Method Article

פרוטוקול אופטימיזציה עבור Radiolabeling היעיל של חלקיקי זהב על ידי שימוש 125 שכותרתו לי אזיד תותבת קבוצה

DOI:

10.3791/54759

⸱

October 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, 2Department of Radiation Biotechnology and Applied Radioisotope Science, University of Science and Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוהל מפורט לסינתזה של אזיד 125 I-שכותרתו ואת radiolabeling של dibenzocyclooctyne (DBCO) -group מצומדות, 13 ננומטר בגודל ננו-חלקיקי זהב באמצעות תגובת לחץ ללא נחושת מתואר.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מדגימים פרוטוקול מפורט לרדיוסינתזה של קבוצת תותבות אזיד 125עם תווית I ויישומו לתיוג רדיו יעיל של ננו-חלקיקי זהב מתפקדים בקבוצת DBCO באמצעות תגובת קליק נטולת נחושת. יוד רדיואקטיבי של הפרקורסור הסטנילטי-מבשר (2) בוצע על ידי שימוש ב-[125I]NaI וכלורמין T כמחמצן בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. לאחר טיהור HPLC של המוצר הגולמי, הושג האזיד המטוהר 125עם תווית I (1) עם תפוקה רדיוכימית גבוהה (75 ± 10%, n = 8) וטוהר רדיוכימי מעולה (>99%). לסינתזה של ננו-חלקיקי זהב בגודל 13 ננומטר עם תווית רדיו, ננו-חלקיקי הזהב המתפקדים על ידי DBCO (3) הוכנו באמצעות פולימר פוליאתילן גליקול תיולטי. תגובת קליק נטולת נחושת בין 1 ל-3 נתנה ל-125ננו-חלקיקי זהב המסומנים ב-I (4) עם יותר מ-95% מהתפוקה הרדיוכימית כפי שנקבע על ידי כרומטוגרפיה של שכבה דקה רדיו (radio-TLC). תוצאות אלה מצביעות בבירור על כך ששיטת תיוג הרדיו הנוכחית המשתמשת בתגובת קליק ללא נחושת המקודמת על ידי מתח תהיה שימושית לתיוג רדיו יעיל ונוח של ננו-חומרים המכילים קבוצת DBCO.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת הקליק נטולת הנחושת המקודמת על ידי הזן בין אזידים לציקלוקוקטינים יושמה באופן נרחב על תיוג ביו-אורתוגונלי יעיל של מגוון רחב של ביו-מולקולות, ננו-חומרים ונבדקים חיים1-7. בשל ספציפיות האתר המצוינת וקצב התגובה המהיר של תגובת צימוד זו, הוא שימש גם לסינתזה של עוקבים עם תוויות רדיו. כמה קבוצות תותבות של 18אזיד או DBCO עם תווית F הוכנו לתיוג במבחנה של סוגי סרטן שונים המכוונים לפפטידים ונוגדנים, כמו גם להדמיה ממוקדת מראש של גידולים8-13. בנוסף לדוגמאות אלה, אותה תגובת צימוד יושמה על תיוג מתכת-רדיואיזוטופ של ננו-חומרים למחקרי הדמיה של טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET)14-16.

במשך כמה עשורים, יוד רדיואקטיבי שימש למחקר ביו-רפואי ולניסויים קליניים באמצעות הדמיית PET (124I), הדמיית טומוגרפיה ממוחשבת של פליטת פוטון יחיד (SPECT) (123I, 125I) וטיפול בסרטן בלוטת התריס (131I)17-21. לכן, שיטה יעילה לתיוג יוד רדיואקטיבי חשובה מיסודה לחקירות שונות, כולל מחקרי הדמיה מולקולרית, ניתוח התפלגות איברים של ביומולקולות, זיהוי סמנים ביולוגיים ופיתוח תרופות. ניתן להשתמש באסטרטגיית תגובת קליק ללא נחושת בתיוג יוד רדיואקטיבי. עם זאת, יישום זה לא נחקר בהרחבה כמו 18ביומולקולות המסומנות F22-23. כאן, נספק פרוטוקול שלב אחר שלב לסינתזה של אזיד 125עם תווית I לתיוג רדיו של מולקולות שמקורן בקבוצת DBCO. ההליכים בדוח הנוכחי יכללו יוד רדיואקטיבי של הפרקורסור הסטנילטי, שלבי טיהור עם HPLC ומיצוי פאזה מוצקה. אנו גם מדגימים תיוג רדיו יעיל של ננו-חלקיקי זהב בגודל 13 ננומטר שעברו שינוי בקבוצת DBCO באמצעות אזיד 125המסומן ב-I. הפרוטוקול המפורט בדוח זה יעזור לכימאים סינתטיים להבין מתודולוגיית תיוג רדיו חדשה לסינתזה של מוצרים עם תוויות רדיו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זהירות: צורת החמצון של יוד רדיואקטיבי היא תנודתי למדי ויש לטפל עם מגינים להוביל נאותים בקבוקוני עופרת. כל צעדי radiochemical צריכות להתבצע במנדף פחם-מסונן מאוורר היטב, ואת הפרוצדורות צריכות להיות פיקוח על ידי זיהוי התקני רדיואקטיביות.

