הכנה במבחנה אפיון חומרי ניגוד מבוססי dendrimer עבור דימות תהודה מגנטית

סיכום

פרוטוקול זה מתאר את ההכנה ואפיון של תהודה מגנטית dendrimeric חומר ניגוד (MRI) שנושא chelates macrocyclic המבוסס cyclen תיאום יוני גדוליניום פאראמגנטיים. בסדרת ניסויי MRI במבחנה, סוכן זה מיוצר אות MRI מוגברת בהשוואה האנלוגית monomeric הזמין המסחרי.

תקציר

מתחמי פאראמגנטיים של גדוליניום (III) עם אציקליות או chelates macrocyclic הם סוכנים בניגוד הנפוץ ביותר (CA) עבור הדמיה בתהודה מגנטית (MRI). מטרתם היא לשפר את שיעור הרפיה של פרוטונים מים ברקמות, ובכך להגדיל את הניגוד התמונה MR ואת הספציפיות של מדידות MRI. סוכנים בניגוד נוכחיים קליני שאושרו הם מולקולות משקל מולקולארי נמוכות, נמחקות במהירות מהגוף. שימוש dendrimers כנושאי chelators פאראמגנטיים יכול למלא תפקיד חשוב בהתפתחות העתידית של סוכנים בניגוד MRI יעילים יותר. באופן ספציפי, העלייה בריכוז המקומי של תוצאות מיני פאראמגנטיים ב ניגוד אות גבוה. יתר על כן, CA זה מספק זמן שמירת רקמות כבר בשל המשקל והגודל מולקולריים גבוהים. הנה, אנחנו מדגימים הליך נוח לעריכת חומר ניגוד MRI macromolecular מבוסס על פולי (amidoamine) (Pamam) dendrimers עם monomacrochelators DOTA מהסוג מחזורי (DOTA - 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). היחידה chelating צורף על ידי ניצול תגובתיות של isothiocyanate (NCS) הקבוצה כלפי קבוצות משטח אמין של dendrimer Pamam להקים גשרים thiourea. מוצרי Dendrimeric היו מטוהרים ונותחו באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית, ספקטרומטריית מסה, ואת ניתוח יסודי. לבסוף, ברזולוציה גבוהה תמונות MR הוקלטו ניגודי האות המתקבל מן dendrimeric המוכן וסוכני monomeric הזמינים המסחרי הושוו.

מבוא

הדמיית תהודה מגנטית (MRI) היא טכניקת הדמיה עוצמה בלתי מייננת בשימוש נרחב מחקר ביו לדיאגנוסטיקה רפואית בשל אופיו פולשנית והניגודיות הרקמות הרכות הפנימית מעולה. שיטות MRI הנפוצות ביותר לנצל את האות המתקבל פרוטונים במים, מתן תמונות ברזולוציה גבוהה ומידע מפורט בתוך הרקמות על בסיס הבדלים בצפיפות של אותות מים. עוצמת האות ואת הספציפיות של ניסויי MRI ניתן לשפר עוד יותר באמצעות סוכנים בניגוד (CA). אלה הם מינים פאראמגנטיים או פאראמגנטי המשפיעים על האורך (T ₁₎ ו רוחבי (T ₂₎ פעמים הרפיה, בהתאמה ^1,2.

קומפלקסים של גדוליניום lanthanide יון עם polyamino הליגנדים חומצה polycarboxylic הם את רשויות T ₁ הנפוץ ביותר. גדוליניום (III) מקצר את ההרפיה T ₁זמן של פרוטונים במים, ובכך להגדיל את ניגוד האות בניסויי MRI ^3. עם זאת, גדוליניום יוני הוא רעיל; גודלו מדמה את הסידן (II), וזה ברצינות משפיע בסיוע סידן איתות תאי. לכן, chelates אציקליות ו macrocyclic מועסקים לנטרל רעילות זו. הליגנדים multidentate שונים פותחו עד כה, וכתוצאה מכך גדוליניום (III) קומפלקסים עם יציבות תרמודינמית גבוהה אדישות הקינטית ^1. אלה המבוססים על cyclen azamacrocycle-membered 12, ב DOTA נגזרת tetracarboxylic שלה בפרט (1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate) הם חקרו ביותר ויישומי קומפלקסים של המעמד אישורים זו.

