מאמר שיטה

אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

10.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54799

⸱

3 במרץ 2017

 ,  ,  ,  , 
1Brown University, 2COBRE Center for Cancer Research, Lifespan Laboratories, Rhode Island and Miriam Hospitals, 3Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Warren Alpert Medical School, Brown University

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מתארים שיטה פרוטאומיקה כמותית באמצעות טכניקה של תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC) כדי לנתח את ההשפעות של זיהום HIV-1 על proteomes מארח exosomal. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מותאם תאים בתנאי קיצון או זיהום שונים.

תקציר

פרוטאומיקה היא ניתוח בקנה מידה גדול של חלבונים. טכניקות פרוטאומיות, כגון ספקטרוסקופיה טנדם של כרומטוגרפיה נוזלית (LC-MS/MS), יכולות לאפיין אלפי חלבונים בכל פעם. טכניקות עוצמתיות אלו מאפשרות לנו לקבל הבנה מערכתית של שינויים תאיים, במיוחד כאשר תאים נתונים לגירויים שונים, כגון זיהומים, מתחים ותנאי בדיקה ספציפיים. אפילו עם ההתפתחויות האחרונות, ניתוח הפרוטאום האקסוזומי גוזל זמן ולעתים קרובות כרוך במתודולוגיות מורכבות. בנוסף, מערך הנתונים הגדול שנוצר זקוק לעתים קרובות לניתוח חזק ויעיל על מנת שהחוקרים יבצעו מחקרים נוספים בהמשך הזרם. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מבוסס SILAC לאפיון הפרוטאום האקסוזומי כאשר תאים נגועים ב-HIV-1. השיטה מבוססת על תיוג איזוטופים פשוט, בידוד אקסוזומים מתאים המסומנים באופן דיפרנציאלי וניתוח ספקטרומטריית מסה. לאחר מכן כריית נתונים מפורטת וניתוח ביואינפורמטי של הלהיטים הפרוטאומיים. מערכי הנתונים והמועמדים המתקבלים קלים להבנה ולעתים קרובות מציעים שפע של מידע שימושי לניתוח במורד הזרם. פרוטוקול זה חל על תאים תת-תאיים אחרים ועל מגוון רחב של תנאי בדיקה.

מבוא

מחל אנושיות רבות, כוללים זיהומים נגיפיים, הקשורים לעתים קרובות עם תהליכים תאיים ייחודיים המתרחשים בתוך ומסביב התאים הנגועים. חלבונים, לעיתים קרובות מתנהג כמו effectors הסלולר האולטימטיבי, לתווך תהליכים אלה. ניתוח של חלבונים יכול לעיתים קרובות לספק מידע רב ערך לגבי הסביבה המקומית של התאים הנגועים ולעזור לנו להבין את המנגנון הבסיסי של בהיווצרות המחלה. בין טכניקות ניתוח חלבון שונות, פרוטאומיקה מחזיקה במיוחד הבטחה גדולה. ככלי רב עוצמה, בקנה מידה גדול, פרוטאומיקה יכול לספק הבנה מערכתית של תהליכים תאיים, במיוחד בתחום של הפונקציה ואת האינטראקציה של חלבונים. ניתוח חלבונים ספציפיים נעשה פשוט יותר באמצעות הפיתוח של טכניקות תיוג, המאפשרות לחוקרים לעקוב אחר הביטוי של מרכיבים תאיים, במיוחד חלבונים, באתר של חקירה. למרות ניתוחים proteomic רבים בוצעו על הסלולרסולם proteome, אפיוני proteomic על תאי subcellular הוכיח להיות במיוחד אינפורמטיבי 1. זה בא לידי ביטוי גם במחקרים של הידבקות ב- HIV-1.