1. הכנת הכימיקלים והמחסנית הפוך שלב לסינתזה של 125 I-שכותרתו יזיד

  1. הכנת ריאגנטים בתמיסה
    1. ממסי 1 מ"ג של המבשר יזיד (2) ב 150 μl אתנול אבסולוטי (איור 1).
      הערה: הליך סינטטי מפורט המבשר יזיד (2) דווחה בעיתון הקודם 22.
    2. ממיסים T chloramine 1 מ"ג ב 20 μl של חיץ מלוחים פוספט 1x (pH = 7.4).
    3. ממיסים metabisulfite נתרן 2 מ"ג ב 20 μl H 2 O.
  2. preparation של המחסנית
    1. לשטוף את המחסנית tC18 עם אתנול אבסולוטי 10 מ"ל ואחריו 10 מ"ל H 2 O. אין לייבש את המטריצה ​​של מחסנית עם אוויר.

2. Radiosynthesis של 125 הקבוצה התותבת תזיד שכותרתו לי

  1. תגובת Radioiodination של המבשר
    1. מוסיפים את פתרון מבשר אזיד (1 מ"ג ב 150 μl של אתנול אבסולוטי) וחומצה אצטית (10 μl) לצינור 1.5 מ"ל microcentrifuge.
    2. להוסיף 150 MBq של [125 I] נאה ב 0.1 M NaOH (50 μl) לתערובת התגובה.
    3. הוספת פתרון T chloramine (1 מ"ג ב 20 μl של חיץ מלוחים פוספט 1x) ולסגור את תערובת התגובה המכיל microcentrifuge צינור.
    4. דגירה תערובת התגובה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עד השלמת התגובה radioiodination.
    5. הוספת פתרון metabisulfite נתרן (2 מ"ג ב 20 μl H 2 O) לתערובת התגובהכדי להרוות את התגובה radioiodination.
    6. לסגת 0.2 μl של המוצר הגולמי ואז לדלל אותו עם 100 μl של פתרון (H 2 O / CH 3 CN, 1: 1) עבור ניתוח HPLC.
      הערה: עבור כל הניסויים HPLC, השתמש 0.1% חומצה פורמית המכיל H 2 O (ממס) ו -0.1% אצטוניטריל המכילים חומצה פורמית (B ממס) כמו eluents.
    7. נתח את המוצר הגולמי מדולל באמצעות הפוכה פאזיים אנליטיים רדיו-HPLC (C18 הפוכה שלב בטור; קצב הזרימה: 1 מ"ל / דקה; שיפוע eluent: 20% B ממס עבור 0-2 דקות, 20-80% ב ממס עבור 2-22 דקות, B ממס 80-100% עבור 22-23 דקות, ולאחר 100% B ממס עבור 23-28 דקות; זמן השמירה: 16.4 דק ') (איור 2).
  2. טיהור של המוצר הגולמי עם HPLC preparative
    הערה: ספק מספיק שריון עופרת סביב חלקי HPLC כגון מזרק, עמודה, גלאי, בקבוקונים אוספים, ואת המכל שבו הקולחים נאספו.
    1. לסגת הדואר תערובת תגובה כולו לתוך בקבוקון HPLC. יש לשטוף את צינור התגובה עם אצטוניטריל (0.5 מ"ל) ולהוסיף השטיפה לתוך אותו בקבוקון ההזרקה. לדלל את הפתרון שנאספו עם H 2 O (1 מ"ל).
    2. להזריק את המוצר הגולמי על רדיו-HPLC preparative (C18 הפוכה שלב בטור; קצב הזרימה: 10 מ"ל / דקה; שיפוע eluent: 20% B ממס עבור 0-2 דקות, 20-80% ב ממס עבור 2-22 דקות, 80-100% B ממס עבור 22-23 דקות, ולאחר 100% B ממס עבור 23-28 דקות).
    3. אספו את שיא רדיואקטיבי המייצג 125 יזיד שכותרתו אני (1) (R t בתנאי HPLC אלה הוא 17.8-18.8 דקות) במבחנת זכוכית (איור 2).
    4. מדוד את תשואת radiochemical של השבר באמצעות כיל רדיואקטיביות מינון על פי הפרוטוקול של היצרן.
    5. להזריק את המוצר המטוהר תתפס-HPLC רדיו אנליטיים באמצעות באותם התנאים HPLC לקביעת טוהר radiochemical של המוצר.
  3. מיצוי שלב מוצק של המוצר
    1. לדלל את שבריר המכיל את המוצר הרצוי (1) עם 40 מ"ל טהור H 2 O.
    2. מוסיף את הפתרון המדולל לתוך מחסנית tC18 preconditioned.
    3. לשטוף את המחסנית עם H מ"ל 15 נוספים 2 O.
    4. Elute המוצר (1) לכוד בתוך מחסנית עם 2 מ"ל אצטון לתוך בקבוקון זכוכית 10 מ"ל כי הוא מוגן על ידי מגן עופרת. מדוד את הרדיואקטיביות של מוצר eluted באמצעות כיל רדיואקטיביות מינון על פי הפרוטוקול של היצרן.
      הערה: sulfoxide דימתיל (DMSO) או אתנול אבסולוטי יכול לשמש גם עבור elution של המוצר מהמחסנית. כ 5-10% של רדיואקטיביות בדרך כלל מקלות על המחסנית, המוצר radiolabeled הנותרים לא ניתן eluted מלא באמצעות כמויות גדולות של ממיס אורגני.
    5. לאדות את אצטון עם זרם של חנקן או גז ארגון.
    6. ממיסים את מחדשsidue עם DMSO (100-200 μl) עבור השלב radiolabeling הבא.