אף על פי כן, GdDOTA מסוג CAs הם מערכות נמוכות משקל מולקולריים, מוצגות חסרונות מסוימים כגון יעילות ניגודיות נמוכה והפרשה כליות מהר. Macromolecular ו CAs רב-ערכית עשוי להיות פתרון טוב לבעיות אלה ^4. מאז CA biodistribution נקבעת בעיקר על ידי גודלם, קאש macromolecular להציג פעמי שמירה עוד הרבה זמן בתוך רקמות. לא פחות חשוב, multivalency של תוצאות סוכנים אלה ריכוז מקומי גדילה של חללית MR monomeric (למשל, מורכבות GdDOTA), באופן משמעותי לשיפור אות MR שנרכשה ואת איכות המדידה.

Dendrimers הוא בין הפיגומים המועדפים ביותר לעריכת CAs רב-ערכית עבור MRI ^4,5. מקרומולקולות מאוד מסועפות עם גדלים מוגדרים היטב נוטות לתגובות צימוד שונות על פני השטח שלהם. בעבודה זו, אנו מדווחים על הכנה, טיהור, ואפיון של CA dendrimeric עבור MRI המורכב פולי 4 דור (G4) (amidoamine) (Pamam) dendrimer מצמידים chelates דמוי GdDOTA (DCA). אנו מתארים את הסינתזה של נגזר DOTA מגבה הצימוד שלה אל dendrimer Pamam. עם complexation עם אלוקים (III), אפיון physicochemical תקן proceduמחדש של DCA בוצע. לבסוף, ניסויי MRI בוצעו כדי להדגים את היכולת של DCA להפיק תמונות MR עם ניגוד חזק מאלה המתקבלים CAs משקל מולקולרי נמוך.