Exosomes, 30-100 שלפוחית קרום ננומטר המופרש על ידי מגוון רחב של סוגי תאים 2, 3, הם מרכיבים קריטיים של תקשורת בין תאית ותחבורה מולקולרית. הם התגלו בעבר למלא תפקידים חשובים בתהליך 4 ניצני HIV-1, 5. על ידי שילוב של ניתוח proteomic עם לנתיחה פונקציונלית, מצאנו כי exosomes שוחרר מבית HIV-1 תאים נגועים מורכב מולקולות רגולטוריות חתימה ונמל חלבון ייחודיות כמותית שונים המשפיעות תכונות הסלולר על תאי שכנים פתוחים, כוללים אפופטוזיס הסלולר ושגשוגם 6. השיטות מתוארות פרוטוקול זה,כלומר SILAC (תיוג איזוטופ יציב על ידי חומצות אמינו תרבית תאים) 7 אפיון proteomic מבוסס של exosomes מתאי נגועים ב- HIV-1. ניתן ליישם גישות דומות כדי להבין טוב יותר תאים subcellular אחרים בזמן בפתוגנזה ידי התאמת הלחץ ניסיוני לתא או חלק מסוים של עניין ולהפוך את השינויים הדרושים כדי ההליכים המתוארים.

בהינתן ההתפתחות האחרונה של שיטות proteomic כמוני, יש הרבה לבחירה בעת בחירת השיטה היעילה ביותר עבור ניסוי מסוים. ביניהם ניתן למנות את iTRAQ מבוסס הכימי (תגי isobaric כימות יחסית ומוחלטת) 8 ואת ללא התווית MRM (ניטור תגובה מרובה) 9 טכניקות. שתי השיטות הם כלים רבי עוצמה הם בחירה טובה עבור הגדרות ספציפיות. עבור מעבדה אופיינית בעיקר בעבודה עם שורות תאים, עם זאת, יש שתי שיטות אלה relatively עלויות גבוהות יותר והם יותר זמן רב בהשוואה לשיטה המבוססת SILAC. SILAC היא טכניקה תיוג מבוסס מטבולית המשלבת צורות איזוטופי nonradioactive של חומצות אמינו מן התקשורת והתרבות לתוך חלבונים תאיים. בדרך כלל, ניסויי SILAC להתחיל עם שתי אוכלוסיות תאים, למשל, נגוע נגוע. כל שכותרתו דיפרנציאלי בסביבת איזוטופים הספציפית שלה עד תיוג מלא מושגת. Exosomes שכותרתו של תאים אלה חשופים אז כדי מיצוי חלבון. לאחר שחולץ, חלבוני exosomal שכותרתו מנותחים באמצעות ספקטרוסקופיית מסות טנדם כרומטוגרפיה הנוזלית 10. לבסוף, את התוצאות ספקטרומטריית מסה וחלבונים שכותרתו משמעותית חשופים סטטיסטי וביואינפורמטיקה מנתח וכן אימות ביוכימיים קפדנית. התחקירים הקודמים שלנו מראים כי נהלי SILAC / exosome מתאימים יותר עבור שורות תאים מאשר תאים ראשוניים, כמו שורות תאים בדרך כלל נמצאותמדינה מתרבה פעילה עבור תיוג איזוטופי יעיל,

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. תא תרבות ו- HIV-1 זיהום

הערה: לפני שמתחילים ניסויים, מומלץ לבדוק את הכדאיות של התאים באמצעות Trypan כחול מכתים 11 ושגשוגם שלהם באמצעות assay MTT 12. זה גם קריטי להשתמש בינוני SILAC מוכן חדש. שורות תאים שונות ניתן להשתמש, כל עוד הם נמצאים בשלב שגשוג פעיל, והם רגישים זיהום HIV-1, או תנאי הבדיקה של בחירה. בפרוטוקול זה, השתמש שורת תאי H9 כמו בדוגמא.

