. subtilis נוטה בעיקר כדי לצבור ויוצרים ביופילם במבחנה.

2. Co-חיסון של זני חיידקים Labelled fluorescently עבור Surface הפצת

1. ייבוש צלחות אגרו חצי מוצק נחילהזזה של B. subtilis.
   1. צלחות אגרו יבשות רוחשות ומחליק במשך 20 דקות לפני החיסון. צלחות יבשות חשפו במנדף זרימה למינרית (ראו איור 1).
      הערה: רוחש חיידקים זזים תלויה היובש של המדיום אגר חצי המוצק. ייבוש מספיק מאפשר הצטברות מים על המדיום אגר וכתוצאה מכך שחייה בתיווך השוטון. תוצאות זמן ייבוש מתמשכות חוסר הרעש.

איור 1:.. עבודה ניסויית ההליך הנפוץ מתואר באיור, כולל הכנה של המדיום culturing, לייבש את הצלחת, חיסון וזיהוי מיקרוסקופ פלואורסצנטי (משמאל לימין) לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. Co-חיסוןשל תרבויות חיידקים עבור נוהרות ו הזזה
   1. לקבוע את הצפיפות האופטית של תרבויות המתנע הלילה ב 600 ננומטר ומערבבים זנים בייצור בירוקים ואדום-ניאון מנורמל צפיפות חלבון של B. subtilis NCIB 3610 או נגזרים המכשפה Δ שלה בתוך שפופרת 1.5 מיליליטר תגובה. לדוגמה, לערבב 100 μl של זן 1 עם (100 [OD ₆₀₀ של תרבות הלילה של זן 1] * / [OD ₆₀₀ של תרבות הלילה של זן 2]) μl של זן 2. במתינות מערבולת (3 שניות במהירות מקסימלית) עבור חלוקה הומוגנית.
      הערה: ב זני subtilis NCIB 3610 הם מחוסן להתבונן רוחשת, בעוד נגזר המכשפה Δ שלהם משמשים זזה.
   2. ספוט 2 μl של תרבות מעורבת על אמצע צלחת מראש יבשים (ראה איור 1) ובהמשך לייבש את הצלחת במשך 10 דקות לאחר חיסון.
   3. דגירת צלחות על 37 מעלות צלזיוס זקופה כדי לאפשר לחות עודפת להתעבות על המכסה ולא על פני השטח אגר.
      הערה: זמן דגירה של B. רוחשת subtilis היא בדרך כלל בין 8-16 שעות. באופן כללי, שפת הנחיל מגיע הצד של המנה 90 מ"מ פטרי ב 8 שעות. זזה היא תהליך איטי ודורשת לפחות 16 כדי 42 שעות של דגירה. לאחר 36 שעות, בחזית הזזה מגיע הצד של המנה 90 מ"מ פטרי.
   4. בניסויי זמן לשגות, למקם את כלי 35 מ"מ קוטר פטרי בתא דגירה בשלב שחומם מראש נקבע על 37 מעלות צלזיוס. ודא כי המכסה של צלחת פטרי נשאר סיר לאורך כל תקופת הניסוי. הגדר את השער של חממת הבמה כדי 40 מעלות צלזיוס לעקוף היווצרות לחות על החלק העליון של החממה.