פרוטוקול

1. הכנת DCA

1. סינתזה של היחידה monomeric 4 ^6.
   1. סינתזה של 4- (4-nitrophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (2).
      1. ממיסים (טרט 4,7-בשדרת -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraaza-cyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl -acetic חומצה טרט 1 (1.00 גר ', 1.94 מילימול) ב N, -dimethylformamide N ( DMF, 5 מ"ל), להוסיף אשלגן פחמתי (0.67 גר ', 4.86 מילימול, 2.5 equiv.) ומערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 45 דקות.
         הערה: מאקרו-ציקלי 1 הוכן cyclen ו טרט -butyl bromoacetate פי הנוהל שפורסם בעבר ^7.
      2. הוספת טרט -butyl-2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoate (0.87 גר ', 2.53 מילימול, 1.3 equiv.) Portionwise מעל 1 hr. המשך ערבוב לתערובת תחת tהוא באותו תנאי תגובה עבור 18 השעות הבאות.
         הערה: טרט -butyl-2-bromo-4- (4-nitrophenyl) butanoate הוכן מ 4- (4-nitrophenyl) חומצה -butyric, כלוריד Thionyl, וברום פי הנוהל שפורסם בעבר ^8.
      3. הסר DMF באמצעות זיקוק ואקום נורה אל הנורה ב 40-60 מעלות צלזיוס ^9.
      4. לטהר את שאריות ידי כרומטוגרפיה בעמודה (ג'ל סיליקה, 7% מתנול / dichloromethane) כדי להשיג מוצר 2 כמו ¹⁰ (1.09 גר ', 72%) מוצק אמורפי חום.
   2. סינתזה של 4- (4-aminophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (3).
      1. ממיסים את nitrobenzene נגזרת 2 (1.00 גר ', 1.28 מילימול) באתנול (10 מ"ל) ו -7 N פתרון אמוניה מתנול (150 μl). להוסיף פלדיום על פחם פעיל כזרז (Pd / C, 150 מ"ג, 15% WT) אל solutiעַל.
      2. לנער את התערובת הטרוגנית במשך 16 שעות תחת אווירת מימן (2.5 בר) במנגנון Hydrogenator הפאר.
      3. הכינו עוגה של כדור הארץ diatomaceous ידי השעייתו באתנול וסינון ההשעיה דרך משפך זכוכית sintered. יוצקים את ההשעיה מן 1.1.2.2 על העוגה מוכנה להסיר את הזרז Pd / C על ידי סינון.
      4. הסר את הממס על ידי זיקוק עדין על (טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) מאייד סיבובי להשיג במתחם 3 בתור (0.91 גר ', 95%) מוצק אמורפי חום.
   3. סינתזה של 4- (4-isothiocyanatophenyl) -2- (4,7,10-כמה עצוב טרט -butoxycarbonylmethyl-1,4,7,10- tetraazacyclododec-1-י.ל) אסתר -butyl טרט חומצה בוטירית (4).
      1. להוסיף thiophosgene (0.124 מ"ל, 1.58 מילימול, 1.3 equiv.) אל תערובת של 3 (0.91 גר ', 1.22 מילימול) ו triethylamine (0.685 מ"ל, 4.87 מילימול, equiv 4.) ב dichloromethane (15 מ"ל).
      2. במרץ לערבב את התגובה מילxture עם בוחש מגנטי בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות.
      3. הסר את הממס על ידי זיקוק עדין על (טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) מאייד סיבובי, ולאחר מכן לטהר את המוצר הגולמי ידי כרומטוגרפיה בעמודה (ג'ל סיליקה, 5% מתנול / dichloromethane) כדי לקבל את המוצר 4 כמו חום בהיר אמורפיות (0.51 גר ', 53%).
2. סינתזה של DCA dendrimer.
   1. סינתזה של dendrimer 5.
      1. קח dendrimer G4-Pamam (667 מ"ג, 10% פתרון dendrimer מתנול, 4.67 μmol), לאדות את מתנול על ידי זיקוק עדין על המאייד סיבובית (הטמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C), ו לפזר את שאריות DMF (4 מ"ל) .
