הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

הסרת biofilm באמצעות אירוסולים פחמן דו-חמצני ללא חנקן טהר

6.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54827

⸱

6 בנובמבר 2016

 , 
1School of Mechanical and Nuclear Engineering, Ulsan National Institute of Science and Technology (UNIST)

במאמר זה

סיכום

ניתן להסיר ביופילמים על משטחים ביעילות ובמהירות על ידי שימוש בסילון תקופתי של אירוסולים של פחמן דו חמצני ללא טיהור חנקן.

תקציר

ביופילמים יכולים לגרום לחששות רציניים ביישומים רבים. לא רק שהם יכולים לגרום להפסדים כלכליים, אלא שהם גם יכולים להוות סכנה לבריאות הציבור. לכן, רצוי מאוד להסיר ביופילמים ממשטחים. מחקרים רבים על ניקוי תרסיס CO2 השתמשו בטיהורי חנקן כדי להגביר את יעילות הסרת הביופילם על ידי הפחתת עיבוי הלחות שנוצר במהלך הניקוי. עם זאת, במחקר זה, נעשה שימוש בסילונים תקופתיים של אירוסולים CO2 ללא טיהור חנקן להסרת ביופילמים של Pseudomonas putida ממשטחי נירוסטה מלוטשים. אירוסולי CO2 הם תערובות של CO2 מוצק וגזי ונוצרים כאשר גז CO2 בלחץ גבוה מורחב באופן אדיאבטי דרך זרבובית. אירוסולים מהירים אלה הוחלו על ביופילם שגדל במשך 24 שעות. יעילות ההסרה נעה בין 90.36% ל-98.29% והוערכה על ידי מדידת עוצמת הקרינה של הביופילם מכיוון שזמן הטיפול נע בין 16 שניות ל-88 שניות. ביצענו גם ניסויים כדי להשוות את יעילות ההסרה עם ובלי טיהור חנקן; יעילות הסרת הביופילם שנמדדה לא הייתה שונה באופן משמעותי זו מזו (T-Test, p > 0.55). לכן, ניתן להשתמש בטכניקה זו לניקוי משטחים מזוהמים ביולוגית שונים תוך דקה אחת.

מבוא

ביופילמים הם מבני קהילת חיידקים מורכבים שבהם תאי חיידקים משובצים בתוך מטריצות המיוצרות בעצמם של חומרים פולימריים חוץ-תאיים, מוחזקים יחד ומוגנים מפני הסביבה החיצונית. ביופילמים יכולים להוות סיכון לבריאות הציבור ולגרום להפסדים כלכליים מכיוון שהם יכולים להיווצר על משטחים שונים, כולל חומרים ומכשירים של שתלים רפואיים, ציוד לעיבוד מזון ומחליפי חום. למעשה, ביופילמים נמצאו קשורים ל-65% מכלל המחלות הזיהומיות החיידקיות בבני אדם, על פי המרכזים לבקרת מחלות ומניעתן1.

אוטוקלאבים וחומרי חיטוי כגון כלור שימשו בדרך כלל לנטרול ביופילמים. עם זאת, השימוש בחיטוי מוגבל למשטחים שאינם יכולים לעמוד בקיטור בטמפרטורה גבוהה ואינם מונחים בחיטוי. חומרי חיטוי אינם מתאימים למשטחים הרגישים לטיפול כימי או המועדים לאיסוף מוצרי חמצון רעילים2. נוסף על כך, לא רק שיש לנטרל את הביופילם, אלא גם להסיר אותו על מנת למנוע היצמדות של תאים חדשים אל פני השטח, ובכך ליצור ביופילםחדש 3. עם זאת, קשה להסיר ביופילמים בשיטות המבוססות על גזירה של נוזל צמיג מכיוון שמהירות הזרימה ליד פני השטח היא כמעט אפסית וכוח הגזירה בדרך כלל אינו יכול להתגבר על כוחות ההדבקה של חומרים בגודל מיקרון ותת-מיקרון. יתר על כן, מטריצת הביופילם ידועה כמחסום פיזיקלי וכימי1.

טכניקות פיזיקליות ומכניות רבות פותחו להסרת ביופילמים ממשטחים, כולל רטט קולי1, זרמים חשמליים4, קרינת לייזר5 ותרסיסי מים בלחץ גבוה6. לכל טכניקה יתרונות וחסרונות משלה. ניתן להשתמש ברטט קולי וזרם חשמלי כדי לשלוט בהיווצרות ביופילם; עם זאת, הם דורשים תצורה מסוימת ומשטחים מוליכים, בהתאמה, הדורשים מתח גזירה נוסף1, 4. ניתן ליישם הקרנת לייזר על שטח מוגבל ועל משטחים קשים; עם זאת, כמה תאים חיים ומתים נשארים על פני השטח5. תרסיסי מים בלחץ גבוה מסירים ביעילות ביופילמים; עם זאת, המומנטום הגבוה שלהם עלול לגרום נזק למצעים רכים6.