סינתזת 3. DBCO-group-מצומדות חלקיקי זהב

  1. שינוי פני שטח של זהב 13 ננומטר בגודל חלקיקים עם פוליאתילן גליקול קבוצה-DBCO המכיל
    1. כן חלקיקי זהב נתרן מיוצב-ציטראט (3) (= גודל הממוצע 13 ננומטר) על פי דו"ח קודם 24.
    2. להוסיף בתמיסה מימית של 20 Tween (1 מ"מ, 1.5 מ"ל) אל חלקיקי זהב מיוצב ציטרט (10 ננומטר, 15 מ"ל). לנער את הפתרון עבור 20 דקות על שייקר מסלולית.
    3. להוסיף בתמיסה מימית של תיאול פוליאתילן גליקול DBCO המכילים-קבוצה (משקל מולקולרי ממוצע = 5000, 100 מיקרומטר, 1.5 מ"ל). לנער את פתרון 2 שעות על שייקר מסלולית.
  2. טיהור של חלקיקי זהב DBCO-שונה-group
    1. לטהר את חלקיקי זהב DBCO-שונה-קבוצה (4) </ Strong> על ידי צנטריפוגה רצוף (11,400 XG, 15 דק 'x 3).
    2. למזוג supernatant ולהוסיף מים טהורים עבור resuspension של כדורי ננו-חלקיקים מזהב.

