תלת מימדי סופר רזולוציה מיקרוסקופית של סיבים F- אקטין ידי interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופית (iPALM)

סיכום

אנו מציגים פרוטוקול עבור היישום של interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM), שיטה מיקרוסקופית 3 ממדי מולקולה בודדת לוקליזציה סופר רזולוציה, אל ההדמיה של שלד התא יקטין בתאי יונקים חסידים. גישה זו מאפשרת הדמיה מבוססת אור של תכונות מבניות ננו שאחרת נותרו לא פתורים על ידי מיקרוסקופיה אופטית-מוגבל עקיפה קונבנציונלית.

תקציר

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מאפשר הדמיה ישירה של ביומולקולות ספציפיות בתוך תאים. עם זאת, עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונאלי, ברזולוציה מרחבית מוגבלת על ידי עקיפה ל ~ 200 ננומטר בתוך המטוס תמונה> 500 ננומטר לאורך הציר האופטי. כתוצאה מכך, מיקרוסקופ פלואורסצנטי ארוך הוגבל קשות בהתבוננות תכונות ultrastructural בתוך תאים. ההתפתחות האחרונה של שיטות מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר יש להתגבר על מגבלה זו. בפרט, כניסתו של fluorophores photoswitchable מאפשרת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופרת מבוסס לוקליזציה, המספקת כושר הפרדה מתקרב המולקולרי באורך. כאן אנו מתארים את היישום של שיטה מיקרוסקופית תלת ממדי סופר רזולוציה המבוססת על מיקרוסקופיה לוקליזציה מולקולה בודדת ו interferometry רב שלבית, שנקראה interferometric PhotoActivated לוקליזציה מיקרוסקופי (iPALM). שיטה זו מספקת רזולוציה איזוטרופיים כמעט עלבסדר גודל של 20 ננומטר בכל שלושת הממדים. פרוטוקולים לדמיין את cytoskeleton יקטין פילמנטיות, כולל הכנת דגימת פעולת מכשיר iPALM, מתוארים כאן. פרוטוקולים אלה הם גם להתאמה ומאלף בקלות לחקר תכונות ultrastructural אחרות בתאים.

מבוא

הדמיה של מבנים הסלולר מורכב כבר זמן רב חלק בלתי נפרד תובנות ביולוגיות וגילוי. למרות מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכולים תאי תמונה עם ייחוד מולקולרי גבוה, כושר ההפרדה שלה הוא מוגבל על ידי דיפרקציה ל ~ 200 ננומטר במישור התמונה (x, y, או ממד לרוחב) ו> 500 ננומטר לאורך הציר האופטי (z, או ממד צירי) ^1,2. לפיכך, התצפית של תכונות ultrastructural הסטוריות הוגבלה במיקרוסקופ אלקטרונים (EM). למרבה המזל, ההתפתחות האחרונה של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר עקפה ממגבלה זו, מה שמאפשרת רזולוציה מרחבית של 10 - המגוון 100 ננומטר ^1-6. בפרט, ברזולוציה סופר גישות המבוססת על לוקליזציה מולקולה בודדת, מוכרת בראשי תיבות כגון PALM (מיקרוסקופי לוקליזציה PhotoActivated) ^4, FPALM (מיקרוסקופי לוקליזציה PhotoActivated קרינה) ⁵ (ד) STORM (מיקרוסקופי שחזור אופטי סטוכסטיים ישיר) ^6,7, צבע ( Poהצטברות int עבור טופוגרפית ננו הדמיה) ^8, GSDIM (קרקע מדינת דלדול מיקרוסקופי ואחריו לחזור מולקולרי בודד) ^9, או SMACM (מולקולה בודדת Active-Control מיקרוסקופית) ^10, וכן 3-ממדי (3D) ליישומם, כגון PALM interferometric (iPALM) ¹¹ או 3D-STORM ^12, כבר ערך בחשיפת תובנה רומן לתוך הארגון בקנה המידה ננומטרי של מבנים ביולוגיים רבים, בם אקסונים עצביים וסינפסות ^13, מוקדי הידבקויות ^14,15, צמתי תאי תאים ^16, גרעיני נקבובי ¹⁷ , ו centrosomes ^18-20, עד כמה שם.