      2. להוסיף triethylamine (0.105 מ"ל, 0.75 מילימול, 160 equiv.), ומערבבים במשך 45 דקות ב 60 מעלות צלזיוס, ולהוסיף isothiocyanate 4 (354 מ"ג, 0.45 מילימול, 1.5 equiv. ביחס לקבוצות משטח אמינו של dendrimer) אובה portionwiser 1 hr.
      3. מערבבים את תערובת התגובה עם בוחש מגנטי ב 45 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
      4. הסר את הממס באמצעות זיקוק ואקום נורה אל הנורה ב- C ° 40-60.
      5. לטהר את שאריות ידי כרומטוגרפיה בגודל הדרה באמצעות מדיום מתנול סינון ג'ל lipophilic כמו eluent. כדי לארוז את הטור, להתנפח תקשורת סינון מתנול לפחות 3 שעות בטמפרטורת חדר (> 4 מיליליטר של מתנול לכל 1 גרם של אבקה) ללא הפעלת לחץ. בצע הפרדה הכביד על ידי איסוף 1 מיליליטר שברים.
      6. לנתח את השברים שנאספו עם כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC). לפתח את צלחת TLC ב 15% מתנול / dichloromethane (במקום הקוטבי ביותר היחיד הממוקם על קו הבסיס נגזר מוצר dendrimeric). לאדות את השברים שנאספו על ידי זיקוק עדין על מאייד סיבובי (טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) כדי להשיג מוצר 5 (270 מ"ג, 91%).
   2. סינתזה של dendrimer
   3. ממיסים את chelator dendrimeric מוגן 5 (270 מ"ג, 4.23 μmol) ב חומצה פורמית (5 מ"ל) ומערבבים את התערובת על 60 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   4. לאדות את החומצה פורמית על ידי זיקוק על מאייד סיבובי (~ 15 לחץ mbar, טמפרטורה באמבט מים ~ 40 ° C) ולהקפיא-לייבש את המוצר לתת 6 (לחץ ~ 0.2 mbar) ^9.
3. סינתזה של חומר ניגוד dendrimeric (DCA)
   1. ממיסים את chelator dendrimeric 6 (4.35 μmol) במים ולהתאים את ה- pH ל 7.0 עם 0.1 הידרוקסיד M נתרן.
   2. ממיסים GdCl ₃ · 6H ₂ O (מ"ג 113, 304 μmol) במים (1 מ"ל) ולהוסיף אותו dropwise לפתרון chelator 6 על פני תקופה של 4 שעות; לשמור על pH ב 7.0 עם פתרון סודיום הידרוקסיד מימי (0.05 מ ') על ידי מדידת pH עם מד pH.
   3. מערבבים את התערובת עם בוחש מגנטי חדר temperature למשך 24 שעות.
   4. הוספת חומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA, 158 מ"ג, 426 μmol) אל portionwise הפתרון מעל 4 שעות כדי להסיר את עודפי ה '(III) תוך שמירה על pH ב 7.0 עם פתרון סודיום הידרוקסיד מימי (0.05 מ'). מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות.
   5. בצע כרומטוגרפיה בגודל הדרה להסיר את רוב GdEDTA ואת העודף של EDTA. השתמשו במדיית סינון ג'ל הידרופילי נפוחות במים לארוז הטור. להפחית את כמות נפח מתאים ולטעון הטור. Elute את העמודה עם מים ללא יונים ללא הפעלת לחץ.
   6. צנטריפוגה מדגם באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 3 kDa למשך 30 דקות XG ב צנטריפוגלי כוח 1,800 להסיר את שאריות של GdEDTA ו EDTA. חזור על שלב זה (בסביבות חמש פעמים) עד תסנין מעידה על העדר EDTA ו GdEDTA. מעבירים את המדגם לתוך הבקבוק, להתאדות זה, ולאחר מכן להקפיא-לייבש את הממס להשיג מוצר מחוץ לבן כמו DCA הסופי (186 מ"ג, 71%).
      הערה: בדוק בהעדר EDTA ו GdEDTA באמצעות ESI-MS.
   7. אשר בהעדר ה (III) כמו יון חינם באמצעות מבחן כתום xylenol. ממיסים את תסנין (0.5 מ"ל) ב פתרון חיץ אצטט (pH 5.8). הוסף כמה טיפות של פתרון כתום xylenol ולעקוב אחר השינוי בצבע (צהוב או סגול צבע מציין את העדר או נוכחות של הקב"ה חינם (III) יונים בתמיסה, בהתאמה) ^11.