3. Co-חיסון של זני חיידקי Labelled fluorescently עם צפיפות תא ראשונית שונה

1. ייבוש צלחות אגר עבור גיבוש המושבה Biofilm של B. subtilis.
   1. ייבש את הצלחות לפיתוח biofilm המושבה ללא כיסוי בזרימה למינריתמכסה מנוע במשך 15 דקות לפני החיסון.
      הערה: תוצאות ייבוש אין מספיק לחות מוגברת ושחייה או רוחש ייתכן שניתן ^29. ייבוש תוצאות ארוכות מדי במושבות ביופילם קטנות.
2. הכנת תרבויות Starter מדולל פי 10 עבור Biofilms קולוני
   1. מערבבים 100 μl של חלבון בירוק ואדום-ניאון ייצור של Starter Culture לילה של B. subtilis 168 בתוך שפופרת 1.5 תגובה מ"ל ו במתינות מערבולת עבור חלוקה הומוגנית. כן סדרת דילול של פי 10 במדיום LB.
   2. ספוט 2 μl של הלא מדולל או 10 ^1, 10 ^2, 10 ^3, 10 ⁴ תרבויות מעורבות מדולל על הצלחת המכיל בינוני וישכנע ביופילם.
      הערה: 6 עד 9 מושבות ביופילם יכולות להיות יזם על אף מנה 90 מ"מ פטרי תוך לקיחה בחשבון כי המושבות מופרדות במרחק שווה זה מזה.
   3. דגירת צלחות על 30 מעלות צלזיוס זקופה כדי לאפשר לחות עודפת להתעבות על המכסהלא על פני השטח אגר.
      הערה: זמן הדגירה של B. ביופילם subtilis הוא בין 1 עד 3 ימים. באופן כללי, ביופילם מושבה של B. subtilis מגיע לגודל הממוצע שלה מבנה מורכב ב 2 ימים.
   4. בניסויי זמן לשגות, להציב בידוד יחיד באמצע צלחת 35 מ"מ קוטר פטרי במקום צלחת בתא דגירה בשלב שחומם מראש נקבע על 30 מעלות צלזיוס. ודא כי החלק העליון של צלחת פטרי נשאר סיר לאורך כל תקופת הניסוי. הגדר את השער של חממת הבמה כדי 35 מעלות צלזיוס לעקוף היווצרות לחות על החלק העליון של החממה.

4. איתור מיקרוסקופ פלואורסצנטי של זני Labelled

1. תיאור מכשור הדמיה.
   1. כדי לזהות קולוניזציה שטח אותות קרינה, השתמש במיקרוסקופ זום סטריאו קרינה הממונע (ראה רשימה מפורטת בטבלת חומרים) מצויד מטרת 0.5x PlanApo, שני LEDמקורות קרים-אור (אחד עבור גילוי קרינה ואחד עבור האור הנראה), מערכות סינון עבור GFP (עירור ב 470/40 ננומטר פליטה ב ננומטר 525/50) ו mRFP (עירור ב 572/25 ננומטר פליטה ב 629 / 62 ננומטר), ומצלמה מונוכרום ברזולוציה גבוהה.
   2. בצע רכישת תמונה ועיבוד עם תוכנה מתאימה זמינה עבור מיקרוסקופ זום סטריאו כולל רבים ומודולים הזמן לשגות. לצורך ניסוי זמן לשגות, להשתמש חממה בשלב החימום תקן רכוב על מיקרוסקופ זום סטריאו עם מתאם.
2. הדמיה של רוחשות ורחבה זזות
   1. השתמש ההגדלה הנמוכה ביותר כדי ללכוד את האזור הגדול ביותר האפשרי של צלחת 90 ​​מ"מ. הגדר את מקור החיסון (באמצע צלחת 90 ​​מ"מ פטרי) אל פינת השדה הגלוי לניטור הרחבה רדיאלי חיידקי קרינה.
   2. התאם זמן חשיפה אופטימלית תלוי בכוחו של אותות הקרינה.
      הערה: לקבלת expre constitutivelyגני קרינת ssed ב B. subtilis, ירוק ו-קרינה אדומה עם זמני חשיפה שני 1.5 ו -3 ניתן להשתמש, בהתאמה. בנוסף, 10 זמן חשיפה msec מתאים האור הנראה.
3. השתמש הגדלה המאפשר זיהוי של המושבה ביופילם כולו ולהתאים את המושבה באמצע שדה הראייה.
   הערה: באשר שורצים ומחליקים הרחבות, פעמים חשיפה אופטימלית כדי לזהות את אותות הקרינה במושבות ביופילם תלוי ברמת הביטוי של הגנים המקודדים חלבונים ניאון. לקבלת תוצאות הנציג להלן, קרינה אדומה בירוקה ו זוהתה באמצעות מרווחי חשיפת שניות 1 ו -3, בהתאמה.
4. עבור הדמיה זמן לשגות, להשיג תמונות במרווחי זמן מסוימים באמצעות פעמים חשיפה מתמדת.
5. שמור את התמונות המוקלטות הקרינה סטראו בתבנית קובץ כי הוא מוכר על ידי תוכנת ImageJ לניתוח נתונים כמותיים.