תכונה נוספת ultrastructural בתאים עבורו מיקרוסקופ ברזולוציה סופר הוא שעשוי להיות שימושי הוא cytoskeleton אקטין. Meshwork המורכב של filamentous (ו) -actin בקליפת התא ממלא תפקיד חיוני בבקרה של צורה הסלולר תכונות מכאניות ^21. ארגון of F- יקטין הוא פעיל באופן דינמי מוסדר אף חלבוני רגולטורים רבים משפיעים במידה רבה על פילמור, crosslinking, מחזור, יציבות, טופולוגיית רשת ^22. עם זאת, למרות האפיון של אדריכלות meshwork F- יקטין חשוב תובנות מכניסטית לתוך מגוון רחב של תהליכים תאיים, בגודל הקטן (~ 8 ננומטר) של חוטי F- יקטין סלים לקיומם על ידי מיקרוסקופ אור-מוגבל עקיפה הקונבנציונלית; וכך, ההדמיה של מבנה עדין יקטין עד כה בוצעה באופן בלעדי על ידי EM. כאן אנו מתארים פרוטוקולים המאפשרים הדמית שלד תא F- יקטין בתאי יונקים חסידים, באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה סופר רזולוצית iPALM לנצל יכולת הדיוק שלה גבוהה מאוד ב -3 D ^11,23. למרות המכשיר iPALM מתמחה מאוד, הדרכה על הגדרת מכשיר כזה תוארה באחרונה ^23, תוך גישה למיקרוסקופ iPALM בהנחיית הובמחלקה יוז רפואי מכון גם נעשה זמין לקהילה מחקר עם עלות מינימלית. בנוסף, שיטות הכנת הדגימה כפי שתתוארנה בהמשך חלות ישירות גישות ברזולוצית סופר 3D אלטרנטיביות, כמו אלו המבוססים על defocusing אסטיגמאטיק של פונקצית התפשטות נקודה (כוחות הביטחון הפלסטיני) ¹² או דו-מטוס זיהוי ^24, שהן לזמינות באופן נרחב יותר.

נציין כי מרכיב הכרחי עבור מיקרוסקופיה ברזולוציה הסופרת מבוססת לוקליזציה מולקולה בודדת בכלל הוא fluorophore photoswitchable ^25, אשר מאפשר שלוש הדרישות הקריטיות עבור מיקרוסקופיה ברזולוציה סופרת מבוססת לוקליזציה מולקולה בודדת להתגשם: אני) מולקולה בודדת גבוהה בהירות יחסית בניגוד לאותות רקע; ii) ותפוצה דלילה של מולקולות בודדות בתוך מסגרת תמונה נתונה; ו- III) צפיפות מרחבית גבוהה של תיוג מספיק כדי ללכוד את הפרופיל של המבנה הבסיסי (הידוע גם בשם נייקוויסט-Shaקריטריון הדגימה nnon) ^26. כך, תוצאות משביעות רצון, יש לשים דגש לא פחות משני ההכנה הנכונה של דגימות כדי לייעל photoswitching fluorophore וכדי לשמר את ultrastructure הבסיסית, כמו גם על היבטי מכשור ורכישת הניסויים.