  1. Seed 2 x 10 6 תאים H9 לתוך בקבוק אחד תרבית תאים. לגדול קבוצה אחת ב 10 מ"ל שכותרתו RPMI 1640 בינוני המכילה סרום שור 10% dialyzed העובר (FBS), 100 מ"ג / L 13 C 6 L-ליזין 100 מ"ג / L 13 C 6 15 N 4 L-arginine. לגדל את הקבוצה השנייה ב 10 מ"ל בינוני ללא תווית RPMI 1640, עם 10% dialyzed FBS, 100 מ"ג / L L- ליזין ו -100 מ"ג / L L- ארגינין.
  2. לגדל את התאים במשך שש הכפלות ובנקודת החלבונים של התאים במדיום שכותרתו כמעט מסומנים לגמרי (> 99%) עם חומצות אמינו כבדות. הוסף מדיה טריה או לשנות תקשורת באופן קבוע (כל 1-3 ימים, תלוי בסוג של תאים. לקבלת תא H9, לשנות בינוני כל 3 ימים). בסוף תיוג, להגדיל את נפח תרבות (למשל ~ 30 מ"ל) כדי להתאים את הצמיחה של תאים יותר.
    הערה: בדוק תא מדויק זמן הכפלה בתחילת הניסוי באמצעות מכתים Trypan הכחול תא ספירה.
  3. להדביק את התאים שכותרתו עם HIV-1 NL4-3 באמצעות פרוטוקול הידבקות ב- HIV-1 תקן 13 במשך 48 שעות. דגירה התאים עם כמויות מתאימות של וירוס עם ריבוי של זיהום (משרד הפנים) סביב 0.3. בדוק הידבקות ב- HIV-1 על ידי כימות p24 של supernatants תרבות באמצעות ערכת ELISA אנטיגן p24 HIV-1. בצע assay immunofluorescence 14 כדי לאשר זיהום מוצלח של תאים. Keep גדל התאים ללא תווית במדיום ללא תווית ללא הידבקות ב- HIV-1.
  4. קציר supernatants של שתי הקבוצות בסוף זיהום (שלב 2.1).

2. בידוד Exosome

הערה: באמצעות סדרה של צעדי ultracentrifugation, שברי exosomal מן supernatants התרבות מועשרים 15. בצע את כל השלבים הבאים ב 4 ° C, עם הרוטור ultracentrifuge שיכולים להגיע למהירות של g x 100,000 לפחות.

  1. אסוף את supernatants של תרבויות ב 50 צינורות חרוטי מ"ל, הימנעות תאים. צנטריפוגה אותם במשך 10 דקות ב 300 XG כדי להסיר תאים הנותרים.
  2. אסוף את supernatants צינורות חרוטי חדש 50 מ"ל ו צנטריפוגות אותם במשך 10 דקות XG ב 2000 כדי להסיר תאים מתים. העברת וכתוצאה supernatants לצינורות הרוטור תואם מסחרי כי הם מסוגלים לעמוד ultracentrifugation.
  3. הקפד לאזן את צינורות ultracentrifuge. צנטריפוגה צינורות במשך 30 דקות ב XG 10,000 להסירפסולת תא.
  4. אסוף את supernatants צינורות ultracentrifuge ו צנטריפוגות במשך 70 דקות ב 100,000 x ז. מחק את supernatants.
  5. Resuspend את הכדורים עשירים exosome ב 5 מיליליטר של PBS הטרי. מעביר את פתרונות צינורות צנטריפוגות ultracentrifuge טריים שוב במשך 70 דקות ב 100,000 x ז.
  6. supernatants מחק. כדי לאחסן את exosomes לטווח ארוך, resuspend את הכדורים ב 50 μl של PBS ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. לחלופין, להמשיך ישירות מיצוי חלבון כמוצג להלן.

