תסיסנית נעשה שימוש נרחב כמערכת מודל ללמוד ניווניות של מערכת העצבים. פרוטוקול זה מתאר שיטה שבאמצעותה ניוון, כפי שנקבע על ידי היווצרות vacuole במוח, ניתן לכמת. הוא גם מפחית תופעות עקב ההליך הניסיון על ידי עיבוד ובקרת חתך וזבובים הניסיונות כמו דגימה אחת.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
מחלות ניווניות מתקדמות כמו מחלת אלצהיימר (AD) או מחלת פרקינסון (PD) מהוות איום הולך וגובר על בריאות אדם ברחבי העולם. למרות מודלים יונקים סיפקו תובנות חשובות המנגנונים של פתוגניות, את המורכבות של מערכות יונקים יחד עם העלויות הגבוהות שלהם הם מגבילים את השימוש בהם. לכן, תסיסנית פשוט אך ומבוססת מודל המערכת מספקת אלטרנטיבה לחקירת מסלולים מולקולריים המושפעות במחלות אלה. מלבד גירעונות התנהגותי, מחלות ניווניות המאופיינות פנוטיפים היסטולוגית כגון מוות עצב axonopathy. כדי לכמת ניוון עצבי ולקבוע כיצד הוא מושפע מגורמים גנטיים וסביבתיים, אנו משתמשים בגישה היסטולוגית המבוססת על מדידת vacuoles במוחות הזבוב הבוגר. כדי למזער את ההשפעות של טעות שיטתית ולהשוות חלקים ישירות מלא expזבובים erimental כהכנה אחד, אנו משתמשים בשיטת "צווארון" עבור חלקים פרפין. מוחייה אז נבחן על ידי מדידת הגודל ו / או מספר vacuoles שהתפתח במוח הזבוב. זה יכול להיעשות גם על ידי התמקדות באזור מסוים של עניין או על ידי ניתוח כל המוח על ידי קבלת קטעים סדרו כי היקף הראש המלא. לכן, שיטה זו מאפשרת למדוד לא רק ניוון חמור, אלא גם יחסית פנוטיפים קל כי ניתנים לזיהוי רק בעוד כמה סעיפים, כפי שקורה במהלך הזדקנות נורמלית.
מבוא
עם העלייה בתוחלת החיים, מחלות ניווניות כמו אלצהיימר או פרקינסון הפכו איום בריאותי הגובר באוכלוסיה הכללית. על פי המכון הלאומי לבריאות בארה"ב, 115 מיליון אנשים ברחבי העולם הם חזו להיות מושפעים דמנציה בשנת 2050. למרות התקדמות משמעותית נעשתה בזיהוי גנים וגורמי סיכון מעורבים לפחות חלק ממחלות אלה, עבור רבים מהם, נכס הבסיס מנגנונים מולקולריים עדיין אינם ידועים או לא הבין היטב.
אורגניזמים מודל חסרי חוליות פשוטות כמו elegans Caenorhabditis ו תסיסנית מציעים מגוון רחב של יתרונות הניסיונות כדי לחקור את המנגנונים של מחלות ניווניות, כוללים מחזור חיים קצר, ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. תיקון הראש על כלב והטבעת פרפין
הערה: כל אחד מהשלבים בתהליך הקיבוע צריך להיעשות במנדף. Methylbenzoate, ואילו לא המהווים סיכון בריאותי, יש שהריח מן המעלה הראשונה, יכול להיות מכריע אם לא מטופלים במנדף.
- לפני הרדמה זבובים, לפצות 50 מ"ל של תמיסת Carnoy על ידי הוספת 15 מ"ל של כלורופורם 5 מ"ל של חומצה אצטית קרחונית 30 מ"ל של 99% אתנול (לא לערבב את כלורופורם וחומצה אצטית). יוצקים אותו במיכל זכוכית עם תחתית שטוחה, כגון צלחת crystalizing, על מנת להבטיח כי צווארונים יכול להניח שטוח מכוסים לחלוטין על ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
באמצעות תוצאות השיטה המתוארת בסעיפים סדרתי יוכתמו הפיגמנט בעין 33 המקיפים את ראש זבוב כולו. חלק זה מוצג באיור 1B, שבו קטעים מתוך ראש הפרט מוצגים מלמעלה למטה. הסעיפים מפני זבובים שונים נראים משמאל לימין בדוגמה זו. כדי להקל על ההתמצאות זיהוי של זבובים, זבוב חסר עיניים (oculis סינוס) מוכנס כסמן במיקום 3 (חץ, איור 1B).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטה המתוארת מספק אמצעי לכמת ניוון מוחיים במוח של דרוזופילה. בעוד שיטות אחרות, כמו לספור לסוג תא מסוים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות ניווניות של מערכת העצבים, את היתרון של שיטה זו הוא כי זה יכול להיות מיושם באופן כללי יותר. ספירת תאים דורשת כי תאים אלה יכולים להיות מזוהים באופן מהימן או באמצעות נוגדן ספציפי או הביטוי של סמן תא ספציפי, וזה לא תמיד זמין. יתר על כן, הוכח כי תוצאות שונות באופן דרמטי ניתן להשיג את השיטה 24, ככל הנראה בשל תנאי המשמש תיוג לצורך זיהוי. .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
החוקרים אין לי מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים ל-D.K. מקרן המחקר הרפואי של אורגון ומ-NIH/NINDS (NS047663). E.S. נתמך על ידי מענק הכשרה מה-NIH (T32AG023477).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם חברת הריאגנט/ציוד | מספר | ||
| צווארון | Genesee Scientific | TS 48-100 | אנו משתמשים בצווארונים בהתאמה אישית העשויים מחתיכת מתכת אחת במקום שכבות כמו אלה של Genesee. תיאור כיצד להכין צווארונים ניתן למצוא בכתובת http://flybrain.neurobio.arizona.edu/Flybrain/html/atlas/fluorescent/index.html |
| מגש קוביות קרח גומי להטמעה | חנות | ניתן להתאים את הגודל להתאמה על ידי הדבקה בקירות נוספים | |
| צלחת התגבשות | חברת פישר סיינטיפיק | 08-762-3 | |
| אתר | פישר סיינטיפיק חברה | E138-1 | |
| אתנול | דקון מעבדות בע"מ | 2701 | |
| Choloroform | Fisher Scientific Company | C298-500 | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher Scientific Company | A38-212 | |
| Methylbenzoate | Fisher Scientific Company | M205-500 | ריח מובהק - לשימוש בקולטים אדים! |
| נקודת התכה נמוכה שעוות פרפין | Fisher Scientific Company | T565 | הקפד לשמור על נמס נוסף ב 65 מעלות; C אמבט מים |
| Microtome | Leica Biosystems | Reichert Jung 2040 Autocut | |
| מיקרוסקופ שקופיות | פישר סיינטיפיק חברה | 12-550D | |
| כיסוי מיקרוסקופ זכוכית | פישר סיינטיפיק קומפני | 12-545-M | |
| SafeClear | Fisher Scientific Company | 314-629 | שלושה מיכלים שונים לשטיפות |
| צנצנת מכתים אנכית עם כריכה | : טד פלה בע"מ | 432-1 | |
| Permount | Fisher Scientific Company | SP15-500 | |
| תמיסת פולי-L-ליזין (PLL) | Sigma Life Science | P8290-500 |
מקורות
- Alexander, A. G., Marfil, V., Li, C. Use of Caenorhabditis elegans as a model to study Alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases. Front Genet. 5, 279(2014).
- Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