הסרת ביופילם באמצעות אירוסולים של CO2 הוצעה בעבר. הוא הראה תוצאות מבטיחות, עם יעילות הסרה גבוהה תוך זמן קצר7-11. אירוסולי CO2 נוצרים על ידי התפשטות אדיאבטית של גז CO2 בלחץ גבוה דרך זרבובית, והם מוחלים על המשטחים המזוהמים בביופילם. טכניקת ניקוי זו מנצלת את העברת המומנטום של חלקיקי CO2 מוצקים ואת פעולת הממס של נוזלי CO2 המומסים, ואחריה כוח הגזירה האווירודינמי של גז CO2 12. בהשוואה לסילוני גז N2 בלחץ גבוה, סילוני אירוסול CO2 באותו לחץ קיפאון יעילים הרבה יותר בהסרת ביופילמים של E. coli 7. יתר על כן, למרות שהמומנטום של ה-CO2 המוצק המועבר לחיידקים גבוה במידה ניכרת, המומנטום של סילון התרסיס הכולל המופעל על פני השטח המוצקים נמוך משמעותית מזה של סילוני מים. לכן, ניקוי ללא נזקים אפשרי באמצעות טכניקת תרסיס CO2 זו.

בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בסילונים תקופתיים של אירוסולים CO2 ללא טיהור חנקן להסרת ביופילמים של Pseudomonas putida ממשטח נירוסטה מלוטש. למעשה, טיהורי חנקן שימשו במחקרי תרסיס CO2 רבים כדי להגביר את יעילות ההסרה על ידי הפחתת עיבוי הלחות שנוצר במהלך הניקוי, למרות שחימום עם פלטה חמה או מנורות אינפרא אדום ושימוש בקופסאות יבשות אומצו גם הם12. היווצרות הביופילם של פני השטח ונהלי הניקוי המותאמים מתוארים להלן. יעילות ההסרה הוערכה על ידי מדידת עוצמת הקרינה של הביופילם על פני השטח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת השטח ליצירת biofilm

  1. חותכים 1 מ"מ בעובי 304 צלחות נירוסטה לתוך שבבים (10 × 10 מ"מ 2) עם חותך מכני.
  2. בצע ניקוי קולי של שבבי אצטון, מתנול, ו ללא יונים (DI) ברצף מים במשך 10 דקות כל אחד. השתמש מיכל ממס עמיד, עשוי חומרים כגון זכוכית, להסיר זיהום אורגני.
  3. שוטף את השבב עם מים זורמים DI במשך 3-5 שניות.
  4. ייבש את השבב באמצעות זרימת גז N 2 למשך 3-5 שניות.

2. הכנת תרבית חיידקים

  1. קח פ putida KT2440 (בתנאי בחביבות על ידי פרופ 'סונג קוק Lee, UNIST, דרום קוריאה) מניות מאוחסנים -80 ° C עמוק במקפיא.
  2. להפשיר בטמפרטורת החדר לאחר 1 דקות, ואת השכבה העליונה של פתרון המניות קפוא הופך לבוץ. לטבול לולאה לתוך השכבה המומסת של פתרון המניות.
  3. השתמש לולאה זה פס החיידקים על גבי לוריאצלחת -Bertani (LB) המכילה אגר 1.5%.
  4. דגירה את הצלחת לילה ב C 30 ° לגדל את מושבות חיידקים.
  5. פיק מושבה אחת מהצלחת באמצעות לולאה טריה.
  6. לחסן 10 מ"ל של מרק LB צינור חרוטי 50 מ"ל עם לולאה המכילה את מושבת חיידקים אחת.
  7. דגירה מרק חממת רעד במשך 16 שעות ב 30 מעלות צלזיוס, 160 סל"ד.

3. היווצרות biofilm על פני השטח

  1. תרים אחד של השבבי המוכן עם פינצטה לטבול אותם 70% אתנול 5 פעמים במשך 1-2 שניות כל אחד, כדי לעקר את פני השטח של כל שבב. ודא שבב מוחזק עם פינצטה במהלך הטבילה.
  2. טובלים כל שבב במים DI autoclaved וב ברצף מרק LB, 5 פעמים במשך 1-2 שניות כל אחד, כדי להסיר אתנול הנותרים.
  3. מניחים שבבי אלה צלחות תרבות 6 היטב עם 2 צ'יפים 5 מ"ל מרק LB לכל טוב.
  4. לדלל את תרבית החיידקים עד הריכוז בדרגים מרק LB8 × 10 8 תאים / מ"ל (צפיפות אופטית באורך גל 600 ננומטר: ~ 0.8).
  5. לחסן כל טוב עם 50 μl של תרבות חיידקים המדוללת.
  6. דגירת הצלחות ב 30 מעלות צלזיוס ללא רעד במשך 24 שעות עבור היווצרות של biofilms.

