Mass היסטולוגיה לכמת מוחיים ב<em&gt; תסיסנית</em

סיכום

תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.

תקציר

מחלות ניווניות מתקדמות כמו מחלת אלצהיימר (AD) או מחלת פרקינסון (PD) מהוות איום הולך וגובר על בריאות אדם ברחבי העולם. למרות מודלים יונקים סיפקו תובנות חשובות המנגנונים של פתוגניות, את המורכבות של מערכות יונקים יחד עם העלויות הגבוהות שלהם הם מגבילים את השימוש בהם. לכן, תסיסנית פשוט אך ומבוססת מודל המערכת מספקת אלטרנטיבה לחקירת מסלולים מולקולריים המושפעות במחלות אלה. מלבד גירעונות התנהגותי, מחלות ניווניות המאופיינות פנוטיפים היסטולוגית כגון מוות עצב axonopathy. כדי לכמת ניוון עצבי ולקבוע כיצד הוא מושפע מגורמים גנטיים וסביבתיים, אנו משתמשים בגישה היסטולוגית המבוססת על מדידת vacuoles במוחות הזבוב הבוגר. כדי למזער את ההשפעות של טעות שיטתית ולהשוות חלקים ישירות מלא expזבובים erimental כהכנה אחד, אנו משתמשים בשיטת "צווארון" עבור חלקים פרפין. מוחייה אז נבחן על ידי מדידת הגודל ו / או מספר vacuoles שהתפתח במוח הזבוב. זה יכול להיעשות גם על ידי התמקדות באזור מסוים של עניין או על ידי ניתוח כל המוח על ידי קבלת קטעים סדרו כי היקף הראש המלא. לכן, שיטה זו מאפשרת למדוד לא רק ניוון חמור, אלא גם יחסית פנוטיפים קל כי ניתנים לזיהוי רק בעוד כמה סעיפים, כפי שקורה במהלך הזדקנות נורמלית.

מבוא

עם העלייה בתוחלת החיים, מחלות ניווניות כמו אלצהיימר או פרקינסון הפכו איום בריאותי הגובר באוכלוסיה הכללית. על פי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, 115 מיליון אנשים ברחבי העולם הם חזו להיות מושפעים דמנציה בשנת 2050. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בזיהוי גנים וגורמי סיכון מעורבים לפחות חלק ממחלות אלה, עבור רבים מהם, נכס הבסיס מנגנונים מולקולריים עדיין אינם ידועים או לא הבין היטב.

אורגניזמים מודל חסרי חוליות פשוטות כמו elegans Caenorhabditis ו תסיסנית מציעים מגוון רחב של יתרונות הניסיונות כדי לחקור את המנגנונים של מחלות ניווניות, כוללים מחזור חיים קצר, מספר רב של צאצאים, ואת הזמינות של ומבוססת ולפעמים ייחודי שיטות גנטיות ומולקולריות ^{1 -12.} יתר על כן, אורגניזמים אלה ניתנים משוחדיםמסכי אינטראקציה שיכול לזהות גורמי תורמי מחלות אלה על ידי ההשפעות המחמירות או ממתן שלהם על פנוטיפים ניווניות.

ניתוח אינטראקציות גנטיות כאלה והערכת השפעות ההזדקנות דורש פרוטוקולים כמותיים לזהות ניוון מוחיים, למדוד חומרתה. הערכה זו יכולה להיעשות בקלות יחסית כאשר מודדים היבטים התנהגותיים תסיסנית, כגון למידת חוש ריח, geotaxis השלילי, או מהר phototaxis, המספקים ערך ביצועים מספרי ^13-21. כמו כן ניתן לקבוע את ההשפעות על הישרדות עצבית על ידי ספירת תאי עצב. עם זאת, זה אפשרי רק כאשר התמקדות אוכלוסייה מסוימת כי הוא שקל לזהות, כמו נוירונים דופאמינרגיים המושפעות במחלת פרקינסון, וגם אז, והתוצאות היו במחלוקת ^22-24.

הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בשיטת הצווארון לבצע קטעי סדר פרפין, שיטהאשר פותחה במקור על ידי הייזנברג Bohl, שהשתמשו בו כדי לבודד מוטנטים המוח האנטומי תסיסנית ^25. השימוש בשיטת הצווארון מכן הותאם, לרבות cryosections, חלקי vibratome, וחתכי פלסטיק ^26-28. כאן, זוהי שיטה המופעלת להשיג חלקי סדרה של ראש הזבוב כולו, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש כדי למדוד את vacuoles המתפתח זבובים עם פנוטיפים ניווניות ^16,21,29-32. מדידות אלה ניתן לעשות זאת באזורים ספציפיים במוח או יכולות לכסות את כל המוח; הגישה השנייה מאפשרת לזהות פנוטיפים ניווניות אפילו חלש, כפי שנצפה במהלך ההזדקנות. לבסוף, בעת שימוש הצווארונים, עד 20 זבובים ניתן לעבד כהכנה אחד, וזה לא רק פחות זמן רב, אלא גם מאפשר לניתוח מלא זבובים הניסיונות באותה ההכנה, מזעור חפצים בשל שינויים קלים ההכנה.

פרוטוקול

1. תיקון הראש על כלב והטבעת פרפין

הערה: כל אחד מהשלבים בתהליך הקיבוע צריך להיעשות במנדף. Methylbenzoate, ואילו לא המהווים סיכון בריאותי, יש שהריח מן המעלה הראשונה, יכול להיות מכריע אם לא מטופלים במנדף.

1. לפני הרדמה זבובים, לפצות 50 מ"ל של תמיסת Carnoy על ידי הוספת 15 מ"ל של כלורופורם 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 30 מ"ל של 99% אתנול (לא לערבב את כלורופורם וחומצה אצטית). יוצקים אותו במיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת crystalizing, על מנת להבטיח כי צווארונים יכול להניח שטוח מכוסים לחלוטין על ידי פתרון.
2. להרדים את הזבובים עם CO ₂ או אתר.
3. זבובי נושא (עד 20 עם רוב הצווארונים) בצווארם ​​לתוך הצווארונים באמצעות מלקחיים. זכור כדי ליישר את כל הראשים באותו הכיוון, כפי שניתן לראות באיור 1 א, ו להיות עדין כדי לוודא ששום הנזק עולה על הראש או העיניים.
4. כלול זבובי oculis סינוס (חיצים, איור 1 א) על עמדות אקראיות כך שההסדר של הזבובים ניתן לזהות בקלות בסעיפים. בנוסף, אם הזבובים הניסיונות יש צבע עיניים בהיר או לבן, חוט כמה זבובים עם עיניים אדומות, כגון סוג בר, ביניהם כדי להבטיח פיגמנט מספיק נוכחת להכתים את השקופית. רשמו את סדר הזבובים על גיליון פרוטוקול יחד עם מספר צווארון אם משתמשים בכמות גדולה ממנת צווארון אחד.
5. לאחר צווארון כבר סיימתי, למקם אותו פתרון Carnoy המוכן תמורת 3.5 - 4 h.
6. Dump את הפתרון Carnoy לתוך הגליל לרשות המתאימה ולהתחיל שוטף אתנול. ודא לשפוך לאט כדי לא להפריע את המיקום של הצווארונים בתוך המכל.
7. שטוף את הצווארונים למשך 30 דקות באתנול 99% פעמים.
8. שטפו את צווארונים באתנול 100% במשך 1 שעה. הקפד להחליף את הכביסות בזמן כדי למנוע overdehydration.
9. שים את צווארוני methylbenzoateO / N ב RT. חותם את המיכל עם parafilm כדי למנוע אידוי של methylbenzoate.
10. יוצק את methylbenozate לתוך המכל הפנוי הנאה במנדף. להוסיף תערובת בעבר הכנה של 1: 1 נקודת התכה נמוכה (56 - 57 ° C) פרפין שעווה methylbenzoate. מנקודה זו ואילך, הצווארונים צריכים להישמר באינקובטור ב 65 מעלות צלזיוס כדי לוודא כי פרפין אינו להקשיח.
11. יוצקים את תערובת methylbenozate פרפין לתוך המכל הפנוי הנכון, ויוצקי פראפין טהור מותך, שמור על 65 מעלות צלזיוס, על הצווארונים.
12. שנה את פרפין לאחר 30 דקות וחזרו לפחות 5 פעמים זה. לפחות 6 - 8 שוטף צריכה להתבצע.
13. לאחר הכביסות הושלמו, למקם את הצווארונים לתוך מגש קוביות קרח גומי עם חריצים בערך בגודל של הצווארונים. יוצקים פרפין מותך מעליהם עד מכוסה לחלוטין ולאפשר לו להקשיח O / N (מנסה למנוע בועות אוויר).
14. הסר את אבני פרפין contaiנינג הקולרים ממגש קוביית קרח. הפרד את בלוק פרפין מן הצווארון באמצעות סכין גילוח, בעדינות לנתק איתם את הצווארון. הראשי יהיה בבלוק פרפין ואילו הגופים יישארו הצווארון. אבני יכולים להישמר בטמפרטורת החדר.
15. כדי לנקות את צווארונים, להשרות אותם סוכן deparafinization על 65 מעלות צלזיוס להסיר את פרפין, נקי עם קרצוף אור, ולשטוף באתנול לפני שימוש חוזר.