פרוטוקול

1. הכנת הדגימה הדמיה

1. מאז אותות הקרינה רקע להפריע הקרינה מן תוויות fluorophore, לנקות את coverglasses ידי שטיפה אותם קודם במים דה מיונן (DDH ₂ O) ולאחר מכן אוויר ייבוש אותם באמצעות אוויר דחוס. בהמשך לכך, לבצע תחריט הפלזמה שואב פלזמה במשך 15 שניות, או יותר במידת הצורך.
2. כדי לאפשר תיקון להיסחף וכיול iPALM, השתמש # 1.5 עגול (22 מ"מ קוטר) coverglasses מראש לנקות מוטבעת עם חלקיקי ניאון כמו סימני fiducial, המשמשים fiducials photostable כפי מאוד לכיול אמין תיקון להיסחף. בשל הזמן הרב הנדרש לרכישת לצבור צפיפות fluorophore מספיק (> 15 - 30 דקות), להיסחף המדגם הוא בלתי נמנע.
3. מניחים כל coverglass fiducialed לתוך צלחת בתרבית רקמה 6 באר. לעקר אותם על ידי אולטרה סגול (UV) במנדף זרימה למינרית במשך 15 דקות.
4. במנדף זרימה למינרית סטרילי, להכין פיברופתרון nectin לציפוי coverglass ידי דילול 1 מ"ג / פתרון מניות פיברונקטין מ"ל מלוחים שנאגרו פוספט של סטרילית Dulbecco (DPBS) לריכוז סופי 2 - 10 מיקרוגרם / מ"ל. יש לשטוף כל coverglass שלוש פעמים עם DPBS דגירה עם 2 מ"ל של פתרון פיברונקטין לילה ב 4 מעלות צלזיוס. בהמשך לכך, לשאוב את הפתרון פיברונקטין ולשטוף פעם עם DPBS.
5. שוטפים את התאים בקצרה עם DPBS. דגירה עם 1 - 2 מ"ל של טריפסין במשך כמה דקות ב 37 מעלות צלזיוס עד שהתאים לנתק להרוות עם ~ 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים המכיל סרום טריים. לדוגמא, עבור תאי אנדותל וריד אדם טבור (HUVEC), להשתמש במדיום תרבות אנדותל כלי גדול בתוספת גורמי אנדותל הכלי גדולים ו פניצילין או סטרפטומיצין.
   1. Replate התאים על coverglass מצופה פיברונקטין (עבור צפיפות דלילה, צלחת <50,000 תאים לכל coverglass) ולשמור על תרבות להגדיר באינקובטור ב לחות 95%, 5% CO _2, ו -37 & #176; ג.
6. לשימור תקין של מבנים קנס של שלד התא F- אקטין, השתמש תמיסות בופר מבוסס על ריאגנטים חיץ של טוב ^27.
   1. לדוגמה, להכין חיץ PHEM כפתרון 2x המניות (120 צינורות מ"מ, 50 מ"מ HEPES, 20 מ"מ EGTA, 4 מ"מ MgCl _2, pH 7.0 עם KOH) על ידי המסת 6.5 גרם של HEPES, 3.8 גרם של EGTA, ו -190 מ"ג MgCl ₂ ב ~ 300 מ"ל של DDH ₂ O, עם pH מותאם 7.0 על ידי תוספת dropwise של פתרון KOH מרוכז; אז, להוסיף DDH ₂ O ולהביא את נפח 500 מ"ל. לעקר את החיץ באמצעות מסנן 0.22-מיקרומטר, ולאחסן אותו ב 4 ° C, ו לדלל אותו 1: 1 עם DDH ₂ O לפני השימוש.
7. לקבלת התוצאות הטובות ביותר עם תיוג צפיפות גבוהה של F- אקטין, שימוש phalloidin מצומדות עם fluorophores אורגני, כגון Alexa פלואוריד 647. בנקודת הזמן הרצוי לאחר replating תא, לתקן את התאים כדלקמן:
   1. לשאוב את התקשורת בין כל תרבות היטב המכיל את ceדגימה שנייה של שנה. בעדינות אך במהירות לוותר 2 מ"ל של חם (37 מעלות צלזיוס) fixatives מיצוי המכיל glutaraldehyde 0.25% במאגר PHEM עם 0.25% Triton X-100. דגירה זה בטמפרטורת החדר למשך 1 - 2 דקות. על הצעדים הבאים, השתמש 2 מ"ל של מקבע או מרווה חיץ לכל coverglass, אלא אם כן צוין אחרת.
   2. החלף את מקבע החילוץ עם מקבע glutaraldehyde 2.5% חיץ PHEM ולתת דגימות דגירה במשך 10 - 12 דקות. זה והצעדים הבאים כל מבוצעים בטמפרטורת חדר.
   3. לשאוב את fixatives בעדינות להחליף אותם עם חיץ PHEM. הטיה ו מערבולת בעדינות, ולאחר מכן לשטוף שוב עם PHEM. חזור פעמיים.
   4. כדי להרוות autofluorescence מן glutaraldehyde, אשר יכול להציף אותות מן fluorophores הרצוי, דגירה דגימות עם חיץ מרווה מוכן טרי המכיל NaBH ₄ בריכוז המוני של 0.1% ב PHEM. בועות פזרני יקויימו. לפעמים הקש על צלחת מדגם בעדינות dislodge הבועות. תן לזה דגירה במשך 5 - 10 דק '.
   5. לשאוב את החיץ מרווה בעדינות להחליף אותו עם חיץ PHEM. יש לשטוף כמה פעמים כדי לסלק את הבועות. פיפטה 2 מ"ל של PHEM חיץ ולתת לו דגירה בחושך במשך 5 דקות. חזור פעמיים ולתת לשאר הדגימה במאגר PHEM בסיום.