5. Datניתוח

1. כדי לנתח את השטח הכבוש על ידי כל זן ניאון שכותרתו שונה, פתח את הקובץ של העניין ImageJ תוכנה מורחב עם תוסף BioVoxxel.
   1. כאשר חלון בשם "ביו-פורמטי אפשרויות יבוא" מופיע שם רק את האפשרויות "פותחים את כל הסדרה" ו "Autoscale" נבחרות, לפתוח את הקובץ על-ידי לחיצה על "אישור".
      הערה: הקבצים מוצגים ערימה של שלוש תמונות, אחת עבור כל ערוץ נהג להקליט תמונת המיקרוסקופ (בירוק, אדום-קרינה ותמונות שדה בהיר).
   2. הפרד את המחסנית לתוך תמונות ערוץ בודדות על ידי בחירה "תמונה" - "סטאקס" - "סטאק תמונות" בלוח בקרת ImageJ.
      הערה: תמונות מופיעות ממוספרות כמו 1/3 (מסלול ירוק), 2/3 (מסלול אדום) ו 3/3 (בהיר שדה). כאן, בתמונת השדה הבהיר היא נכללת בניתוח.
2. כדי לנתח את התמונות, לשנות כל לתמונה 8 סיביות על ידי בחירת"תמונה" - "סוג" - "8-bit".
3. כדי לקבוע את האזור הכבוש פיקסל ^2, לאפס את קנה המידה של תמונות באמצעות "ניתוח" - "קנה מידה 'מוגדר". כאשר יופיע חלון עם אפשרויות בקנה מידה אחרות, לאפס את קנה המידה על ידי בחירה "לחץ כדי להסיר סולם". סמן את האפשרות "גלובל" כדי להסיר את קנה המידה עבור כל התמונות הפתוחות.
4. כדי להסיר את הרקע, לצייר שטח סגלגל (אזור של עניין, החזר על השקעה) מחוץ לאזור פלורסנט שימוש באפשרות "הסגלגל" בלוח בקרת ImageJ.
   1. כדי להבטיח שגודל הסגלגל רקע זהה עבור כל התמונות ניתחו, להוסיף אותו מנהל ROI באמצעות [t] אופי של המקלדת. חלון מנהל ROI עולה שבו ROI הרקע הסגלגל ניתן לשמור באמצעות "יותר" - "שמורות" אפשרויות.
   2. אם ההחזר על ההשקעה רקע סגלגל גלוי על התמונה, למדוד את העוצמה של האזור על ידי בחירת "נתח" - "מדוד".
      הערה: תוצאותיופיע חלון שבו בין היתר את עוצמת הקרינה הממוצעת מוצגת בעמודה שכותרתה "Mean".
   3. הפחת את הערך של עוצמת קרינת רקע הממוצעת מהתמונה ידי ביטול בחירת ההחזר על השקעת הרקע הסגלגלה, לחיצה על "תהליך" - "מתמטיקה" - "פחת" והחדרת הערך הנמדד.
5. החלת סף לדימוי באמצעות "התמונה" - "התאם" - אפשרות "סף". בחר את שיטת Otsu ושחור-לבן (B & W). סמן את האפשרות "הרקע האפל" ולהעסיק את הסף על ידי לחיצה על "החל".
   הערה: שינויי תמונת תמונה בינארית שבו האזור שמעל הסף מוצג בלבן וכי מתחת לסף מוצג שחור.
6. בחר הכל מעל הסף דרך "נתח" - האפשרות "נתח חלקיקים". בחלון עם ההגדרות, לשמור את אפשרויות ברירת המחדל ולשמור על "הצג תוצאות" ו "Summarize "אפשרויות מסומנות. לחץ על" אישור "כדי להציג את הסיכום בחלון התוצאות והתצוגה באזור הכבוש בעמודה שכותרתה" סה"כ שטח ".