2. אפיון Vitro של מוצרי Dendrimeric

1. הערכת מספר DOTA וואב macrocyclic מצמידים את dendrimer Pamam (הטעינה של dendrimer עם macrocycles DOTA דמוי)
   1. הערכה עם ¹ H NMR (תמ"ג - ספקטרוסקופיה בתהודה המגנטית הגרעינית).
      הערה: הליך זה אפשרי על dendrimers 5 ו -6, אבל לא על DCA.
      1. רשום את הספקטרום ¹ H NMR ^12.
      2. שלב באזור ארומטי שני האזורים אליפטיות נפרד (1. אותות של dendrimer אליפטיות ופרוטונים macrocyclic; 2. אותות של קבוצות -Bu T) או סתם אזור אליפטיות עבור dendrimers 5 ו -6, בהתאמה.
         הערה: אין אות נפרדת באזור אליפטיות שמקורה קבוצות -Bu t ב dendrimer 6 מאז הם כבר הידרוליזה.
      3. השתמש Eq. 1 או משוואה. 2 להעריך את מספר יחידות macrocyclic (n), כאשר R = היחס בין אינטגרלים (אליפטיות / ארומטי ב EQ. 1 או אליפטיות-dendrimer / aliphatic- T- Bu ב EQ. 2), _dend H = מספר הפרוטונים ב dendrimer, H _Ar = מספר פרוטונים ארומטיים, H _{t Bu} = מספר הפרוטונים בקבוצות -Bu t, ו- H _מק = מספר הפרוטונים מאקרו-ציקלי אחד.
         הערה: או משוואה. 1 או משוואה. 2 ניתן להשתמש FOr dendrimer 5, בעוד שרק Eq. 1 יכול לשמש dendrimer 6. מאז פרוטונים חליפיים (על אמינים, ואימידים, thioureas, או carboxylates) בדרך כלל מוחלפים דאוטריום, הם לא היו מניחים בחישובים. הנה, H _dend = 1,128 (עבור 5) או 1,000 (עבור 6), H _Ar = 4, ו- H _מק = 27 היו בשימוש.
         (1)
         (2)
   2. הערכה מ ניתוח יסודי באמצעות היחס בין החנקן והגופרית.
      1. בצע את ניתוח היסודות על מדגם dendrimeric המוצק (DCA בעבודה זו).
      2. השתמש Eq. 3 לאמוד את מספר יחידות macrocyclic (n), כאשר R = היחס בין N% נחוש% S, N _dend או S _dend = מספרחנקן או אטומי גופרית ב dendrimer, ו- N _מק או _מק = מספר אטומי חנקן או גופרית ביחידה macrocyclic אחד.
         הערה: הגורם 2.29 מתקבל יחס בהמוניהם אטומי גופרית וחנקן. בעבודה זו, N _dend = 250, S _dend = 2, N _מק = 5, ו- S _מק = 1 שימשו.
         (3)
   3. הערכת עם / desorption לייזר בסיוע מטריקס יינון הזמן של הטיסה (MALDI-TOF).
      1. בצע ניתוח MALDI-TOF MS ^13.
      2. לחשב את מספר יחידות macrocyclic (n) על פי משוואה. 4, כאשר M _z = המסה נצפתה (m / z), z = האישום של מינים, M _dend = המסה של חלק dendrimeric, ו- M _מק = המסה של יחידת macrocyclic אחד.
         לאTE: M _dend = 14,306 ו- M _מק = 719 שימשו בעבודה זו.
         (4)
2. קביעת ריכוז DCA ([DCA]): מדידת רגישות מגנטית גורפת (BMS)
   1. ממיסים DCA (5-10 מ"ג) במים (360 μl) בצינור בקבוקון פלסטיק ([DCA] ~ 5-10 מ"מ).
      הערה: [DCA] צריכה להיות בטווח של 5-10 מ"מ, כדי למנוע חפיפה אפשרית של תהודות BuOH T- בריכוזים מדגמים> 15 מ"מ, עם התהודה של מי δ = 4.7 ppm.
   2. הוסף 60 μl של D ₂ O: T- תערובת BuOH (2: 1 v / v) אל בתמיסה מימית של DCA ומערבבים את הפתרון שהתקבל (420 μl) בעזרת מערבל מערבולת.
   3. העברת 400 μl של המדגם לתוך צינור NMR חיצוני ומניח צינור כנס NMR קואקסיאליים עם BuOH טי: H ₂ O תערובת (10:90 v / v) לתוך הצינור המדגם.