   6. הכינו תא לחות עבור phalloidin הדגירה באמצעות ניילון גדולה בצלחת פטרי מרופדת פיסת מגבת נייר טבולה בנדיבות עם 5 - 10 מ"ל של DDH ₂ O. מניח גיליון גדול של Parafilm הנקי על גבי מגבת נייר הרטובה.
   7. בשל העלות הגבוהה יחסית של phalloidin שכותרתו, השתמש נפח קטן עבור כל תיוג. תיוג צפיפות גבוהה, להתחיל עם ריכוז של 0.3 מיקרומטר. הכן ~ 60 μl לכל coverglass באמצעות phalloidin-Alexa פלואוריד 647 חיץ PHEM.
   8. פיפטה 55 - 60 μl של פתרון phalloidin על הסדין Parafilm בתא לחות. בעזרת מלקחיים בסדר, בעדינות להסיר את הדגימה covergבַּחוּרָה. היזהר לציין בפניו תא המכיל הנכון.
   9. במהירות לטפוח בעדינות משם חיץ עודף על ידי נגיעה בקצה coverglass עם דף מקופל של נייר סופג עדין, ולאחר מכן למקם בצד התא coverglass פונה כלפי מטה על ירידה של פתרון phalloidin על Parafilm. ודא שאין בועות הלכודות על ידי coverglass.
   10. מניחים את המכסה על תא לחות. עוטף את החדר בנייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור סביבתי, ולתת מדגם דגירת הלילה ב 4 ° C.. המדגם יכול להיות כל הזמן במצב זה במשך כמה ימים. ודא כי בתא הלחות נשאר לח אם מתוכנן לאחסון ארוך.
8. לפני הדמיה, בעדינות למקם בצד התא coverglass עד לצלחת 6-באר חדשה המכילה 2 מ"ל של חיץ PHEM לכל טוב.
9. כן מאגרי הדמיה מפסולת-חמצן מבוסס תיאול באמצעות פתרונות המניות הבאים: 1 M גלוקוז, 1 cysteamine M, ו גלוקוז אוקסידאז 100x / mixt אנזים קטלאזיור (4 מ"ג catalase ו -10 מ"ג של גלוקוז אוקסידאז ב 100 μl של חיץ PHEM, מעורבב היטב על ידי vortexing) ^28. ממש לפני הדמיה, לערבב 75 μl של 1 M פתרון גלוקוז, 30 μl של 1 M פתרון cysteamine, ו -3 μl של 100x תערובת אנזים המניות. כוון את עוצמת הקול עד 300 μl עם חיץ PHEM ולהשתמש מיד לאחר ערבוב לעלות במדגם.
10. לקבלת iPALM, להכין את המדגם הדמיה באמצעות coverglass 1.5 מראש לנקות # (קוטר 22 מ"מ).
    1. לחלופין, להשתמש זכוכית שקופית (3 "x 1") עם spacer דבק דו צדדי כדי לסייע באסיפה אם-STORM 3D מבוסס אסטיגמציה ¹² הוא לשמש במקום.
    2. כדי להרכיב את מדגם הדמיה, להשתמש במלקחיים בסדר להסיר את coverglass הדגימה בעדינות מתוך המאגר היטב. ואז, במהירות ובעדינות בקצות האצבעות שלכם חיץ עודף על ידי נגיעה בקצה coverglass עם נייר סופג מקופל.
    3. מניחים בצד התא coverglass פונה כלפי מעלה על פיסת נייר העדשה נקי. יש לשטוף את המדגםעל ידי הצבת 30 - 50 μl של חיץ הדמיה על המדגם, ולהסיר עודפי חיץ ידי הטיה קשה עם נייר סופג מקופל.
    4. חזור על שלב השטיפה כמה פעמים, ולאחר מכן למקם 30 - 50 μl של חיץ הדמיה על המדגם. כתם לייבש את קצה coverglass ולמקם מספר נקודות קטנות מאוד של אפוקסי מהיר ריפוי על השטח המיובש.
    5. לאט לאט להוריד מראש לנקות אחר coverglass 1.5 # (רגיל, עגול coverglass, 18 מ"מ קוטר) על גבי במרכז של coverglass 22 מ"מ המכילים תאים. תנו חיץ ההדמיה להרטיב הן coverglasses ידי פעולת נימים. הנקודות הקטנות של אפוקסי מהיר ריפוי צריכות לדבוק בשני coverglasses.
    6. לחץ בעדינות על המדגם נאסף באמצעות נייר סופג מקופל להפיץ את הלחץ באופן שווה. הפעל לחץ מספיק כדי להפוך את המדגם תא-דק ואפילו (<15 מיקרומטר), אבל לא כל כך הרבה כמו לרסק את התאים. מדוד את העובי הנאות על ידי תבנית הטבעות של ניוטון. כמו כן, הקפד לבצע את זה stEP בעדינות כדי למזער בועות אוויר. במידת הצורך, להתאמן עם פעמי coverglasses כמה הריקה לפני כן.
11. חותם את המדגם עם וזלין-לנולין-פרפין נמס (VALAP, מלאי מוכן מן 100 גרם כל אחד וזלין, לנולין, פרפין, הותכו יחד) ^29, יש לשטוף את המדגם חתום עם DDH ₂ O, מכה יבשה עם אוויר דחוס. המדגם הוא מוכן כעת גובר על מיקרוסקופ הדמיה.