3. חלבון כרייה הכנה

  1. ממיסים כדורי exosomal מבודד 100-200 μl Ripa חיץ תמוגה והפקת עם קוקטיילים מעכב פרוטאז הוסיף. המאגר מורכב של 25 מ"מ טריס-הידרוכלוריד, 150 נתרן כלורי מ"מ, 1% NP-40, deoxycholate נתרן 1%, ו -0.1% SDS (סולפט dodecyl נתרן), ב- pH 7.6. קוקטיילים מעכב פרוטאז צריך להכיל מגוון של מעכבי פרוטאז, כגון aprotinin, bestatin, leupeptin, pepstatin A ו- EDTA (חומצה ethylenediaminetetraacetic), שיכולים לעכב מגוון רחב של פרוטאזות.
  2. צנטריפוגה הפתרונות מומס במשך 10 דקות ב 13,000 XG (4 ° C), ולהעביר את supernatants פינה צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge חדש.
  3. לכמת ריכוז החלבון של כל דגימה של exosomes באמצעות חומצה bicinchoninic (BCA) או ברדפורד assay 16.
  4. מערבבים כמות שווה של חלבונים (2 מיקרוגרם) ממדגמים שכותרתו ללא תווית ולהפעיל את תערובת שווה על ג'ל 4-20% SDS-PAGE ב 120 מילי-אמפר / 200 V למשך 30 דקות.
  5. ג'ל הכתם עם Coomassie כחול ואחריו destaining 17.
  6. באמצעות סכין גילוח, לחתוך את שביל המדגם מן הג'ל. ואז לחתוך את השביל הג'ל לתוך 10-15 חתיכות שווות. שים כל חתיכה לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר טרי עבור סכום כולל של 10-15 צינורות.
  7. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 ב אצטוניטריל 50%, מערבולת, וזורקים supernatants. חזור פעמיים. יָבֵשׁקוביות concentrator ואקום 18, 19.
  8. רעננותם קוביות עם 10 מ"מ dithiothreitol (DTT), מערבולת, ו צנטריפוגות בקצרה. לדגור על 56 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. supernatant מחק.
  9. לטבול קוביות ג'ל ב -55 מ"מ iodoacetamide, מערבולת, ספין. דגירה בטמפרטורת החדר בחושך במשך 45 דקות. supernatant מחק.
  10. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3, מערבולת, ספין, וזורקים supernatant.
  11. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 ב 50% אצטוניטריל, מערבולת, ספין. חזור על 3.9 ו 3.10.
  12. ייבש את קוביות concentrator ואקום. הוסף 25 μl כיתה רצף טריפסין שונה ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3, דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וזורקים את הפתרון עודף. לטבול קוביות ב 25 מ"מ NH 4 HCO 3 ללא טריפסין, דגירה לילה בשעה 37 ° C.
  13. בקצרה לסובב קוביות למטה ולהעביר את הפפטיד וכתוצאה נוסףct לצינור חדש. הוסף 30 μl של 5% חומצה פורמית ב אצטוניטריל 50% על קוביות, מערבולת למשך 30 דקות, ספין. מערבבים את supernatant עם תמצית. ייבש את התמציות פפטיד עם רכז ואקום לפחות מ 5 μl.
  14. שלח דגימות למתקן ליבה ספקטרומטריית מסה לניתוח LC-MS / MS. נתוני MS הניתוח, אשר ניתן להפיק מן תוכנות קוד פתוחות, כוללים בדרך כלל מספר הצטרפות עבור כל חלבון המזוהה, שכותרתו / יחסי תווית ומספר פפטידים ייחודיים המזוהים.

4. אימות מערביות סופג

הערה: המערבי סופג מומלץ לוודא תוצאות ספקטרומטריית מסה.

  1. בצע פרוטוקולים מערביים סופג סטנדרטיים להבטיח כמויות שווות של חלבון מכל קבוצה נטענת. השתמש נוגדנים נגד חלבונים בעלי עניין (A5 Annexin למשל, שרשרת B לקטט דהידרוגנאז) מזוהה על ידי MS. זיהוי מערבי סופג, יחד עם צפיפות לניתוחים, יכול לחזור ולאשר כי MS חלבון זיהוי וכימות נכונים.

5. ניתוח נתונים proteomic

הערה: הערכת איכות נתונים, מקדים נתונים, חישוב וקביעת מועמדי חלבון משמעותיים נעשית בנפרד לכל MS לשכפל. לאחר ניתוחים לעיל הושלמו, הנתונים שנותחו מן המשכפל מושווים ומשולבים 6, 20, 21.