4. Radiolabeling של ננו-חלקיקי זהב DBCO-שונה-קבוצה דרך התגובה לחץ חופשי הנחושת

  1. סינתזה של 125 ננו-חלקיקי זהב שכותרתו לי באמצעות 125 I-שכותרתו יזיד (1)
    1. כן פתרון מרוכז של חלקיקי זהב DBCO-שונה-קבוצה באמצעות צנטריפוגה (11,400 XG, 15 דק '), ולהתאים את הריכוז של חלקיקי זהב עד 2 מיקרומטר.
    2. להוסיף 4.1 MBq של אזיד 125 שכותרתו אני (1) ב DMSO (5 μl) כדי השעיה של חלקיקי זהב (4) (2 מיקרומטר, 50 μl).
    3. דגירת תערובת התגובה וכתוצאה מכך ב -40 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות.
    4. משיכת דוגמא מתמיסה בסיסית (0.2 μl) מהמוצר הגולמי ולהחיל אותו על שיתוף סיליקהכרומטוגרפיה בשכבה דקה ated (TLC) צלחת.
    5. לפתח את צלחת TLC באמצעות אתיל יצטט כשלב נייד.
    6. מניחים את צלחת TLC על סורק רדיו-TLC ולהפעיל את הסורק כדי לפקח על התגובה radiolabeling (איור 3) על פי פרוטוקול של היצרן.
  2. טיהור של המוצר הגולמי
    1. לטהר את תערובת התגובה המכיל את חלקיקי זהב 125 שכותרתו לי (4) על ידי צנטריפוגה (11,400 XG, 15 דק ').
    2. למזוג supernatant ולהוסיף מים טהורים עבור resuspension של כדורי ננו-חלקיקים מזהב.
    3. משיכת דוגמא מתמיסה בסיסית (0.2 μl) מהמוצר המטוהר ולהחיל אותו על צלחת TLC מצופה סיליקה.
    4. לפתח את צלחת TLC באמצעות אתיל יצטט כשלב הנייד.
    5. מניחים את צלחת TLC על סורק רדיו-TLC ולהפעיל את הסורק כדי לקבוע את התשואה radiochemical וטוהר radiochemical של 125 gol שכותרתו ליחלקיקי ד (4) (איור 3) על פי הפרוטוקול של היצרן.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תגובת radioiodination של מבשר stannylated (2) בוצעה באמצעות 150 MBq של [125 I] נאה, חומצה אצטית, ו chloramine T בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות כדי לספק את המוצר רדיואקטיבי (1). לאחר HPLC טיהור preparative של התערובת הגולמית, המוצר הרצוי הושג עם 75 ± 10% (n = 8) של תשואת radiochemical. HPLC אנליטי חשף כי טוהר radiochemical של שכותרתו לי מוצר 125 היה יותר מ -99% (איור 2), ואת הרדיוא...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באופן כללי, התשואה radiochemical הנצפה של אזיד מטוהרים 125 שכותרתו-I (1) היה 75 ± 10% (n = 8). Radiolabeling הושג עם 50-150 MBq של רדיואקטיביות, ותוצאות radiochemical הן די עקביות. אם [125 I] Nai (t 1/2 = 59.4 ד) כי עבר התפרקות רדיואקטיבית במשך יותר מחודש שמשה תגובת radioiodination, תשואת radiochemical של 1 נצפה להיות ירידה קלה (53-65%). לכן, מומלץ כי [125 I] Nai להיות מנוצל ברגע זה מיוצר או מוע...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן המחקר הלאומית של קוריאה, במימון ממשלת הרפובליקה של קוריאה, (מענקים מס' 2012M2B2B1055245 ו-2012M2A2A6011335) ועל ידי מרכז RI-Biomics של מכון המחקר לאנרגיה אטומית של קוריאה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
כלורמין T trihydrateSigma402869
[125I]NaI in aq. NaOHPerkin-ElmerNEZ033A010MC
נתרן מטאביסולפיט SigmaS9000
חומצה פורמיתSigma251364
Sep-Pak tC18 plus מחסניתמיםWAT036800
דימתיל סולפוקסיד סיגמאD2650
אצטוןסיגמא650501
אתנולסיגמא459844
זהב(III) כלוריד טריהידראטסיגמא520918
20 SigmaP1379
DBCO PEG SH (MW 5,000)NANOCSPG2-DBTH-5k
TLC סיליקה ג'ל 60 F254Merck
אנליטי HPLCAgilent1290 אינפיניטימספר דגם
הכנה HPLCAgilent1260 אינסוףמספר דגם
אנליטי C18 עמודה הפוכהAgilentZorbax Eclipse XDB-C18
Preparative C18 עמודה הפוכהAgilentPrepHT XDB-C18
סורק רדיו TLCBioscanAR-2000מספר דגם
כיול מינון רדיואיזוטופCapintec, IncCRC -25R כיול מינוןמספר דגם