Results

מערכות מעבדה של אוכלוסיות חיידקים לספק גישה מושכת לחקור שאלות אקולוגיות או אבולוציונית. כאן, שלושה מצבי קולוניזציה השטח של B. subtilis שמש כדי לבדוק את המראה של מגוון אוכלוסייה, כלומר הפרדה בין זהה מבחינה גנטית, אבל fluorescently שונה שכותרתו זנים. נוהרות, שהיא תנועת משטח קולקטיבי תלויה השוטון של B. subtilis, תוצאות באוכלוסייה מעורבת מאוד. במושבות השורצות אלה, חיידקים בירוקים ואדום-ניאון באזורים נשבו היו חופפים (ראו איור 2 א). הקולוניזציה המשטח המהיר ניתן בעקבות בזמן (וידאו איור 1). במהלך רוחשת של subtilis B, שכבה דקה של תאים מתרחב ממרכז חיסון אחרי כמה שעות של דגירה (ראה תרשים 2B).

4752 / 54752fig2.jpg "/>
איור 2: נוהרות הרחבת B. . subtilis המושבה הרוחשות מכיל זנים בירוק ואדום-ניאון כי היו מעורבים 1: 1 לפני חיסון. (א) לאחר 15 שעות, הקפסולה הירוקה-שחורה האדום פלואורסצנטי (GFP ו RFP, בהתאמה) התגלה עם מסנני קרינה מתאימים. (ב) תמונות של שכבה דקה של B. רוחשת subtilis מוצגים בנקודות נבחרות זמן מופק וידאו באיור 1. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

עם זאת, כאשר ב זני subtilis, כי חסרי שוטונים פונקציונליים אך הם מסוגלים להתפשט בעזרת מיוצר exopolysaccharide, hydrophobin ו surfactin, נראו על מדיום אגר חצי מוצק, זני שכותרתו השונה הופרדו def מסויםמגזרים שאינם עומדים (ראה איור 3 א). התפתחות המושבה הזזה ניתן להקליט בזמן (ראה איור 3B או וידאו איור 2).

איור 3: זזת מושבה של B. . subtilis המושבה מכיל זנים בירוק ואדום-ניאון כי היו מעורבים 1: 1 לפני חיסון. (א) לאחר 24 שעות, הקפסולה הירוקה-שחורה האדום פלואורסצנטי (GFP ו RFP, בהתאמה) התגלה עם מסנני קרינה מתאימים. (ב) תמונות של B. subtilis זזה דיסק מוצגת בנקודות זמן שנבחרו המופקות בר סולם וידאו איור 2. = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

בעוד רמות מבחר נחיל SLIמושבות דינג הרחבה לא ניתן לשנות אותם, ההפרדה המרחבית של זני ניאון שכותרתו השונה במהלך biofilm המושבה יכולה להיות מושפעת צפיפות תא מוצא. כאשר ביופילם מושבה של B. subtilis יזמה עם צפיפות תא הגבוה של האוכלוסייה המעורבת, הזנים הירוקים-ואדום-ניאון הראו קטין או לא מבחר מרחביים (ראה איור 4). נהפוך הוא, כאשר צפיפות התאים ליזום את biolfilm היה נמוך, מגזרים בירוק ואדום הקרינה ברור ניתן היה לזהות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. רמת מבחר הייתה תלויה בבירור במישור דילול אוכלוסיית הייזום ביופילם. וידאו איור 3 ו -4 מציגים את הרחבת המושבה עבור הדילול הנמוך ביותר והגבוה ביותר של הזנים המחוסנים.

