מאמר שיטה

עורקי חלוף דגם ספיג תיכון שיתוק של שבץ ילודים אצל חולדות P10

10.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/54830

⸱

21 באפריל 2017

 , 
1Department of Pediatrics, University of California, San Francisco

במאמר זה

סיכום

שבץ יילודים הוא גורם משמעותי לפגיעה מוחית מוקדמת הדורש מודל תרגומי עם דפוסי פגיעה מוקדית עקביים ויכולת שחזור גבוהה על מנת לאפשר מחקר. מחקר זה מתאר את ההליך הכירורגי המפורט ליצירת פגיעת איסכמיה-רפרפרפוזיה מוקדית חד-צדדית שאינה דימומית במכרסמים בעלי ערך לטווח מלא.

תקציר

מספר מודלים של בעלי חיים שימשו לחקר פגיעה היפוקסית-איסכמית, פגיעה טראומטית, היפוקסיה גלובלית או איסכמיה קבועה הן במוח הבוגר והן במוח הבוגר. שבץ מוחי מתרחש בדרך כלל בתקופה הפרינטלית בבני אדם, ואיסכמיה-רפרפוזיה חולפת היא הצורה הנפוצה ביותר של שבץ מוחי ביילודים. שלב הרפרפוזיה הוא מרכיב קריטי בהתקדמות הפציעה, המתרחשת על פני תקופה של ימים עד שבועות, ובתגובה האנדוגנית לפציעה. מודל חולדה זה לאחר הלידה ביום 10 (p10) של חסימת עורק המוח האמצעי החולפת (tMCAO) יוצר פגיעה חד צדדית, לא דימומית מוקדית של איסכמיה-רפרפרפוזיה שניתן להשתמש בה כדי לחקור את המנגנונים של פגיעה מוקדית ותיקון במוח המקביל לטווח מלא. דפוס הפציעה המיוצר על ידי tMCAO הוא עקבי וניתן לשחזור מאוד וניתן לאשר אותו באמצעות MRI או ניתוחים היסטולוגיים. ניתן לתמרן את חומרת הפציעה באמצעות שינויים בזמן החסימה ושיטות אחרות שיידונו.

מבוא

שבץ בתקופת הילוד הנו גורם משמעותי של מוות ונכות, המתרחשים רבים ככל 1 ב 2300 לידות חיות 1. זה מוביל להתפתחות מערכת העצבים המרכזית שינו מוגברת לתחלואה ארוכת טווח, כולל שכיחות מוגברת של אפילפסיה,, פיגור שכלי שיתוק מוחין, וסוגים אחרים של המנוע או תפקוד קוגניטיבי. ההשפעות לכל החיים של שבץ מוקדם לעשות במודלים של בעלי חיים translational חיוני לבחינת מנגנונים של פגיעה ותיקון באוכלוסיה זו, כולל אסטרטגיות כדי להגן על המוח נפגע או לשפר תיקון.

מודלים איסכמיה שונים שימשו ללמוד פגיעה מוחית אצל בעלי חיים בוגרים, ובעוד רייס-מוואנוצ'י (Modified לוין) 2 הליך נפוץ ללמוד פגיעה איסכמית-היפוקסי במוח המתפתח, מוקד איסכמיה-רה-פרפוזיה הוא מנגנון מובהק של פגיעה גרימת חבלה המוקד, עם הליבה penu פצועmbra ורקמות מרחוק וללא כל פגע. קואיזומי 3 ו Longa 4 הדגמים שפותחו חולדות מבוגרות להשיג חסימה של עורק המוח אמצעי חולפת דרך עורק התרדמה המשותפת (CCA) ו עורק תרדמה חיצונית (ECA), בהתאמה. בשני המודלים, קשירת צריבה קבועה של ענפי עורק חשובים כדי למזער דימום וכדי לייעל את ההליך הכירורגי, אשר גורם גם השפעות שליליות על יכולת הבהמה להאכיל לעלות במשקל בעקבות פציעה. יתר על כן, ישנם מנגנונים פגיעים ברורים במוח בשלה ודפוסים ספציפיים של פגיעה לראות תוצאה.