   4. תקליטהספקטרום ¹ H NMR ומדידת היסט תדירות בין אותות תהודה הנובעים T- BuOH בתוך צינורות NMR הפנימיים והחיצוניים (הפניה) ^12.
   5. השתמש Eq. 5 כדי לקבוע את [DCA], שבו T = הטמפרטורה המוחלטת, Δχ = משמרת רשמה, מיקרון _EFF = המומנט המגנטי יעיל יון lanthanide (μ _EFF = 7.94 לאלוקים (III) ^14, ו- s = מחסורו מתמיד על הצורה של המדגם ולמקומה השדה המגנטי (0, 1/3, 1/6 ו במקרה של כדור, גליל במקביל, גליל בניצב לשדה המגנטי, בהתאמה).
      הערה: הערך המחושב שהתקבל עבור [DCA] צריך להיות מתוקן על הריכוז המקורי נובע מהוספה של D ₂ O: T- פתרון BuOH (60 μl).
      (5)
3. אור דינאמימדידות פיזור (DLS).
   1. כן פתרון DCA מסונן (0.2 מיקרומטר polytetrafluorethylene / מסנן PTFE, 0.75 מ"מ לכל ה (III)) ב 4- (2-hydroxyethyl) חומצת -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) חיץ (25 מ"מ, ה- pH 7.4) ולהעביר אותו לתוך קובט לשקילת DLS.
   2. מניח את קובט לתוך מנגנון DLS וכן להגדיר את הפרמטרים הבאים: 5 חזרות של 15 סריקות (1 סריקה = 12 שניות, מקדם שבירה = 1.345, קליטה = 1%) ללא עיכובים בין הסריקות ועם איזון טמפרטורה 30 שניות לפני ההקלטה .
   3. לייצא את הנתונים רכשו ולקבל את היסטוגרמה התפלגות גודל על ידי התוויית אוכלוסייה (%) כפונקציה של גודל (קוטר הידרודינמית).
4. מדידה של relaxivities האורך הרוחבי.
   הערה: הליך דומה כבר תואר באמצעות מנתח זמן הרפית ^15; הליך זה בוצע באמצעות ספקטרומטר תמ"ג 300 MHz עם Topspinתוֹכנָה.
   1. להכין סט של פתרונות DCA ב H ₂ O: D ₂ O (500 μl, 10% D ₂ O ב H ₂ O, [DCA] = 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, ו -5.0 מ"מ, [HEPES ] = 25 מ"מ) מן מדגם מניות DCA (ראה סעיף 2.2).
   2. העבר 450 μl של פתרון לתוך צינור NMR ולמקם אותו לתוך המכשיר.
   3. מטב את פרמטרי הרכישה (90 ° משך דופק עירור (P1), ותדירות הקרנה לקזז (O ₁₎₎ ולאחר מכן לבצע את T ₁ ו- T ₂ ניסויים באמצעות התאוששות ההיפוך (IR) לבין רכב-פרסל-Meiboom-גיל (CPMG ) רצפים דופקים, בהתאמה.
   4. קביעת פעמים הרפיה T ₁ ו- T _2.
      1. בחר את המדידה, תהליך הקליטה את ספקטרום 2D במימד F2, ולבצע את התיקון השלב אינטראקטיבי.
      2. בחר את הפרוסה המתאימה (שיא בעצמה מקסימלית) ב- Analysis / T _2, ולשלבו, ולייצא באזור למודול הרפיה.
      3. בחר את פונקציית הולם המתאים (invrec או uxnmrt2 לניסויים IR ו CPMG, בהתאמה) כדי לקבל את פעמים הרפיה T ₁ או T _2.
   5. חזור על שלבים 2.4.4.2-2.4.4.4 עבור כל הפעולות הנותרות [DCA].
   6. חשב את שיעורי הרפיה (R ₁ ו- R ₂₎ מן הערכים T ₁ השיג (R _1,2 = 1 / T _1,2).
   7. מגרש R ₁ ו- R ₂ (sec ^-1) כפונקציה של הקב"ה (III) ריכוז מ"מ.
   8. קבע את relaxivities האורך רוחבי, r ₁ ו R ₂ (sec ^-1 מ"מ ^-1), מן השיפוע של הקו מצויד, כפי שהוגדר על ידי Eq. 6, כאשר R _{i, obs} = האורך (i = 1) או רוחבי (i = 2) שיעור הרפיה diamagnetic שלמים בהיעדר מינים פאראמגנטיים ו [הקב"ה] = ריכוז ה (III) השתמשו בניסוי.
      (6)