איור 4: רמת מבחר ב biofilms מושבה של B. subtilis ב. צפיפות תא ראשונית שונה biofilms המושבה של זנים בירוק ואדום קרינה מוצגת לאחר 2 ימים כי היו מחוסנים עם צפיפות תא ראשונית שונה (מלמעלה עד למטה: הלא מדוללים ל 10 ⁵ פעמים בדילול ייזום תרבויות, בהתאמה). סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

יחס זנים בירוק ואדום-ניאון ניתן לכמת נוספת באמצעות תוכנת ImageJ המאפשר אפיון כמותי של מבנה האוכלוסייה competiveness של זנים המשמשים בניסויים.

וידאו איור 1: מתאר לעצמי זמן לשגותes של B. הרוחשת subtilis יזם עם 1:. 1 תערובת של זנים בירוקים ואדום-ניאון (קליק ימני להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 10 שעות. סרגל קנה מידה = 7 מ"מ.

וידאו איור 2: תמונות זמן לשגות של זזה ב subtilis יזם עם 1:. 1 תערובת של זנים בירוקים ואדום-ניאון (קליק ימני להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 24 שעות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.

וידאו איור 3: תמונות של מעבר זמן של B. biofilms המושבה subtilis יזם עם 1: 1 תערובת של ירוק-. זנים אדומים-ניאון בצפיפויות תא גבוהות (לחץ לחיצה ימנית כדי להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 48 שעות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.

וידאו איור 4: תמונות של מעבר זמן של B. המושבה subtilis biofilms יזם עם 1: 1 תערובת של זנים בירוק ואדום-ניאון בצפיפויות התא נמוכה. (קליק ימני להוריד.) בסרט רואה את מהלך זמן של 48 שעות. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ.

Discussion

הזמינות של ארגז כלים פלורסנט לחיידקים מקלה לא רק המחקר של ביטוי גנים הטרוגנית ^30,31 וחלבון לוקליזציה ^32, אבל גם ניתוח ההתפלגות המרחבית של זנים בתוך אוכלוסיה ^8. סמנים פלורסנט עם אורכי גל עירור ופליטה שונים מספיק לאפשר למקם בבירור שני זנים כי אחרת הם נבדלים זה מזה כאשר מעורבב. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מועסק על התבוננות הדינמיקה באוכלוסייה בתרבויות מעורבות, ניסויי תחרות למשל או סינרגיזם בין זנים או מינים. היכולת לקבוע את שכיחותם היחסית של שכותרתו fluorescently זנים באוכלוסייה מעורבת אינה מוגבלת על פני שטח רוחש מצורף, זזה, או מושבות ביופילם, אבל יכולה לשמש גם עבור מערכות biofilm תאיים אחרות, כוללת מתחת למים, לזרום ממשק תא או אוויר-בינוני biofilms ^27,33-35.

_content "> בעוד טכניקת המוצג הינו כלי רב עוצמה כדי לזהות הפריסה המרחבית של זנים וניסויים תחרות עיצוב, הוא גם מאפשר הבאים ההטרוגניות ביטוי גנים במושבות מתרחבת. תנאי culturing המתואר כאן לבקש 'subtilis ואת הפרמטרים המדויקים להרחבת על אגרתי תקשורת עשויה לדרוש אופטימיזציה עבור מינים אחרים או זני ^20. הצבת הדגימות בתא דגירה בעוד הדמיה מאפשרת הנסיין אחרי דינמיקת האוכלוסייה בזמן, אם כי יש לשים לב לרמת הלחות בתוך החדר במהלך הדגירה.

