בדיקות אופטיות מבוססות ננו-חלקיקים תוכננו ככלי לזיהוי אנטיגנים באמצעות ספקטרוסקופיה של Raman ו-UV-Vis. כאן אנו מתארים פרוטוקול להכנת בדיקות כאלה לבדיקה אימונולוגית של ספקטרוסקופיה UV-Vis/Raman באופן שישלב יכולות ריבוב עתידיות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בודה UV-Vis ראמאן ספקטרוסקופיה פלטפורמת Immunoassay
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Immunoassays המשמשים לאיתור חלבונים המבוססת על נוכחות של נוגדנים הקשורים. בשל השימוש הנרחב שלהם במחקר במסגרות קליניות, תשתית גדולה של מכשירי immunoassay וחומרים ניתן למצוא. לדוגמא, 96 ו 384 גם צלחות קלקר זמינות מסחרית ויש תכנון סטנדרטי כדי להכיל מכונות ספקטרוסקופיה אולטרה סגולות-גלוי (UV-Vis) מיצרנים שונים. בנוסף, מגוון רחב של נוגדנים, תגי זיהוי, וסוכני חסימת עיצובי immunoassay אישית כגון מבחני immunosorbent enzyme-linked (ELISA) זמין.
למרות התשתית הקיימת, ערכות ELISA סטנדרטיים אינם לענות על כל הצרכים המחקר, המחייב פיתוח immunoassay אישית, אשר יכול להיות יקר זמן רב. לדוגמא, ערכות ELISA יש ריבוב נמוך (זיהוי של יותר אנליטי אחד בכל פעם) יכול כפי שהם תלויים בדרך כלל קרינה או colשיטות orimetric לגילוי. מדד-צבע וניתוחים פלורסנט מבוססת יש יכולות מוגבלות ריבוב בשל פסגות רפאים רחבות. לעומת זאת, ראמאן בשיטות מבוסס ספקטרוסקופיה יש יכולת הרבה יותר עבור ריבוב בשל פסגות פליטה צרות. יתרון נוסף של ספקטרוסקופיית ראמאן הוא שכתבי ראמאן לחוות photobleaching פחות משמעותי מאשר תגי פלורסנט 1. למרות היתרונות שכתבי ראמאן יש מעל תגי פלורסנט colorimetric, פרוטוקולים לפברק immunoassays המבוסס ראמאן מוגבל. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול להכין בדיקות פונקציונליות לשימוש בשילוב עם לוחות קלקר לגילוי ישיר של analytes ידי ניתוח UV-Vis ו ספקטרוסקופיית ראמאן. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לקחת עשה זאת בעצמך גישה לגילוי רב-אנליטי בעתיד תוך ניצול תשתית שנקבעה מראש.
מבוא
immunoassays כריך האופייני בעקיפין לזהות הנוכחות של אנטיגן באמצעות שני נוגדנים. הנוגדן ללכוד מאוגד משטח יציב ויוצר קומפלקס נוגדן-אנטיגן כשהוא קרוב אנטיגן המתאים. נוגדן זיהוי מכן הוא הציג נקשר אנטיגן. לאחר הכביסה, הנוגדן / אנטיגן / שרידי ההרכב נוגדן והוא זוהה על ידי נוגדן זיהוי שכותרתו כפי שמודגם באיור 1 א. זיהוי טיפוסי נעשה על ידי גלאי פלורסנט או colorimetric, הגבלת ריבוב עד 10 analytes בשל פסגות רפאים רחבות 2,3. לעומת זאת, מערכות מבוססות ראמאן יש הרבה פסגות פליטת צרה וכתוצאה מכך יכול ריבוב משופר עם מקורות בטענת זיהוי סימולטני של עד 100 analytes 2,3.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנת Buffers
- פוספט שנאגר מלוח (PBS)
- לדלל 50 מ"ל של 10x PBS עם 450 מ"ל מים כיתה HPLC לבצע ריכוז 1x PBS. סינון סטרילי הפתרון עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
- פתרון חנות בטמפרטורת החדר.