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jewett, J. C., Bertozzi, C. R. Cu-free Click Cycloaddition Reactions in Chemical Biology. Chem. Soc. Rev. 39, 1272-1279 (2010).
  2. Debets, M. F., et al. Bioconjugation with Strained Alkenes and Alkyne. Acc. Chem. Res. 44, 805-815 (2011).
  3. Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. From Mechanism to Mouse: A Tale of Two Bioorthogonal Reactions. Acc. Chem. Res. 44, 666-676 (2011).
  4. Koo, H., et al. Bioorthogonal Cu-Free Click Chemistry in vivo for Tumor-Targeted Delivery of Nanoparticles. Angew. Chem. Int. Ed. 51, 11836-11840 (2012).
  5. Chang, P. V., et al. Copper-Free Click Chemistry in Living Animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 1821-1826 (2010).
  6. Bostic, H. E., Smith, M. D., Poloukhtine, A. A., Popik, V. V., Best, M. D. Membrane Labeling and Immobilization via copper-free Click Chemistry. Chem. Commun. 48, 1431-1433 (2012).
  7. Someya, T., Ando, A., Kimoto, M., Hirao, I. Site-Specific Labeling of RNA by Combining Genetic Alphabet Expansion Transcription and Copper-Free Click Chemistry. Nucl. Acids Res. 43, 6665-6676 (2015).
  8. Lee, S. B., et al. Mesoporous Silica Nanoparticle Pretargeting for PET Imaging Based on a Rapid Bioorthogonal Reaction in a Living Body. Angew. Chem. Int. Ed. 52, 10549-10552 (2013).
  9. Sachin, K., et al. F-18 Labeling Protocol of Peptides Based on Chemically Orthogonal Strain-Promoted Cycloaddition under Physiologically Friendly Reaction Conditions. Bioconjugate Chem. 23, 1680-1686 (2012).
  10. Evans, H. L., et al. Copper-Free Click - A Promising Tool for Pre-targeted PET Imaging. Chem. Commun. 48, 991-993 (2012).
  11. Campbell-Verduyn, L. S., et al. Strain-Promoted Copper-Free "Click" Chemistry for 18F Radiolabeling of Bombesin. Angew. Chem. Int. Ed. 50, 11117-11120 (2011).
  12. Arumugam, S., Chin, J., Schirrmacher, R., Popik, V. V., Kostikov, A. P. 18F]Azadibenzocyclooctyne ([18F]ADIBO): A Biocompatible Radioactive Labeling Synthon for Peptides using Catalyst Free [3+2] Cycloaddition. Bioorg. Med. Chem. Lett. 21, 6987-6991 (2011).
  13. Bouvet, V., Wuest, M., Wuest, F. Copper-Free Click Chemistry with the Short-Lived Positron Emitter Fluorine-18. Org. Biomol. Chem. 9, 7393-7399 (2011).
  14. Satpati, D., Bauer, N., Hausner, S. H., Sutcliffe, J. L. Synthesis of [64Cu]DOTA-ADIBON3-Ala-PEG28-A20FMDV2 via Copper-Free Click Chemistry for PET Imaging of Integrin αvβ6. J. Radioanal. Nucl. Chem. 302, 765-771 (2014).
  15. Lee, D. E., et al. Facile Method To Radiolabel Glycol Chitosan Nanoparticles with 64Cu via Copper-Free Click Chemistry for MicroPET Imaging. Mol. Pharmaceutics. 10, 2190-2198 (2013).
  16. Zeng, D. 64Cu Core-Labeled Nanoparticles with High Specific Activity via Metal-Free Click Chemistry. ACS Nano. 6, 5209-5219 (2012).
  17. Jeon, J., et al. Radiosynthesis and in vivo Evaluation of [125I]2-4(iodophenethyl)-2-Methylmalonic Acid as a Potential Radiotracer for Detection of Apoptosis. J. Radioanal. Nucl. Chem. 308, 23-29 (2016).
  18. Adam, M. J., Wilbur, D. S. Radiohalogens for Imaging and Therapy. Chem. Soc. Rev. 34, 153-163 (2005).
  19. Jeon, J., et al. Radiosynthesis of 123I-Labeld Hesperetin for Biodistribution Study of Orally Administered Hesperetin. J. Radioanal. Nucl. Chem. 306, 437-443 (2015).
  20. Kil, K. E., et al. Development of [123I]IPEB and [123I]IMPEB as SPECT Radioligands for Metabotropic Glutamate Receptor Subtype. ACS Med. Chem. Lett. 5, 652-656 (2014).
  21. Chen, M. K., et al. The Utility of I-123 Pretherapy Scan in I-131 Radioiodine Therapy for Thyroid Cancer. Thyroid. 22, 304-309 (2012).
  22. Jeon, J., et al. Efficient Method for Iodine Radioisotope Labeling of Cyclooctyne-Containing Molecules using Strain-Promoted Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. 23, 3303-3308 (2015).
  23. Choi, M. H., et al. Synthesis and Evaluation of an 125I-Labeled Azide Prosthetic Group for Efficient and Bioorthogonal Radiolabeling of Cyclooctyne-Group Containing Molecules using Copper-Free Click Reaction. Bioorg. Med. Chem. Lett. 26, 875-878 (2016).
  24. Kim, Y. H., et al. Tumor Targeting and Imaging Using Cyclic RGD-PEGylated Gold Nanoparticle Probes with Directly Conjugated Iodine-125. Small. 7, 2052-2060 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Radiolabeling Gold NanoparticlesCopper Free Click ReactionIodine 125 Azide Prosthetic GroupRadioiodination ProtocolHPLC PurificationRadio TLC AnalysisDBCO Functionalized NanoparticlesStrain Promoted Azide Alkyne CycloadditionRadiochemical Yield MeasurementSolid Phase Extraction

Related Articles