2. מיקום לדוגמא מערך iPALM

1. הזז את העדשה האובייקטיבית הקפיץ העליונה כלפי מעלה כדי לאפשר את הסרת בעל המדגם. מניח את הדגימה האטומה מוכנה בשלב 1.10 על בעל המדגם ומאובטח עם מגנטים נדיר ארץ קטנים מספר. החל שמן טבילה משני צידי מדגם ההדמיה. מניח את בעל המדגם בחזרה לתוך הנתיב האופטי בעדינות להוריד את העדשה האובייקטיבית העליונה.
2. הפעל לייזרי העירור. הפעל את ההתקן תשלום מצמידים הכפלת אלקטרונים (EMCCD) מצלמה במצב מסגרת העברה.
   1. סובב את מסנני פליטה הנאותים. הפעל תריס מכני לחסום נתיב קרן העליון (איור 1 א) ולפתוח את נתיב קרן התחתונה. תביא את העדשה האובייקטיבית התחתונה אל מוקד על ידי תרגום במרווחים קטנים באמצעות מפעיל piezo.
   2. לאחר fiducial הוא בפוקוס, לפתוח את נתיב הקרן העליון תוך חסימת נתיב הקרן התחתונה ולהביא את העדשה האובייקטיבית העליונה אל מוקד באופן דומה. צג רוחב fiducial על צג המחשב עבור להתמקד אופטימלית.
3. לקבלת centration הנכונה, הפתוח הוא בשורה העליונה והן נתיבי קורה תחתונים. התאמה ידנית העדשה האובייקטיבית העליונה בעוד המטרה התחתונה מוחזקת קבועה בעזרת זוג ברגי סט עדין מייקרו, עד שתמונות fiducial הם חפפו ככל האפשר, באופן אידיאלי בתוך פיקסל אחד.
   1. בהמשך לכך, לבצע התאמות בסדר כך שהתמונות fiducial בשלב 2.3 חפיפה בתוך עשירית פיקסל EMCCD. התאם העליון2-ציר מראות מותקנות פייזו באמצעות תוכנות שליטה בעת לחיצה על שניהם עדשות אובייקטיביות ההשתקפות התחתונה מראות מתמיד. השווה את המרכזים של fiducials של העליון ונופי המטרה התחתונים באמצעות צג המחשב כדי להנחות את התהליך.

כיול 3. הגדרת iPALM

הערה: מאז פליטת קרינה היא מבולבלת, להפרעה להיות שנצפתה iPALM, נתיב אורכי דרך החלק העליון ויעדים תחתונים חייבים להיות קרובים זה לזה, תוך כמה מיקרון. זו יכולה להיות מושגת כדלקמן:

1. עם הלייזרים על, מצלמות הזרמה ברציפות, ושניהם מסלולי הקרנות העליונים ותחתונים פתוחות, להתנדנד בעל מדגם-piezo z באמצעות צורת גל של מתח סינוסי שנוצר על ידי תוכנות שליטה על תנודת Z- ציר רציפה על פני גודל של 400 ננומטר .
2. ניצול העובדה, כאשר מתוך יישור אופטימלי, עוצמת fiducial משתנה מעט עם tהוא תנודה, לתרגם את מכלול קרן splitter ממונע ידני למעלה או למטה עד עוצמת נעה fiducial בשל השפעת התערבות פוטון יחיד הרצוי. זה מסמל את ההתאמה הקרובה של אורכי נתיב האופטיים. יחס השיא-העמק> 10 יכול להיות מושג במקרים אופטימליים (1D איור).
3. כדי להבטיח כי הן את המשרעת והפאזה בכל השטח הם אחידים ככל האפשר על פני השדה, להתאים את המראה תחתית מכלול קרן splitter בצעדים קטנים כדי לכוונן את הפער ואת זוויות הטיה. בצע יישור קנס מפצל קרן על ידי תרגום המדגם ב 8 ננומטר Z- צעדים למעלה מ -800 ננומטר.
   1. לפקח על עוצמת fiducial בין מצלמות # 1 - 3. התאם את הגובה, את המיקום ואת ההטיה של המראה התחתונה בתוך הרכבת הקרן splitter בצעדים קטנים, כך שלב התנודה של מצלמת # 1 ביחס מצלמת # 2 מוגדל, באופן אידיאלי ב 120 מעלות (איור 1 ב-ד).
   2. לאחר ראשוניהיישור הושלם, לתרגם המדגם כדי לבצע סריקה לאיתור שדה מתאים מבט המכיל את שני תאי תמונת fiducials המרובה סמוכות. מניחים המתחם סביב למערכת לחסום אור תועה ואת הפרעות הסביבה. לאחר באזור ההדמיה נמצא, לבצע את ההליך בשלב 3.4 שוב, ולהקליט את עקומת הכיול לשימוש לאחר z לתאם עקירות באמצעות הפקודה "רוכש כיול סריקות vs עמד Piezo לדוגמא" בממשק הראשי.