4. ניקוי תרסיס CO 2

  1. טובלים את שבבי-נוצר ביופילם ב 10 מ"מ אמוניום אצטט חיץ (נדיפים) 5 פעמים להסיר מחוברת באופן רופף וחיידקים planktonic.
  2. לייבש את השבבים הללו בתוך ארון בטיחות ביולוגית, שבו האוויר זורם במתינות.
  3. מיד לאחר הייבוש, למקם שבב על המקום הטעינה, המהווה 20 מ"מ מלוע CO 2 לאורך ציר של סילון. הטה את ציר הסילון לזווית 40 מעלות.
  4. הגדר את לחצי הקיפאון של CO 2 ו- N 2 גז 5.3 מגפ"ס ו -0.7 מגפ"ס, בהתאמה, באמצעות רגולטורים בלחץ גז.
  5. החל הסילון אירוסול על החלק המרכזי של השבב. אירוסולים לבן כולל CO מוצק 2 צריךלהיות גלוי. הפעל "על" שסתום סולנואיד עבור CO 2 למשך 5 שניות ולאחר מכן הפעל אותו "off" במשך 3 שניות (מחזור: סעיף 8) באמצעות מעת לעת מתג נשלט באופן ידני. אם טיהור חנקן צריכה לשמש, להדליק את שסתום סולנואיד עבור אספקה רציפה של N 2.
  6. פנקו את שבבי עם CO 2 אירוסולים במשך 16, 40, ו -88 שניות עם ובלי הטיהורים חנקן. שמור שבבי ללא טיפול שולטת שלילית.

ניתוח 5. עבור יעילות הסרה

  1. הכן 1 כתם חומצה פלואורסצנטי ירוק מיקרומטר גרעין (גל עירור / פליטה: 480/500 ננומטר) במים DI להכתים תאים חיידקיים בשלט וצ'יפס שטופלו בתרסיס.
  2. מניחים את שבבי בתמיסה מכתים.
  3. דגירה שבבי באינקובטור ללא אור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. לאחר הדגירה, לשטוף בעדינות את השבבים עם מים זורמים DI להסיר צבע ניאון מוגזם.
  5. ייבש את wi השבביזרימת N 2 גז ה.
  6. קח קרינת תמונות מיקרוסקופיות של 5 שדות אקראיים של תצוגה (321 × 240 מיקרומטר 2) עבור כל שבב באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence, עדשה 40X אובייקטיבית, מצלמת CCD.
  7. השג את עוצמת הקרינה עבור כל תמונה באמצעות תוכנת עיבוד תמונה כגון ImageJ. ב ImageJ, השתמש בפונקצית "רקע פחת" בתפריט "התהליך", ובחר "צפיפות משולבת" בחלון "מדידות גדר" בתפריט "לנתח". האם "המדידה" בתפריט "נתח" כדי להשיג את עוצמת הקרינה.
  8. חשבתי את היעילות ביופילם ההסרה פי הנוסחא הבאה: 100% × (אני שבבים מלאי - אני שבבי מטופלים) / (אני שבבים שליטים), שבו אני נמצא את עוצמת הקרינה חושב.
  9. להשיג את הממוצע ויעילות הסרה וסטיות תקן. השתמש ב4 שבבי לפחות עבור כל מקרה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אירוסולים 2 CO שימשו כדי להסיר את פ putida Biofilms מ SUS304 משטחים (איור 1). רוב המשטחים היו מכוסות עם ביופילם לאחר 24 שעות של צמיחה. רוב ביופילם הוסר באמצעות CO 2 אירוסולים (איור 2). כצפוי, איור 3 מראה על עלייה יעילה ביופילם הסרה כזמן טיפול אירוסול CO 2 המוגבר. בפעם טיפול של 88 שניות, ליעילות ההסרה היה נחוש בדעתו להיות גבוה ככל 97.74% ו 98.29% עם ובלי טיהור חנקן, בהתאמה. טמפרטורת האוויר ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בעבר, ערכנו מחקרי אופטימיזציה על לחץ גז CO2 , זווית סילון ומרחק למשטח המוצק בניקוי תרסיס CO2 7. בניגוד למחקרים הקודמים שלנו, במחקר הנוכחי, טיהור חנקן לא נכלל בתרסיס (איור 1). יתר על כן, נירוסטה 304 שימשה בפרוטוקול זה, מכיוון שהיא אחת מפלדות הנירוסטה הנפוצות ביותר ונמצאת בשימוש נרחב בתעשיית המזון. המשטח המלוטש מועיל לניתוח פלואורסצנטי בגלל אורך מוקד אחיד ופיזור אור מופחת. מין החיידקים P. putida נפוץ גם בתחום מחקר הביופילם. עוצמת הקרינה שימשה לכימות כמות הביופילם ה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