2. חתך השמה

1. לחמם צלחת חימום עד 50 מעלות צלזיוס. מניח את מחזיקי אובייקט (או בלוקי הרכבת מתכת) ו סכיני גילוח על הצלחת ולתת להם להתחמם.
2. בהתאם לכיוון הרצוי עבור חתך, לצרף את בלוק פרפין או עם הראשים כלפי הצד (סעיפים אופקיים) או כלפי מעלה (סעיפים חזיתית) כדי לחסום הרכבה מחוממת (בקצרה המסת הבלוק בצד המגע). הסר את הבלוק מן צלחת החימום ולאפשר לו להתקרר במשך לפחות 10 מייליםn על מנת להבטיח כי פרפין הוא קשוח מספיק עבור הדפסה נאותה על לחסום את ההרכבה. שמור על השורה של הראשים מיושרים במקביל פני השטח של הגוש ככל האפשר כדי למנוע חלקים אחידים.
3. קח סכין גילוח וקוצץ את פרפין לנזול החוצה מהראשים לטוס כך שורה קטנה רק עם ראשי המוטבע נשארת (סכין הגילוח ניתן התחמם עבור זמירה קלה). ודא שלא לקצץ יותר מדי כך פרפין לא לשבור במהלך חתך (יותר זמירה יכול להיעשות במהלך חתך).
4. מניחים את גוש הרכבה לתוך מחזיק אובייקט של microtome ולהבטיח כי היישור של שורת ראשי מקביל ככל האפשר אל קצה הלהב.
5. כן שקופיות מיקרוסקופ על ידי מכסה אותם עם שכבה דקה של פתרון poly-L- ליזין (PLL) ולתת להם להתייבש במשך 5 דקות. מכסים אותם במים זמן קצר לפני השימוש.
6. חותכים 7 סעיפים מיקרומטר ולהעביר את סרט סעיפים לשקופית צף על פני המים.
   הערה: כדי להשיג את המוח כולו לחלקים אופקיים, אנו אוספים את הסרט מתוך כאשר מתחילים לחתוך לתוך העין עד הראש נחתך לחלוטין (חיתוך מן החוטם לתוך המוח). יותר משקופית אחת עשויה להיות נחוצה עבור כל הראש.
7. מניחים את השקף על צלחת חום על 37 מעלות צלזיוס ולאפשר סרט להרחיב בערך 1 דקות.
8. הסרה של עודפי מים (על ידי שפיכת אותו או באמצעות רקמות) ומייבשים את השקופיות O / N.
9. הסר את שעוות פרפין משקופית ידי צבת את השקופיות בצנצנת שקופיות מכתימות גבוהה, אנכית מלאה סוכן deparafinization (לגמרי מכסה את הסעיפים). בצע 3 שוטף של 30 דק '- 60 דקות כל אחד.
10. להסיר את השקופית מן לשטוף הסופי. מניחים 2 טיפות של התקשורת הטבעה לשקופית ולכסות אותו עם coverslip גדול.