3. במבחנה MRI; השוואה בין DCA ו GdDOTA

1. הכנת רוחות רפאים צינור
   1. הכינו פתרונות מימית של DCA (4 x 350 μl) ו GdDOTA (4 x 350 μl) כמו גם דגימות מים (4 x 350 μl) עבור שני סטים של ניסויים בהם ריכוז של חומר ניגוד מחושב: (3.1.1.1) לכל ה (III) או (3.1.1.2) לכל מולקולה.
      1. הכינו שתי דגימות DCA ושני GdDOTA דוגמאות עם ריכוזים של 0.5 ו -1.0 מ"מ לכל ה (III), בהתאמה. בנוסף, להכין שתי דגימות מים (כמו צינורות שליטה).
      2. הכן שתי דגימות DCA (2.5 ו -5.0 מ"מימ לכל ה (III) או 0.05 ו -0.1 מ"מ לכל מולקולת dendrimeric), שתי דגימות GdDOTA (0.25, 0.5 מ"מ) ושתי דגימות מים (מערכות בכלצינורות l).
         הערה: ריכוזי DCA ו GdDOTA המתאימים צריכים להיות מוכנים על ידי דילול דגימות מניות בהתאמה עם ריכוזים נקבעו באמצעות שיטת BMS (ראה סעיף 2.2) עם חיץ HEPES (pH 7.4). על מנת לפשט את החישובים, n = 50 הונח על המספר הממוצע של יחידות macrocyclic לכל מולקולה dendrimer. לכן, היחס של DCA: GdDOTA היה 1: 5, מחושב על בסיס לכל מולקולה.
   2. מניח את הדגימות 300 צינורות μl בקבוקון פלסטיק, הימנעות הנוכחות של בועות אוויר בתמיסה.
      הערה: הגודל של צינורות בקבוקון פלסטיק תלוי בסוג וגודל של הסליל גלי רדיו בשימוש (כאן, דוגמה עם סליל נפח ניתנת).
   3. הכנס את דגימות בתוך מזרק (60 מ"ל נפח), למלא אותו עם 1 מ"מ GdDOTA פתרון, ולמקם אותו בתוך הסורק.
      הערה: דוגמאות הושמו בתמיסה המימית של GdDOTA כדי למנוע תופעות רגישות (וריאציות של השדה המגנטיtrength המתרחשת ממשקים ליד בין חומרים של רגישות מגנטית שונה).
2. אופטימיזציה והדמיה פרמטר.
   1. השתמש סריקה אנטומית (Localizer / Tripilot) כדי למקם את המזרק עם דגימות isocenter של המגנט.
   2. לחץ על הרמזור (סריקת התאמה) כדי לבצע התאמות עבור shimming (התאמת ההומוגניות שדה מגנטיות) של כל הנפח, התדירות המרכזית (O _1), מרוויח המקלט (RG), ורווח השידור (TX0 ו TX1).
   3. עבור T ₁ משוקלל (T _1W) הדמיה, בחר נמוכה זווית ירו מהירה (FLASH) שיטה.
   4. בחר פרוסת העטרה עבור הדגימות להציב במאונך (מזרק אופקי) בתוך הסורק באמצעות סריקת Localizer.
   5. השתמש Eq. 7 לאופטימיזציה של ניגוד לרעש הרכישה (CNR) פרמטרים ^16, שבו α = הזווית להעיף, TE = זמן ההד, TR =הזמן חזרה, ו- T _{1, A,} T _{1, B} = ה- T ₁ פעמים של מדגם (T _{1, א)} ו מדגם B (T _{1, B)} שעבורם CNR צריך להיות מוגדל (באותו תקף T ₂ פעמים: T _{2, A} ו- T _{2, B).}
      הערה: T ₁ והרפית T ₂ פעמים צריכות להיות מוגדרות ערכים שהתקבלו המדידות של relaxivities האורך הרוחבי (סעיף 2.4), ואילו TE, TR, ו α יש לקבל את חישוב אופטימיזציה CNR.
      (7)
   6. רוכש את התמונה באמצעות הפרמטרים שהושגו בשלב הקודם (3.2.5).
   7. חשב את יחס אות לרעש (SNR).
      1. טענתי את תמונת T _1W רכש (סריקה) לתוך תצוגת תמונות & עיבודחלון, ולחץ על גדר באזור (ROI) ריבית.
      2. בחר ROI עגול ולצייר אותו במיקום מדגם והרקע. בהמשך לכך, לחץ על צג כדי להשיג את משרעת האות הממוצעת _(אות S) ואת סטיית התקן של _(רעש S) ברקע.
      3. חזור על שלב 3.2.7.2 עבור DCA, GdDOTA, דגימות מים.
      4. חשב את SNR באמצעות הנוסחה: SNR = _האות S / S _רעש.
   8. בעקבות הליך שונה במקצת, לבצע T ₂ משוקלל (T _2W) הדמיה באמצעות הרכישה המהירה עם שיפור הרפיה (RARE) שיטה. עבור אופטימיזציה של הפרמטרים רכישת CNR, להשתמש Eq. 8.
      (8)

תוצאות

הכנת DCA מורכב משני שלבים: 1) סינתזה של chelator DOTA מסוג monomeric (איור 1) ו -2) צימוד של chelator עם dendrimer G4 Pamam והכנת הבאות של הקב"ה dendrimeric (III) מורכבים (איור 2) . בשלב הראשון, chelator cyclen המבוסס DOTA מהסוג המכיל ארבע חומצות קרבוקסיליות וקבוצה מאונכת מתאימה שינויים סינטטיים נוספים הוכן. הכנת תחילתה 1 (DO3A- אסתר -butyl טרט) ^7, אשר היה alkyl...