4. קליטת נתונים

1. פעם אזור רצוי נמצא ואת עקומת הכיול מתקבלת, הזן את שמות קבצים המתאימים לתוך התוכנה. פתח הוא בשורה העליונה והן נתיבי קורה תחתונים. להגדיל את כוח עירור של הלייזר 642 ננומטר למקסימום. עבור Alexa פלואוריד 647, לתקופה ראשונית של fluorophore כיבוי עשוי להיות נחוץ (איור 2 א).
   1. Expose עם עירור 642 ננומטר קבוע במשך 5 דקות, או יותר במידת הצורך, עד סימולקולת ngle המהבהבת הוא ציין (איור 2 ב). התוכנה מאפשרת גידול אוטומטי של הפעלת צילום 405 ננומטר במהלך הרכישה. מספר רב של מסגרות רכישה בדרך כלל נדרש עבור תכונות filamentous להיות נראות בבירור (> 50,000 מסגרות). כאשר מוכן, להתחיל רכישת ערכות תמונה גלם באמצעות הפקודה "רכישה התחל iPALM" בממשק הראשי.
2. במהלך הרכישה, לכוון את רמת photoactivation על ידי התאמת עוצמת הלייזר 405 ננומטר כדי לשמור על צפיפות נכונה מהבהב לפי הצורך (ראה דוגמאות באיור 2B).
   הערה: לאחר הרכישה הושלמה, התוכנה באופן אוטומטי להמיר את קבצי תמונה לפורמט בינארי הנכון. המאגר נתונים בשרת החישוב מותקן ככונן רשת, ומאפשר נתונים המיועדים להעתקה ישירות לשם לעיבוד נוסף.