3. לצלם וניתוח סעיפים

1. אפשר השקופיות המוכנות להתייבש במשך 1 - 2 ד. לאחר מכן בחן אותם על microsc הקרינהאופ תחת אור כחול.
2. השתמש בהגדלה נמוכה כדי לקבוע את הכיוון של זבובים כדי למצוא את האזור של עניין אם מתמקדים באזור מסוים.
   הערה: לקבלת זבובי SWS (ראה איור 2), אנו מוצאים את החלק המכיל השליך הגדול ולקחת תמונה (בדרך כלל 40X גדלה). כאשר מנתחים את המוח כולו (כמו באיור 3), אנו לגלול בין כל הקטעים מתוך ראש או לצלם את החלק עם פנוטיפ החמור ביותר או כל החלקים שמראים vacuoles.
3. לניתוח כפול סמיות, לקחת ותמונות מספר בלי לדעת את הגנוטיפ ולהקליט את מספר צווארון המיקום של הראש בשורה לזהות אותם מאוחר יותר.
4. לאחר התמונות ננקטו, ולנתח אותם באמצעות תוכנת הדמיה.
5. ספירת vacuoles לכל סעיף או לנפש. כדי למדוד את גודל vacuole, לפתוח את התמונות מתוך התוכנה ובחר את vacuoles עם מבחר מדיl. לקבוע את כמות הפיקסלים vacuoles שנבחר.
6. להמרת מיקרומטר ^2, לצלם תמונה של שקופית כיול מיקרומטר הבמה בהגדלה משמשת עבור רכישת תמונות. לקבוע את כמות הפיקסלים 100 מיקרומטר ² כדי לחשב את מקדם המרה.
7. המר את מספר הפיקסלים הכולל לתוך מיקרומטר ² על ידי חלוקת מספר הפיקסלים במקדם ההמרה מחושב בשלב לעיל.

תוצאות

באמצעות תוצאות השיטה המתוארת בסעיפים סדרתי יוכתמו הפיגמנט בעין ³³ המקיפים את ראש זבוב כולו. חלק זה מוצג באיור 1B, שבו קטעים מתוך ראש הפרט מוצגים מלמעלה למטה. הסעיפים מפני זבובים שונים נראים משמאל לימין בדוגמה זו. כדי להקל על ההתמצאות זיהוי של זבובים, זבוב חסר עיניים (oculis סינוס) מוכנס כסמן במיקום 3 (חץ, איור 1B).

דיון

השיטה המתוארת מספק אמצעי לכמת ניוון מוחיים במוח של דרוזופילה. בעוד שיטות אחרות, כמו לספור לסוג תא מסוים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ניווניות של מערכת העצבים, את היתרון של שיטה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם באופן כללי יותר. ספירת תאים דורשת כי תאים אלה יכולים להיות מזוהים באופן מהימן או באמצעות נוגדן ספציפי או הביטוי של סמן תא ספציפי, וזה לא תמיד זמין. יתר על כן, הוכח כי תוצאות שונות באופן דרמטי ניתן להשיג את השיטה ^24, ככל הנראה בשל תנאי המשמש תיוג לצורך זיהוי. ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
שם חברת הריאגנט/ציוד		מספר
צווארון	Genesee Scientific	TS 48-100	אנו משתמשים בצווארונים בהתאמה אישית העשויים מחתיכת מתכת אחת במקום שכבות כמו אלה של Genesee. תיאור כיצד להכין צווארונים ניתן למצוא בכתובת http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html
מגש קוביות קרח גומי להטמעה	חנות		ניתן להתאים את הגודל להתאמה על ידי הדבקה בקירות נוספים
צלחת התגבשות	חברת פישר סיינטיפיק	08-762-3
אתר	פישר סיינטיפיק חברה	E138-1
אתנול	דקון מעבדות בע"מ	2701
Choloroform	Fisher Scientific Company	C298-500
Glacial Acetic Acid	Fisher Scientific Company	A38-212
Methylbenzoate	Fisher Scientific Company	M205-500	ריח מובהק - לשימוש בקולטים אדים!
נקודת התכה נמוכה שעוות פרפין	Fisher Scientific Company	T565	הקפד לשמור על נמס נוסף ב 65 מעלות; C אמבט מים
Microtome	Leica Biosystems	Reichert Jung 2040 Autocut
מיקרוסקופ שקופיות	פישר סיינטיפיק חברה	12-550D
כיסוי מיקרוסקופ זכוכית	פישר סיינטיפיק קומפני	12-545-M
SafeClear	Fisher Scientific Company	314-629	שלושה מיכלים שונים לשטיפות
צנצנת מכתים אנכית עם כריכה	: טד פלה בע"מ	432-1
Permount	Fisher Scientific Company	SP15-500
תמיסת פולי-L-ליזין (PLL)	Sigma Life Science	P8290-500

קטלוגי ביתית