הטכניקות המתוארות כאן גם דורשות השינוי הגנטי של זני חיידקים שנבדקו כך הזנים להביע סמני ניאון אשר ניתן להבחין בין זה לזה. יתר על כן, חוץ מזה שיש עירור ברור ספקטרום פליטה, מומלץ כי שני סמנים הניאון נבחרו יש קוואנט דומהתשואות אממ (יחס כלומר של פוטונים נספגים נפלטים) ובאים לידי ביטוי ברמה דומה. בנוסף, שינויי עצמה יחסיים בזמן ניתן למדוד מנורמל ל-נקודת זמן מוקדמת של ניסוי. הגידול או הקיטון ביחס ניתן להשוות אז בין fluorophores השונה עם יעילות קוונטית שונה. עבור המערכת הניסיונית שהוצגה, חלבונים בירוקים ואדום-ניאון שונים נבדקו ^36,37 בעבר כדי לבחור עבור זוגות פלורסנט האופטימליים ביותר שיכול להתגלות B. subtilis. שעת החשיפה האופטימלית צריכה להיקבע עבור כל חלבון פלואורסצנטי מדגם. צפיפות תא מסוימת או מספר שכבות של תאים עשוי להידרש לזהות את האות ביעילות בתוך האוכלוסייה. חלבוני ניאון מסוימים שאולי יש עוצמות נמוכות תאי חיידקיים בשל ביטוי יעיל ו / או תרגום של החלבון ולכן תשואת קוונטים נמוכה. כזה סמני ניאון יעילים יכול rלְהַסִיק הרגישות של המערכת ולהרחיב את הזמן הדרוש כדי לזהות את זני חיידקים ואולי וכתוצאה מכך רעילה על ידי אור העירור. עוצמות ניאון יכול להיות שונה בהתאם על ידי שינוי האמרגן להשתמש בהם כדי להביע את הגן קידוד כתב ניאון. רמת ביטוי גבוהה מדי עלולה לגרום עודף מיותר של החלבון פלואורסצנטי המוביל לעלויות כושר מזיק החיידק. בעת ביצוע ניסויי תחרות, אחד צריך לשקול את העלות של ייצור חלבון פלואורסצנטי מסוים בתאים. בקרת ניסויים, שבהם סמני הניאון הם החליפו בין זנים התחרו או שם שני זני isogenic נבדלים רק סמני הניאון שלהם התחרו אחד נגד שני, נדרשים תמיד לקבוע הטיות כלפי סמן אחד. עוד בימי חייהם של חלבוני ניאון בתוך התאים עשויים גם להשפיע על עוצמת נמדד. בנוסף, autofluorescence של מצלצלים מסוימים חיידקיםהים עשוי לדרוש את שימוש סמני ניאון אחרים מלבד מתואר כאן.