מחקר זה נתמך על ידי תוכנית המחקר המדעי הבסיסי באמצעות קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF), במימון משרד המדע, התקשוב והתכנון העתידי (# 2015R1A2A2A01006446).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
304 נירוסטהSteelni
(דרום קוריאה)		מלוטשים וחתוכים לקוביות
מנקה אולטרסאונדBranson
(ארה"ב)		5510E-DTH
Luria-Bertani (LB)Becton, Dickinson and Company
(ארה"ב)		244620500 גרם
AgarBecton, Dickinson and Company
(ארה"ב)		214010500 גרם
6 בארות לוחית תרבותSPL Life Sciences
(דרום קוריאה)		32006
מאגר אמוניום אצטטSigma-Aldrich
(ארה"ב)		66740410 מ"מ
יחידת גז כפולהApplied Surface Technologies
(ארה"ב)		K6-10DGזרבובית אחת עבור CO2 גז
ו-8 חרירים עבור גז N2 גז
SYTO9Thermo Fissher Scientific
(ארה"ב)		InvitrogenExcitaion: 480 ננומטר
פליטה: 500 ננומטר
מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי Nikon (יפן)Eclipse 80i
40XNikon
(יפן)		Plan FluorNA: מצלמת CCD 0.75
nbsp;פוטומטריה
(ארה"ב)		מגניב SNAP HQ2מונוכרום
עדשת אובייקטיבית &

מקורות

  1. Jain, A., Gupta, Y., Agrawal, R., Khare, P., Jain, S. K. Biofilms - A microbial life perspective: A critical review. Crit. Rev. Ther. Drug. 24 (5), 393-443 (2007).
  2. Bott, T. R. Biofouling control with ultrasound. Heat Transfer Eng. 21 (3), 43-49 (2000).
  3. Meyer, B. Approaches to prevention, removal and killing of biofilms. Int. Biodeterior. Biodegradation. 51 (4), 249-253 (2003).
  4. Hong, S. H., et al. Effect of electric currents on bacterial detachment and inactivation. Biotechnol. Bioeng. 100 (2), 379-386 (2008).
  5. Nandakumar, K., Obika, H., Utsumi, A., Ooie, T., Yano, T. In vitro laser ablation of laboratory developed biofilms using an Nd:YAG laser of 532 nm wavelength. Biotechnol. Bioeng. 86 (7), 729-736 (2004).
  6. Gibson, H., Taylor, J. H., Hall, K. E., Holah, J. T. Effectiveness of cleaning techniques used in the food industry in terms of the removal of bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol. 87 (1), 41-48 (1999).
  7. Kang, M. Y., Jeong, H. W., Kim, J., Lee, J. W., Jang, J. Removal of biofilms using carbon dioxide aerosols. J. Aerosol Sci. 41 (11), 1044-1051 (2010).
  8. Cha, M., Hong, S., Kang, M. Y., Lee, J. W., Jang, J. Gas-phase removal of biofilms from various surfaces using carbon dioxide aerosols. Biofouling. 28 (7), 681-686 (2012).
  9. Dwidar, M., Hong, S., Cha, M., Jang, J., Mitchell, R. J. Combined application of bacterial predation and carbon dioxide aerosols to effectively remove biofilms. Biofouling. 28 (7), 671-680 (2012).
  10. Cha, M., Hong, S., Lee, S. Y., Jang, J. Removal of different-age biofilms using carbon dioxide aerosols. Biotechnol. Bioprocess Eng. 19 (3), 503-509 (2014).
  11. Singh, R., Monnappa, A. K., Hong, S., Mitchell, R. J., Jang, J. Effects of Carbon Dioxide Aerosols on the Viability of Escherichia coli during Biofilm Dispersal. Sci. Rep. 5, 13766(2015).
  12. Sherman, R. Carbon Dioxide Snow Cleaning. Particul. Sci.Technol. 25 (1), 37-57 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Pseudomonas putidaמשטחי פלדת אל-חלדמיקרוסקופיית פלואורסצנציהזמן טיפול בארוסוליעילות הסרהניקוי תלת-שלבימשטחים מזוהמים ביולוגית
הסרת biofilm באמצעות אירוסולים פחמן דו-חמצני ללא חנקן טהר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.