לאחרונה, שבץ photothrombotic (שיטת רוז-בנגל) 5 ו 6 MCA קשירת קבע שימשו ללמוד שבץ ילודים הבוגרת. שניהם שבץ photothrombotic קשירת MCA ליצור שינויים של קבע זרימת דם במוח שגורמים לחוסר reperfusיוֹן. Reperfusion הוא מרכיב קריטי של ההתפתחות וההתקדמות של פציעת מוקד, עם יתר רעיל מוגבר, היווצרות רדיקלים חופשית, וייצור Nitric Oxide המוביל למות תא מושהה המערבת איתות מפלי נבדלות השלב איסכמי 7. היפוקסיה-איסכמיה כרוך קשירת ראש חד-צדדי קבועה ואחריו היפוקסיה העולמי, אשר גם נבדל סיבת פציעת איסכמי-היפוקסי בבני אדם ואינו גורם דפוס פציעת מוקד עקבי, מה שהופך לימוד הליבה פנומברה הפצועה יותר מאתגר.

תיארנו בעבר מודל שבץ המורגי הלא-איסכמיה-רה-פרפוזיה בחולדה בשלה באמצעות חסימת עורק המוח האמצעי חולף (MCAO) 8, 9, 10. זוהי שיטה פולשנית פחות ניגשת ו חוסמת את MCA דרך עורק התרדמה הפנימי בלי ligati קבעאו צריבה. זה מספק מודל של פציעה דומה הגורם השכיח ביותר של שבץ בתקופה הסב-לידתית 11, 12. מודל איסכמיה-רה-פרפוזיה זה של תוצאות פציעה נזק בסטריאטום ipsilateral ואת קליפת הזמני-parieto. גם מודל זה של tMCAO מאפשר שליטה על חומרת הפציעה על ידי שינוי משך ספיגה. בחינת מסלולי איתות ושינויים היסטולוגית בליבת פנומברה הפגועה ברקמת ipsilateral ו נגדית וללא כל הפגע יכולה יותר להבהיר את המנגנונים של פגיעה ותיקון במוח בשלה. מחקר זה ידגים מודל פציעה חשוב זה עבור המוח המתפתח.

פרוטוקול

כל מחקר בבעלי חיים אושרה על ידי אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו הוועדה על מחקר בבעלי חיים בוצע בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (ארה"ב מחלקת הבריאות ושירותי האנוש, פרסום מס '85-23, 1985 ). בעלי החיים היו תחת פיקוח הדוק על ידי וטרינרים של ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדית UCSF ושימוש (IACUC), מוכרת על ידי AAALAC. עכברוש Sprague-Dawley נקבה אחת עם המלטה 8 ימים בת (10 גורים בכל המלטה) הושג. אמא ואת הגורים שלה קבלו מזון כרצונך מים שוכנו במתקן טיפול בטמפרטורה והאור שבשליטת חיה עם העשרה יומית, לכל פרוטוקול IACUC, עד הגורים היו ישנים 10 ימים. כל מכשירי הניתוח המשמשים בהליך זה היו autoclaved כדי להבטיח סטריליות. עקרות של טיפי מכשיר נשמרות לאורך כל הניתוח.