  1. להעריך את איכות הנתונים MS.
    1. ראשית, log2 להפוך את SILAC-MS שכותרתו / יחסי תווית של חלבונים לכמת בתוכנית גיליון אלקטרוני.
    2. בשנת גרפים מדעיים תוכנה סטטיסטית, קבוצת היחסים לתוך 40-100 פחי יחס עלילת מספר יחסים לכל בן ליצור היסטוגרמה. התפלגות נורמלית של ההיסטוגרמה מציינת באיכות טובה של נתוני MS 6. האם פעולה זו עבור כל MS משכפל.
  2. כדי להגדיל את הביטחון ואת הדיוק של יחסי פפטיד MS, שקול להסיר חלבונים בעלי פחות משני פפטידים הניתנים לכימות.
  3. כדי לקבוע מועמדי חלבון למעלה ולמטה מוסדר באופן משמעותי, בצע את הפעולות הבאות כדי לחשב משמעות ספי 22.
    1. בשנת גרפים מדעיים תוכנה סטטיסטית, ליצור רגרסיה שאינו ליניארי או עקומה-התאמה לנתוני חלוקת תדר. צעד זה מניב ערכים שניתן להשתמש בהם כדי לחשב את ערכי הסף. חשבת את הערכים החתוכים כמו חציון ± 1.96 σ עבור גבולות סמך 95% או 2.56 σ עבור גבולות סמך 99%.
      הערה: פרטים ספציפיים חישוב הפסקות ניתן למצוא בכתובת Emmott et al. 22.
    2. בחר את מועמדי חלבון יחסיים אשר הם או גבוהים מ -1.96 (או 2.56) סטיות תקן מעל החציון (משמעותי ביטוי יתר) או נמוך יותר מאשר 1.96 (או 2.56) סטיות תקן מתחת לחציון (תת הביע באופן משמעותי).
  4. השווה את המשכפל של המועמדים המשמעותיים-שזוהו לעיל כדי להשיג עקביות. ודא כי הם עומדים בקריטריונים הבאים כדי לעבור שלב בחירה סופי זה: מועמדים חייבים להיות מזוהים באופן עקבי בכל המשכפל; ו משכפל של מועמד חייב להיות עקבי בכיוון של רגולציה שלהם (רצוי, לפחות 2 מתוך 3 משכפל של מועמד צריכים להיות או למעלה מוסדרים או למטה מוסדר).
  5. לסיים נתונים עבור מועמדים העונים על הקריטריונים הנ"ל על זיווג של קובצי 'משכפל שלהם.

6. אימות ביואינפורמטיקה ואפיון

הערה: מידע גנומי bioinformatic קיים מציע שפע של מידע כמעט על כל חלבון. כריית נתונים וניתוח ביואינפורמטיקה על מידע שיכולים לסייע בהשגת מידה רבה של תובנה הנכס והפונקציות של המועמדים המשמעותיים. proce זהss הוא בדרך כלל יש צורך לתכנן את הניסויים רטוב-מעבדה במורד הזרם הנכון.