5. עיבוד נתוניםוניתוח

1. ביצוע ניתוח לוקליזציה באמצעות תוכנה שפותחה כדי לחלץ פרמטרים-התאמה הטובה ביותר עבור כל המולקולות הבודדות, כמו גם עבור fiducials ^11,15,23. זה מניב לא רק את x, y לתאם, אלא גם את העוצמת המשמשת ניתוח עקום כיול.
   1. יבא את נתוני הכיול הגלם הנרכשים בשלב 3.5 באמצעות הפקודה "חלץ תוויות פיקס מרובים" תחת תפריט "קובץ" כדי לבצע לוקליזציה מולקולה בודדת. בעקבות ניתוח הלוקליזציה הראשוני, קואורדינטות המתקבלים ממצלמות # 1 - 3 נוכחים בערוצים אדומים, ירוק וכחול, בהתאמה, ניתן לשמור לניתוח נוסף באמצעות הפקודה "שמור מעובד כמו IDL (.sav)" תחת " בתפריט קובץ ".
2. כדי להביא נתונים ממצלמות # 1 - 3 לתוך רישום באמצעות fiducials פלורסנט מוטבע על coverslips, לבחור כמה fiducials בהיר כדי לספק כיסוי של התמונה המרכזית (כגון,איור 1B) באמצעות הפקודה "נקודות העוגנות Fiducial" תחת תפריט "טרנספורמציות תמונה". השתמש סטים המשולשים של לוקליזציה קואורדינטות ממצלמות # 1 - 3 מתקבל fiducials הבהיר בשלב 5.1 לחשב את סיבוב מטריצה ​​דרוגה שיביא מצלמות # 1 ו # 3 לתוך קופה עם מצלמת # 2. עם מספר גדול מספיק של fiducials, השתאה פולינום מסדר גבוה יכול להתבצע עבור מתאים יותר.
3. לאחר המטריצה ​​השינוי מחושב, לשנות את הנתונים הגולמיים של מצלמות # 1 - 3 יחד כדי להשיג את הנתונים הגולמיים סיכם. בצע סיבוב נוסף של ניתוח לוקליזציה להניב x מדויק יותר, y לתאם ולקבוע את תרומתו היחסית של כל ערוץ מצלמה על הנתונים הגולמיים סכמו; השתמש בפקודה "המרה גלם, שמור שמור Sum (.dat)" תחת תפריט "טרנספורמציות תמונה". יחס עוצם זה מכיל את מידע z לתאם.
4. בחר fiducial בהיר ולבצע z-כיול מתאים באמצעות הפונקציה "3D נקודת מבחן הרוח" של מוקפץ שיח באמצעות לחיצה על "Z-לתאם פעולות" תחת תפריט "לתפקידים מיוחדים". זה יתאים פונקציות 3-סינוסי אל העוצמות של 3 ערוצי המצלמה כדי לקבוע את עקומת הכיול. קובץ הכיול אז נשמר לשימוש נוסף על מערכי הנתונים העיקריים.
5. כדי לבדוק את האיכות של עקומת הכיול, לבצע z לתאם חילוץ, כפי שתואר לעיל ^23. לקבלת fiducials ומחונך במערכת היטב מכוילת, z לתאם צריכה ליניארי, מאז מערכי נתוני הכיול נלקחים בהינף ליניארי-עמדת z. יתר על כן, z-עמדות כל fiducials צריך סולם עם מדרון דומה.
6. לאחר כיול משביע רצון מתקבל, לבצע לוקליזציה ניתוח שינוי עבור מערכי נתוני תמונת הגלם שנרכשו בשלב 4 הבאים באותו הליך מתואר בצעדים 5.1-5.3. בסיום, לטעון את קובץ כיול משלב 5.4 ולבצע z לתאם החילוץ באמצעות הפונקציות "פיק קובץ WND" ו- ​​"חלץ Z לתאם" בתיבת הדו-שיח המוקפץ על ידי לחיצה על "Z-לתאם פעולות" תחת תפריט "לתפקידים מיוחדים".
   הערה: מאז הפעם הרכישה> 15 דק ', להיסחף מכני צפוי.
7. כדי לבצע להיסחף תיקון x, y, בחר fiducial בהיר מן הקואורדינטות לוקליזציה. fiducial זה צריך להיות נוכח בכל המסגרות. לאחר מכן, השתמש x, y לתאם להיסחף של fiducial כדי ליישר את כל הקואורדינטות האחרות בתוך אותה המסגרת בחזרה רישום (איור 3A-B) באמצעות הפונקציה "המבחן / כתיבת המדריך Star" תחת תפריט "טרנספורמציות תמונה". רישום Z-לתאם יכול להתבצע באופן דומה על ידי גישה "Test חוזה מדריך סטאר" ו "כתוב מדריך Star" הפונקציות מוקפץ שיח באמצעות לחיצה על "Z-לתאם פעולות" תחת תפריט "לתפקידים מיוחדים".
8. כפי המדגם עשוי להפגין הטיה קלה, לבצע תיקון הטיה על ידי מתן x, y, z-הקואורדינטות של 3 נקודות התייחסות להגדרת המטוס שאמור להיות מוגדר ברמת באמצעות הפונקציה "הסר XYZ Tilt" של מוקפץ שיח על ידי לחיצה " Z-לתאם פעולות "תחת" תפריט לתפקידים מיוחדים ".
9. לאחר התיקונים להיסחף והטיה, להציל את קואורדינטות הלוקליזציה. משחזרים תמונה ברזולוציה סופר לניתוח נוסף (איור 4 א-ד) באמצעות הפקודה "לדקלם" על הממשק הראשי. צבע יכול לשמש כדי לציין את z לתאם. לחלופין, נוף צדדי של האזור הנבחר יכול להיות גם שניתנו. קואורדינטות הלוקליזציה ניתן לייצא כקבצי טקסט כימות נוספת, או הדימוי המשוחזר ניתן לשמור כקובץ tif.

תוצאות

דרישות קריטיות עבור iPALM הם יישור, רישום, וכיול של מערכות אופטיות. אלה נחוצים כדי להבטיח הפרעות מתאימיבתוך הנדרשים קרן splitter 3 כיוונים עבור z לתאם חילוץ. כדי לאפשר ניטור רציף, ממקורות נקודות קבועים של קרינה נחוצים. זו יכולה להיות מושגת באמצעות פלורסנט Au או חלקיקים מתכתיים דו ²³ אשר photoluminescence לנבוע תהודה plasmon משטח מקומי (LSPR). הם מתנהגים כמו דיפול אחת יציבה על תאורה ובדרך כלל יכול להיות מקומי עם 5 - 10 ננומטר דיוק. חלקיקי...