1. העורקים התיכון ספיגה מוחין

  1. לשקול את הכלבה ensurדואר שזה המשקל הראוי (19-21 גרם). להרדים את הגור ב isoflurane 3% ב 100% O 2 ולהבטיח כי אין בתגובת קמצוץ רגל. שמירה על טמפרטורת פני גוף בין 35.5 מעלות צלזיוס ו 37 מעלות צלזיוס עם שימוש כרית חימום מתחת לבמה כירורגי.
  2. Secure חיה בעמדת פרקדן עם קלטת ברחבי אזורי כתף. באמצעות צמר גפן סטרילי, ספוגי באזור צוואר הרחם הקדמי עם פתרון povidone יוד ואחריו ספוגית של אתנול 70% במים מזוקקי פעמים, לסירוגין בין כל פתרון עבור ארבע מטליות כוללות.
  3. מקומית לחדור bupivacaine 0.25% אל אתר החתך המתוכנן. בעזרת סטריאוסקופ, לעשות קו אמצע 5 עד 7 מ"מ חתך צוואר רחם קדמי כדי לחשוף את העורק הראשי המשותף (CCA). מניחים 2-4 כתיבה כדי לשמור על חלל פתוח העורק החשוף.
  4. אתר את עורק התרדמה הפנימי (רשפ"ת), עורק עורפי (OA), ואת העורק ראשי חיצוני (ECA). יש להקפיד על עורקים כדי לקבל תצוגה ברורה. היית מכוניתeful לא להפריע העצב התועה.
    הערה: עבור גורי דמה מופעל, את inicision נותרת פתוחה העורקים נחשפים, שלאחריו החתך נתפר סגור. שעת ההרדמה הכוללת היא שווה ערך לזה של הניתוח הספיג.
  5. חותכים 1.5 ס"מ של חוט תפר 6-0 משי קלוע. Unbraid התפר, תלישת גדילים בודדים. ודא כי הגדילים הבודדים הם מסודרים ולא בלוי.
    הערה: אם יש צורך, smoothe בקצוות הפרומים ידי טבילת הגדיל הבודד במי סטריליים טיפוח הגדיל עם טיפי מלקחיים.
  6. תוך כדי לחיצה על גדיל התפר עם מלקחי 45 מעלות, להעביר את המלקחיים בתנועת קשת גורפת ללכת תחת ICA כך טיפי המלקחיים לצוץ בין הרשפ"ת ובין OA.
    הערה: אם לנתיחה נעשתה היטב, שלב זה יהיה יחסית קל. אם הרשפ"ת OA נוגעים, להיזהר שלא לקרוע את העורקים בעת שימוש במלקחיים כדי לבודד את ICA. אם הדימום מתרחש, להפעיל לחץ על העורק עם המלקחיים עדהדימום מפסיק. ספוג בדם עם ספוגית סטרילית.
  7. תפוס את הקצה של גדיל התפר כי היא מוחזקת ע"י המלקחיים ומושך אותו כך בסוף הוא קל לגשת. שחרר את קווצת מן מלקחיים ולגבות מלקחיים מתחת הרשפ"ת, היפוך תנועה בשלב 1.5 (איור 1 א).
  8. לקשור ליגטורה זמנית סביב ICA בבסיס, הקרוב ביותר למקום שבו הוא מפריד מן CCA.
    הערה: חשוב לקשור את הקשר, כך בסופו של גדיל כי ימשך כדי להסיר את הקשר הוא ארוך מספיק (יותר מ 1 מ"מ, פחות מ 3 מ"מ) כדי לתפוס בקלות עם מלקחיים, תוך הקפדה כי קיימת כמות מתאימה של גדיל תפר בצד השני של הקשר לצורך ביטול.
  9. בזהירות לחזור בו ICA רוחבית ולהשתמש קליפ לאבטח את קווצת לעור עודף ליד האזור השחי בצד השני של החתך. ודאו גדיל חוזר זו מתוח מספיק כדי לעצור את זרימת דם לפני שתמשיך לשלב הבא, כדילמזער את הסיכון של דימום בלתי נשלט. שימו לב כי העורק שטוח חיוור.
    הערה: לא יותר מדי לחזור, כפי שהוא יכול לגרום דמעה חלקית או מלאה של ICA. את ההכחשה יכול להיות מותאם בדיוק לפני ביצוע arteriotomy על ידי משיכת חוט עם ההפך בצד את הקליפ.
  10. השתמשו 45 ° מלקחיים כדי לתפוס עוד קווצת תפר התירה ו לולאה זה מתחת ומסביב ICA, כמו בשלב 1.5. תפקיד גדיל זה לרוחב גדיל ביטול (איור 1B).
    הערה: שלב זה יכול להיעשות גם לפני הנסיגה. אם אינך בטוח לגבי האיכות של הכחשה, הקשר הזה יכול להיות קשור מאוד רופף לפני הצעד הבא.
  11. חותך באמצע דרך arteriotomy 0.2 מ"מ בין ליגטורה הקשורה והיתרתי, טועה קרוב ליגטורה הקשורה.
    הערה: הדם שנותר העורק הקשור פעמי עלול לרוקן דרך arteriotomy אך לא יעלה על 5 μL. אם הדימום ממשיך להציק, בזהירות למשוך את קווצת הביטול להגדיל הכחשה, בזהירות אלחלל פגיעה בעורק ממתח יתר.
  12. בעזרת סרגל מדידה מטרי, למדוד את תפר הגורם לחסימה ו לחתוך את התפר עם תוספת מיוחדת של 2-3 מ"מ עבור הסרת occluder במהלך רה-פרפוזיה. החזק את occluder עם מלקחי 45 מעלות להשתמש במלקחיים ישר ליצור עיקול על האורך המתאים להגיע MCA, סימון נקודת עצירה עבור קידום.
    הערה: אורך חסימה 10 מ"מ מהקצה סיליקון טיפ העיקול משמש P10 ספראג Dawley או לונג אוונס גורי חולדה בטווח המשקל הזה.
  13. באמצעות 45 ° מלקחיים, להאכיל את תפר ספיגת ניילון מצופה סיליקון לתוך arteriotomy ולקדם את התפר אל העיקול המציין את המרחק שנקבע מראש אל MCA (איור 1C). ודא כי קידום מרגיש חלקה; לעצור התקדמות מייד אם התנגדות מורגשת. במהלך קידום, לכוון את התפר בכיוון זה מקביל CC / ECA, לכיוון הראש.
    הערה: אם התפר הוא dorsally המתקדם, לקראתעמוד השדרה של החיה, היא עשויה להיתקל עורק pterygopalatine (PTA). אם התנגדות מורגשת אחרי 3-5 מ"מ של קידום, התפר פגע לצומת PTA. בחזרה את occluder מתוך העורק עד ראש סיליקון הוא סמוך arteriotomy לפני ההתאמה כיוון ההתקדמות. אין צורך להסיר את occluder לחלוטין מן arteriotomy.
  14. אבטח את occluder ידי קשירה ליגטורה זמנית, באמצעות גדיל משלב 1.10 (האיור 1D).
  15. הסר את הקליפ מפשק. חתוך את הקווצות הן של ליגטורה הזמנית כך הקווצה את הקשר כי הוא משך להסיר את הקשר היא קלה להבנה עם מלקחיים ישרים ארוכה יותר הגדיל כי הוא משך להדק את הקשר.
    הערה: הגדילים חייבים להיות קצרים מספיק כדי שהם לא להסתבך החלל לאחר סגירה.
  16. הסר את retractors ולסגור את החלל באמצעות 6-0 משי קלוע צור בין שלושה לארבעה תפרים נקטעו.
  17. הסר את הגורהרדמה ולמקם אותו על כרית חימום האוויר בחדר. נטר את הגור עד שהוא שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal ולוודא שהיא התאוששה לחלוטין לפני שחזר אותו הסכר. ודא כי הגור שומר על טמפרטורת פני גוף בין 35.5 מעלות צלזיוס ו 37 מעלות צלזיוס.
  18. במהלך חסימה, תהודה המגנטית משוקלל דיפוזיה (DW-MRI) בהרדמת isoflurane יכול לשמש כדי לאמת את האינדוקציה של פציעה המתאימה. איור 2 מדגים פגיעים איסכמית מתמשכת זוהה על ידי DW-MRI במהלך tMCAO 9.
    הערה: הדמית מישוריים הד ספין משוקללת דיפוזיה מבוצעת 10-15 דקות לפני reperfusion. המוח מצולם עם קטעי עטרת 2 מ"מ בעובי סדרו באמצעות הגדרות רצף הדופק הבאות: TR / TE = 5000/60 מילישניות, 4 ממוצעים, שדה ראייה = 35 מ"מ, מטריקס נתונים = 128x128, משך שיפוע דיפוזיה = 20 ms, הפרדה = 29.7 ms, משרעת = 70mT / m, ו-גורם B = 1045 s / mm 2.בעלי חיים מפגינים חוסר מעורבות קליפת מוח או פגיעת איסכמית טיפוסית, כגון בגזע המוח, אינם נכללים.