  1. שימוש במספרי הצטרפות GenBank שלהם או מזהי UniProt, חיפוש המועמדים מול מסדי נתוני exosome נוכחיים (Exocarta 23, Evpedia 24) כדי לוודא את החלבונים המועמדים נמצאו בעבר exosome. צעד זה מוסיף שכבה של ביטחון כי המועמדים הם אכן exosomes.
    1. http://www.exocarta.org/ Access, לחץ על "שאילתה" וקלט גם במספר גנים או חלבונים שם / ההצטרפות. דף סיכום יופיע ראיות exosome יוצגו, ובלבד אם יש.
  2. חיפוש המועמדים כנגד HIV-1 ואת מסד אינטראקציה חלבון אנושי 25. לחלופין, חפש מסדי נתונים הספציפיים שיכול לספק מידע על האינטראקציה של החלבונים המועמדים ואת תנאי הבדיקה.
    1. לגשת אל מסד הנתונים ב- www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVיחסי גומלין. על כניסת חלבון שם תחום ', הזן את מספרי הצטרפות שמות או המועמדים, ולחץ על חיפוש. תוצאות החיפוש יכולים לספק תובנה אינטראקציות בין HIV-1 והמועמדים חלבון, ולהציע איזה מבין המועמדים עלולה להיות באמת HIV-1 קשורים.
  3. מספרי היבוא GenBank הצטרפות או UniProt תעודות זהות של המועמדים לתוך תוכנת ניתוח GO (כגון FunRich, כלי ניתוח העשרה פונקציונלית 26) ולהפעיל את התוכנה.
    1. הורד את התוכנה ב http://www.funrich.org/. לאחר ההתקנה, פתח את התוכנה, תחת ניתוח העשרה, לחץ על "הוסף למערך הנתונים", ולהעלות את רשימת חלבון / גנים. לאחר מכן, בחר את סוג התרשים כדי להמחיש את ניתוח GO.
      הערה: GO תוצאות הניתוח יהיה דמיינו בצורה של תרשימי עוגה. פעולה זו מסייעת לנו לקבל תובנות עולמיים קשורים המועמדים בתחומי תהליכי ביולוגים (BP), רכיב סלולארי (CC), ותפקוד מולקולרי (MF).
  4. גישה דוד http://david.ncifcrf.gov/ 27, לחץ על "ביאור כלי פונקציונלי" באתר האינטרנט שלה. הזן את רשימת המועמדים, בחר "מזהה" של הגן כגון "UniProt ID", בחר "ג'ין רשימת" וחיפוש. תנאי GO המועשרים, p-הערכי, והפרמטרים נוספים ניתן למצוא על ידי לחיצה על "תוצאות סיכום ביאור" הדף תחת קטגורית "Gene_Ontology".
  5. כדי לחקור אינטראקציות פוטנציאל של המועמדים עם חלבונים אחרים, לשימוש באתר STRING נגיש בגלוי 28 להבהיר אינטראקציות חלבון-חלבון פוטנציאליים הביוכימיים אפשרית.
    הערה: GO ניתוח ביאור פונקציונלי (סעיף 6.3-6.4) יכולה גם להתבצע באמצעות תוכנת STRING האחרונה.
    1. לגשת אל מסד הנתונים ב- http://string-db.org/. הזן את המזהה או רצף חלבון לתוך הים המיועדתיבת earch ובחר המין הנכון לניתוח. לחץ על "חפש". התוצאות יתנו מידע משני עמותות ישירה (פיזית) ועקיפים (תפקודית). המשחקים הידועים בעשירייה הראשון עבור מועמד exosomal יוצגו צריך להיחשב לבחירת מועמד משמעותית.
      הערה: מידע רב הקשורים המועמדים ניתן לנתח באמצעות השלבים לעיל. המועמדים המשמעותיים ביותר עשויים להיבחר לניתוח מולקולרי ביוכימיים במורד זרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 א הוא תרשים זרימה המפרט את ההליך תיוג SILAC 21. על מנת לטהר את exosomes, הדגימות חייבות להיות סובבות למטה באמצעות צנטריפוגות. איור 1B מציגה את השלבים של טיהור exosome ידי ultracentrifugation סדר 21. לאחר מטוהרים, את exosomes כפופים ניתוח proteomic ניסיוני כמתואר בהליך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בשנת ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו הוכחנו את היישום של טכניקת SILAC כדי לחקור את ההשפעה של זיהום HIV-1 על proteome המארח exosomal. בתחילה, נגוע ו- HIV-1 תאים נגועים הם איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. Exosomes שכותרתו דיפרנציאלי אז הם מטוהרים לפני ביצוע מיצוי חלבון. לאחר מכן, ספקטרומטריית מסה כרומטוגרפיה-טנדם נוזלי מועסק לנתח את proteome exosomal. לבסוף, הנתונים ספקטרומטריית מסה כתוצאה וחלבונים מועמד פוטנציאלי חשופים סטטיסטי וביואינפורמטיקה מנתח לפני והניתוחים ביוכימיים במורד הזרם.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים לא הצהירו על ניגוד עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי תוספת ערה לאורך החיים / טאפטס / בראון וכפר, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, ו K24HD080539 כדי BR. עבודה זו נתמכה גם על ידי קרן המחקר פיילוט תוחלת חיים (# 701- 5857), רוד איילנד קרן למחקר רפואי גרנט (# 20,133,969), ו- NIH COBRE URI / קריווי פיילוט מענק מחקר (P20GM104317) כדי ML. אנו מודים ג'יימס Myall ו Vy דאנג לעזרה בהכנת כתב היד דמות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
קו תאים H9ATCCHTB-176
טריפן כחולתרמו פישר15250061
ערכת בדיקת MTTתרמו פישרV13154
סרום בקר עוברי בדיאליזה (FBS)תרמו פישר
SILAC – RPMI 1640Thermo Fisher89982גרסת DMEM (89983)
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 עבור SILACThermo Fisher88434
L-Lysine-2HCl, 13C6 עבור SILACThermo Fisher88431
HIV-1 NL4-3NIH AIDS Reagent Program2480
Alliance HIV-1 p24 ערכת אנטיגן ELISAPerkinElmerNEK050001KT
צנטריפוגה סופר מהירה מקוררתEppendorf22628045
אולטרה-צנטריפוגה מקוררתבקמן קולטר363118אמור להיות מסוגל להגיע ל-100,000 x
g 50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםתרמו פישר14-432-22
צינורות אולטרה-צנטריפוגהבקמן קולטר326823
SW 32 Ti רוטורבקמן קולטר369694
מאגר RIPAתרמו פישר89900
קוקטיילים מעכבי פרוטאזתרמו פישר  78430
תרמו-מיקסר  Eppendorf5384000020
ערכת בדיקת חלבון BCA תרמו פישר23250
ספקטרופוטומטרBiorad1702525
SDS PAGE ג'ל מכשירתרמו פישרEI0001
Novex 4-20% Tris-Glycine מיני ג'ליםNovexXV04200PK20
ג'ל מכתים מגיבSigma AldrichG1041
רצף כיתה שונה TrypsinPromegaV5111
רכז SpeedVacתרמו פישרSPD131DDA
נוגדן לנספח אנושי A5Abcamab14196
נוגדן לשרשרת B לקטט דהידרוגנאז אנושיAbcamab53292
תוכנה גרפים וסטטיסטיקהSystat סיגמאעלילה או פריזמה של GraphPad
חבילת תוכנות פרוטאומיקה כמותיתמכון מקס פלאנק לביוכימיהMaxquant 
תוכנה ובסיסי נתוניםספקיםעיין בטקסט הראשי לפרטים
ערכת כימות חלבון 26400044 שונים