דיון

המערכת האופטית של iPALM מבוסס על עיצוב המטרה 4-π כפול מתנגדים, כפי שמוצג באיור 1 א. ההתקנה נבנתה באמצעות שני-מותאם אישית במכונה ומסחרי חלקים אופטו-מכאני, כפי שתוארה קודם לכן ²³ ו המפורטים בטבלת 1. בנוסף ההתקנה שלנו, המכון הרפואי הווארד יוז (HHMI) מארחת מערכת נגישה הקהילה המדעית במרכז ההדמיה המתקדם בקמפוס מחקר Janelia. עבור הציורים המכאניים המלאים, השרטוטים שליטים, והתוכנה, קוראים מוזמנים לברר עם הרלד הס ב HHMI לקבלת מיד...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שולחן אופטי	ניופורט, CA	RS4000	iPALM, מותקן על 4 מבודדי רטט מייצב ניופורט
מבודד רטט לשולחן אופטי	ניופורט, CA	S-2000
לייזר-642	ניופורט, קליפורניה	1185055	הספק פלט = 100 מגה-וואט
לייזר-561	ניופורט, קליפורניה	1168931	הספק פלט = 200 מגה-וואט
לייזר-488	ניופורט, קליפורניה		הספק פלט 1137970 = 200 מגה-וואט
לייזר-405	ניופורט, קליפורניה	הספק	פלט 1142279 = 100 מגה-וואט
מראות דיאלקטריות בפס רחב	Thorlabs, NJ	BB1-E02	משלב לייזר
מפצל קרן דיכרואי	Semrock, NY	LM01-427-25
מסנן אקוסטו-אופטי מתכוונן	AA אופטו-אלקטרוני, צרפת	AOTFnC-VIS-TN
ליניארי מקטב	ניופורט, קליפורניה	05LP-VIS-B
סדנה מקומית	לפלטת	סיבוב מותאמת אישית
(22.5 מעלות)	Reynard Corpporation, CA	מותאם אישית	22.5°
תושבות אופטיות ממונעות	New Focus, CA	8816
ממונע XYZ שלב תרגום	Thorlabs, NJ	MT3 / M-Z6	מחזיק מדגם
T-Cube DC בקר מנוע סרוו	Thorlabs, NJ	TDC001
Piezo Phase Shifter	Physik Instrumente, גרמניה	S-303.CD
עדשת אובייקט	ניקון, יפן	MRD01691	אובייקטיבי. Apo TIRF 60X/1.49
שלב תרגום	פוקוס חדש, CA	9062-COM-M
מפעיל מנוע פיקו	פוקוס חדש, CA	8301
סולנואיד/תריס סיבובי	DACO Instruments, CT	5423-458
מפצל קרן תלת כיווני	Rocky Mountain Instruments, CO	מפצל אלומה מותאם אישית
Piezo Z/סורק טיפ/הטיה	Physik Instrumente, גרמניה	S-316.10
ממונע חמישה צירים מיישר הטיה	פוקוס חדש, CA	8081
בקר Picmotor Ethernet	פוקוס חדש, CA	8752
בקרי פייזו / מגבר / מודול הפעלה דיגיטלי	Physik Instrumente, גרמניה	E-509 / E-503 / E-517
מסנן פס	פס Semrock, NY	FF01-523/20	מסננים
מסנן פס	פס Semrock, NY	FF01-588/21
מסנן פס	Semrock, NY	FF01-607/30
מסנן פס	Semrock, NY	FF01-676/37
מסנן חריץ	Semrock, NY	NF01-405/488/561/635
גלגל מסנן ממונע עם שליטה	Thorlabs, NJ	FW103H
EMCCD	אנדור, בריטניה	DU-897U-CSO-#BV	3 ערכות
מחשבים שולחניים לשליטה במצלמות וסנכרון	Dell	Precision T3500	, 4 סטים
של כיסויים עם	של Hestzig, VA	600-100AuF	. סימני פידוציאל עם צפיפות וספקטרום שונים זמינים
פיברונקטין	Millipore, MT	FC010
paraformaldehyde	Electron מדעי המיקרוסקופיה, קיבוע PA	15710	. 16%
גלוטראלדהיד	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, PA	16220	25%
טריטון X-100	סיגמא אולדריץ', MO	T8787
תאי HUVEC	Life Technologies, CA	C-015-10C
בינוני 200	Life Technologies, CA	M-200-500
גורמי אנדותל של כלי דם גדולים	Life Technologies, CA	A14608-01
תמיסת מלח פוספט חוצץ של Dulbecco	14190367
EGTA	Sigma aldrich, MO	E3889
MgCl2	Millipore, MT	5985
Alexa Fluor 647 Phalloidin	Invitrogen, CA	A22287	נתרן
בורוהידריד מכתים (NaBH4)	Sigma aldrich, MO	480886	מרווה
גלוקוז	בסיס 1, מלזיה	BIO-1101	מאגר הדמיה
גלוקוז אוקסידאז	סיגמא אולדריץ', MO	G2133
קטלאז	סיגמא אולדריך, MO	C9322
ציסטמין	סיגמא אולדריך, MO	30070
אפוקסי	תורלבס, NJ	G14250
וזלין	סיגמא אולדריך, MO	16415	איטום
מדגם לנולין	סיגמא אולדריך, MO	L7387
שעוות פרפין	סיגמא אולדריץ', MO	327204
שמן טבילה	מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית, PA	16915-04	הדמיה. קרגיל סוג HF