כדי לקבוע את ההפצות המרחבי במדויק שכיחותם של זני חיידקים השונים, אות הרקע שמקורם חלבון פלואורסצנטי הראשון תוך שימוש במסנן הקרינה עבור השני סמן ניאון ולהיפך צריכה להיבדק בנפרד על דגימות monoculture (המכילה חיידקים בייצור סמן יחיד ). זה מאפשר הפחתת חופפים עוצמות אות ניאון. חשוב לציין, כמו סטראו מתעדת את אותות הקרינה מלמעלה המושבה מתרחבת, פרוטוקול המוצג הינו נוח לקבוע את הסידור המרחבי בשני ממדים. הארכיטקטורה של אוכלוסיית חיידקי ההרחבה עלולה לגרום רמות קרינה משתנות (כלומר מבנים דמויי קמט עשויים להכיל תאים יותר מוצגי עוצמות קרינה מקומיות גבוהות). לכן, הניתוח שתואר של D תמונותetermines החלוקה המרחבית, אך לא בשפע של זנים הנמצאים במיקום מסוים. פרוטוקולים קודמים תארו את הכנת המדגם עבור רוחשות הדמית ²⁰ או קרינה של דינמיקות אוכלוסייה באזורי מושבות חיידקי ^38, אבל הפרוטוקול שלנו משלב טכניקות אלה. שיטות מיקרוסקופיה אחרות המאפשרות התצפית של רזולוציה תלת ממדים של מבנה האוכלוסייה (מיקרוסקופיית ליזר confocal למשל ^39,40 או מיקרוסקופיה תאורה מובנית ⁴¹⁾ יכולות להיות מיושמות על דגימות עם מורכבות מבנית מוגברת. טכניקות נוספות אלו תומכים גם זיהוי מבוסס תא בודד של הזנים ³¹ שאינו זמין באמצעות stereomicroscopes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
מרק לנוקס (LB)	Carl Roth GmbH	X964
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH	5210
צלחת פטרי (קוטר 90 מ"מ)	כל	NA	השתמש בצלחות פטרי ללא מצלמות אוורור
צלחת פטרי (קוטר 35 מ"מ)	כל	NA	השתמש בכלי פטרי ללא מצלמות אוורור
Difco Nutrient Broth	BD Europe	234000
KCl	כל	NA
MgSO,<תת>4 7H2O	כל	NA
Ca(NO3)2 4H2O	כל	NA
MnCl24H2O	any	NA
FeSO4	כל	NA
D-Glucose	כל	מיקרוסקופ NA
Fluorescence AxioZoom V16 זמן-lapse	>Carl Zeiss Microscopy GmbH<		strong>ראה להלן תיאור מפורט
AxioZoom V16 גוף מיקרוסקופ	Carl Zeiss GmbH	435080 9030 000
Phototube Z 100:0 עבור Axio Zoom V16	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435180 9020 000	ללא עיניות
Fluar Illuminator Z mot צינור ביניים פלואורסצנטי עבור Axio Zoom.V16	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435180 9060 000
בקר EMS 3	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435610 9010 000
לוח בקרת מערכת SYCOP 3	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435611 9010 000
מודול רפלקטור Z	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435180 9160 000	עבור Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 ו- SYCOP 3
סט מסננים 38 HE eGFP משמרת חינם (E)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	489038 9901 000	EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
סט מסננים 63 HE mRFP ללא משמרת (E)	Carl Zeiss Microscopy GmbH	489063 0000 000	EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62
Mount S	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435402 0000 000
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 מ"מ	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435280 9050 000	164 מ"מ אורך פרפוקלי; חוט M62x0.75 מלפנים
כונן גס/עדין עם עמודת פרופיל	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435400 0000 000	490 מ"מ, קיבולת עומס 10 ק"ג, תואם לבסיסי מעמד 300/450
בסיס מעמד 450	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435430 9902 000
מקור אור קר Zeiss CL 9000 LED CAN	Carl Zeiss Microscopy GmbH	435700 9000 000
כבל	CAN-busCarl Zeiss Microscopy GmbH	457411 9011 000	אורך 2.5 מ'
תאורת טבעת חריץ	Carl Zeiss Microscopy GmbH	417075 9010 000	d = 66 mm
מוביל אור גמיש 1500	Carl Zeiss Microscopy GmbH	417063 9901 000	8/1,000 מ"מ
מתאם תאורה למדריך אור	Carl Zeiss Microscopy GmbH	000000 1370 927
Lightguide HXP עם מילוי נוזלי	Carl Zeiss Microscopy GmbH	000000 0482 760	ø מתאם מצלמה 3 מ"מ x 2,000 מ"מ
60N-C	קרל זייס מיקרוסקופיה GmbH	426113 0000 000	2/3 אינץ' 0.63X
מצלמה מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה AxioCam MRm Rev. 3 FireWire	Carl Zeiss מיקרוסקופיה GmbH	426509 9901 000
AxioCam FireWire הדק כבל סט קרל	זייס מיקרוסקופיה GmbH	426506 0002 000	לסנכרון תריס ישיר
ZEN pro 2012	קרל זייס מיקרוסקופיה GmbH	410135 1002 120	מהדורה כחולה, דורשת מינימום. Windows 7 64 סיביות
ZEN מודול Time Lapse	קרל זייס מיקרוסקופיה GmbH	410136 1031 110
שלב חימום סטנדרטי חממה עליונה	Tokai Hit	INUL-MS1-F1
Zeiss מתאם בסיס מיקרוסקופ סטריאו	Tokai Hit	MS-V12
Softwares
ImageJ	המכון הלאומי לבריאות, בת'סדה, MD, ארה"ב	v 1.49 מ'
תוסף BioVoxxel BioVoxxel			http://www.biovoxxel.de/development/