מקורות

  1. Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).
  2. Schorey, J. S., Bhatnagar, S. Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology. Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).
  3. Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
  4. Booth, A. M., et al. Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane. J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).
  5. Van Engelenburg, S. B., et al. Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits. Science. 343 (6171), 653-656 (2014).
  6. Li, M., et al. Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells. Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).
  7. Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  8. Ross, P. L., et al. Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  9. Anderson, L., Hunter, C. L. Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins. Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).
  10. Ong, S. E., Mann, M. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics. Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).
  11. Strober, W. Current Protocols in Immunology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  12. Verma, A., et al. Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis. J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).
  13. Cepko, C., Pear, W. Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).
  14. Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus. J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).
  15. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).
  16. Olson, B. J. S. C., Markwell, J. Current Protocols in Protein Science. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  17. Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics. J Proteom. 90, 96-106 (2013).
  18. Soldi, M., Bonaldi, T. The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin. J Vis Exp. (86), (2014).
  19. Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry. J Vis Exp. (85), (2014).
  20. Li, M., et al. Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication. J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).
  21. Li, M., Ramratnam, B. Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells. Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).
  22. Emmott, E., Goodfellow, I. Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics. J Vis Exp. (89), (2014).
  23. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  24. Kim, D. K., et al. EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research. Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).
  25. Fu, W., et al. Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI. Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).
  26. Pathan, M., et al. FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool. Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).
  27. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  28. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored. Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).
  29. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
  30. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).
  31. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  32. Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants. J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).
  33. Chertova, E., et al. Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages. J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).
  34. Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview. Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SILACHIV 1LC MS MSSDS PAGEGOSTRING

מאמרים קשורים