דיון

הכנת חומר ניגוד MRI dendrimeric דורשת בחירה מתאימה של יחידת monomeric (כלומר, chelator לאלוקים (III)). הם מפחיתים את הרעילות של יון פאראמגנטיים זה, עד כה, מגוון רחב של אציקליות ו chelators macrocyclic לשרת מטרה זו ^1-3. בין אלה, chelators DOTA מסוג macrocyclic להחזיק את היציבות התרמודינמית הגבוהה ביותר אדישות הקינטית, ומכאן, הם הבחירה המועדפת ביותר לעריכת חומר ניגוד MRI אינרטי ^1,18. יתר על כן, הם נוטים טרנספורמציות סינטטיות שונות, אשר לגרום chelators ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Cyclen	CheMatech	C002
tert-בוטיל ברומואצטט	Alfa	Aesar A14917
N,N-דימתילפורממיד	פלוקה	40248
אשלגן פחמתי	סיגמא-אולדריץ'	209619
4-(4-ניטרופניל)חומצה בוטרית	אולדריץ'	335339
תיוניל כלוריד	Acros Organics	382662500	הערה: חומר מאכל; רעיל בשאיפה
ברום	Acros Organics	402841000	הערה: גורם לכוויות עור חמורות, קטלניות בשאיפה
דיאתיל אתר	כל מקור
נתרן גופרתי	אקרוס אורגני	196640010
כלורופורם	VWR Chemicals	22711.29
tert-בוטיל 2,2,2-trichloroacetimidate	Aldrich	364789	הערה: חומר דליק; מגרה לעור ולעיניים
בורון טריפלואוריד אתראט	Acros Organics	174560250	48% BF3. הערה: חומר דליק; גורם לכוויות בעור, קטלניות אם נשאף
נתרן ביקרבונט	Acros Organics	424270010
אתיל-אצטט	כל מקור		לכרומטוגרפיה של עמודות
n-הקסאן	כל מקור		לכרומטוגרפיה של עמודות
מכשיר זיקוק נורה לנורה (Kugelrohr) B	ü צ'י	סוג דגם: תנור זכוכית B-585
	כל מקור		לכרומטוגרפיה של עמודות
אתנול	VWR כימיקלים	20821.296
אמוניה	אקרוס אורגניקס	428381000	7 N תמיסה במתנול
פלדיום	אולדריץ'	643181	15%
מכשיר הידרוגנציה רטוב PARR PARR	PARR Instrument Company
Celite 503	Aldrich	22151
משפך זכוכית מסונטרת	בכל מקור
Thiophosgen	Aldrich	115150	הערה: מגרה לעור; רעיל בשאיפה
טריאתילאמין	אלפא Aesar	A12646
דיכלורומתאן	אקרוס אורגניקס	348460010	יבש במיוחד
מערבל מגנטי	בכל מקור
PAMAM G4 Dendrimer	Andrews ChemService	AuCS - 297	10% wt. תמיסה ב- MeOH
Lipophylic Sephadex LH-20	Sigma	LH20100
לוחות כרומטוגרפיה בשכבה דקה	Merck Millipore	1.05554.0001
חומצה פורמית	VWR Chemicals	20318.297
לופיליזטור	כל מקור
Gadollinium (III) כלוריד הקסהידרט	Aldrich	G7532
נתרן הידרוקסיד	Acros Organics	134070010
מד pH	כל מקור
Ethylenediaminetetraacetic חומצה דיסודיום מלח דיהידראט	Aldrich	E5134
ספקטרומטר מסה (ESI)	Agilent		Ion מלכודת SL 1100
חוצץ אצטט	בכל מקור		pH 5.8
קסילנול תפוז	אולדריץ'	52097	20 μ M במאגר אצטט
הידרופילי Sephadex G-15	GE Healthcare	17-0020-01
Amicon Ultra-15 יחידת סינון צנטריפוגלי	Merck Millipore	UFC900324	Ultracel-3 ממברנה (MWCO 3000)
צנטריפוגה	בכל מקור
ספקטרומטר NMR	Bruker		Avance III 300 MHz
Topspin	Bruker		גרסה 2.1
מכשיר ניתוח בעירה	EuroVector SpA		EuroEA 3000 מנתח יסודות
MALDI-ToF MS מכשיר	יישומי ביוסיסטמס		Voyager-STR
Deuteriumoxid	Carl Roth GmbH	6672.3
tert-בוטיל אלכוהול	Carl Roth GmbH	AE16.1
מערבל מערבולת	כל מקור
Norell NMR צינורות	Deutero GmbH	507-HP-7
NMR צינור	קואקסיאליDeutero GmbH	קואקסיאלב-5-7
DLS מכשיר	Malvern		Zetasizer Nano ZS
0.20 μ מסנן PTFE מ '	Carl Roth GmbH	KC94.1
HEPES	Fisher BioReagents	BP310
בקבוקוני צינור פלסטיק	כל מקור
Dotarem	Guerbet		NDC 67684-2000-1
סורק MRI	מגנט Bruker		BioSpec 70/30 USR (7 T). הערה: סכנות פוטנציאליות הקשורות לשדות מגנטיים גבוהים
סליל RF	Bruker		סליל נפח בתדר כפול (RF RES 300 1H/19F 075/040 LIN/LIN TR)
Paravision (תוכנה)	Bruker		גרסה 5.1