- הכנת טריס בופר + Tween 20 (TBST)
- לדלל 50 מ"ל ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
במחקר זה, 60 חלקיקי זהב ננומטר שימשו ספקטרוסקופיה UV-Vis. UV-Vis ספקטרום קליטה מן 400 כדי 700 ננומטר נאספו אזורי השיא עבור כל ריכוז AuNP נקבע באמצעות תוכנת ניתוח ספקטרלי קוד פתוח 8. לפני לשיא אינטגרציה, ספקטרה שנאספה עברה תיקון בסיס באמצעות התאמה פולינום שלוש נקודות. באזורי שיא שמשו כדי ליצור עקומת כיול לוגריתמים כפי שמודגם באיור 4. יצוין כי איורים 4 ו -5 משולב עקומות כיול לוגריתמים. השימוש עקום כיול שאינו ליניארי יכול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
בפרוטוקול המפורט, ישנם מספר נקודות קריטיות לכתובת. נושא אחד הוא הבחירה של כתב רמן ננו-חלקיקים מזהב. אף על פי הפרוטוקול נכתב כדי להיות מותאם לשימוש אישי, כתב ראמאן DTTC שמש כדוגמא. DTTC הוא כתב מטען חשמלי חיובי ונקשר טיעונים שליליים משטחים כגון AuNPs כתרי ציטראט. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור כתבים טעונים שלילי באמצעות חלקיקי זהב עם מטען משטח חיובי. לדוגמה, polyethyleneimine (PEI) כתרים AuNPs לספק מטען משטח חיובי וטוב יותר מחייב עם כתבים-טעונים שלילית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פרס קטליזטור מחקר מאוניברסיטת יוטה סטייט. המחברים רוצים להודות לאנליז דייקס, קמרון זבריסקי ודונלד וולי על תרומתם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ננו-חלקיק זהב 60 ננומטר | טד פלה, בע" | 15708-6 | אלו הם ננו-חלקיקי זהב מצופים ציטראט. אנא ראה דיון על הקשר בין כתב ראמאן למטען פני השטח של AuNP וחשיבותו לבחירה נכונה של כתב AuNP ו/או ראמאן. |
| נתרן ביקרבונט | פישר סיינטיפיק | S233-500 | |
| מתנול | Pharmco-Aaper | 339000000 | |
| Tris Buffered Sa Salt (10x) pH 7.5 | Scy Tek | TBD999 | |
| יחידת סינון עליונה לבקבוקים | VWR | 97066-202 | |
| Tween 20 (פוליסורבט 20) | Scy Tek | TWN500 | משמש כחומר מתחלב לשלבי כביסה. |
| תרכיז תמיסת מלח חומצה פוספט 10x, pH 7.4 | Scy Tek | PBD999 | |
| חלבון LoBind שפופרת 2.0 | צינורות Eppendorf | מ | צינורות LoBind מונעים קשירה של חלבונים ו-AuNPs למשטחי הצינורות. |
| שפופרת חלבון LoBind 0.5 | צינורות Eppendorf | מ | צינורות LoBind מונעים קשירה של חלבונים ו-AuNPs למשטחי הצינורות. |
| התקני Microplate UniSeal | GE Healthcare | 7704-0001 | משמש לאיטום ואחסון צלחות פונקציונליות. |
| צלחת בדיקה, עם מכסה אידוי נמוך, 96 באר תחתית שטוחה | Costar | 3370 | |
| HPLC מים בדרגת | Sigma Aldrich | 270733-4L | |
| 3,3′-Diethylthiatricarbocyanine iodide (DTTC) | Sigma Aldrich | 381306-250MG | כתב Raman |
| mPEG-Thiol, MW 5,000 - 1 גרם | Laysan Bio, Inc. | MPEG-SH-5000-1G | |
| OPSS-PEG-SVA, MW 5,000 - 1 גרם | לייסן ביו, בע"מ | ל-OPSS-PEG-SVA-5000-1G | OPSS-PEG-SVA יש קצה NHS. |
| Mouse IgG, Whole Molecule Control | Thermo Fisher Scientific | 31903 | אנטיגן |
| עז אנטי-עכבר IgG (H+L) נוגדן משני נספג חוצה Thermo | Fisher Scientific | 31164 | נוגדן |
| תמיסת חסימת אלבומין בסרום אנושי | Sigma Aldrich | A1887-1G | ניתן להשתמש באלבומין בסרום בקר במקום. |
| מיני צנטריפוגה | פישר Schientific | 12-006-900 | |
| ספקטרופוטומטר UV-Vis | Thermo Scientific | Nanodrop 2000c | |
| UV-Vis ספקטרופוטומטר | BioTek | Synergy 2 | |
| עמודי התפלה | Thermor Scientific | 87766 | |
| נבנה בבית 785 יחידת מיקרוסקופ רמאן הפוכה ננומטר | N/A | N/A | מיקרוסקופ רמאן הפוך הוא הטוב ביותר למיקוד נכון על פני לוחית הבאר. אחרת ייעשה שימוש בהגדלה נמוכה מאוד עקב גובה צלחת 96 הבארות. נעשה שימוש במערכת שנבנתה בתוך הבית מכיוון שהיא הייתה זולה יותר מקנייה מספק. עם זאת, ניתן להשתמש בכל מערכת מיקרוסקופ ראמאן הפוכה הזמינה מסחרית. |
מקורות
- Israelsen, N. D., Hanson, C., Vargis, E. Nanoparticle properties and synthesis effects on surface-enhanced Raman scattering enhancement factor: an introduction. Sci. World J. , e124582(2015).
- Wang, Y., Schlücker, S. Rational design and synthesis of SERS labels. Analyst. 138 (8), 2224-2238 (2013).
- Wang, Y., Yan, B., Chen, L.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