Reperfusion 2.

הערה: הספיגה מבוצעת עבור 3 שעות כדי לגרום מתונה עד חמורת כמות הפציעה המעורבת הסטריאטום ואת הקליפה.

  1. בסביבות 2 h ו 50 דקות החסימה הבאה של MCA, להרדים את הגור ב isoflurane 3% ב 100% O 2. יש לשמור על טמפרטורת פני גוף בין 35.5 מעלות צלזיוס ו 37 מעלות צלזיוס עם שימוש כרית חימום מתחת לבמה כירורגי.
  2. הסר את תפרי קטע מן הצעד 1.16 ולאתר לצומת, אשר מסומנת על ידי שתי קשירות סוף הזנב של תפר הגורם לחסימה.
    הערה: חיות דמה מופעל מושרות ולהישאר תחת הרדמה למשך פרק זמן שווה החיות המלוכדות. החתך שוב נפתח ונתפר סגור. עבור חיות דמה מופעל, המשך לשלב 2.11.
  3. בזהירות השיעבודאת הקשר לרוחב ביותר קשור בעבר בשלב 1.14 על ידי משיכת חוט ארוך יותר.
    הערה: אם יש התנגדות ב שהתיר את הקשר, לעצור כדי להבטיח כי הגדיל הנכון של הקשר הוא שנגרר. אם ההתנגדות נמשכת, להגדיל הגדלה כדי לראות טוב יותר. היה זהיר כאשר מתירים, כפי שאפשר לפגוע בעורק במהלך שלב זה.
  4. הסר את קווצת תפר המחלל.
  5. בדיוק בשעה 3 h הבאים חסימה MCA, לאט לגבות תפר occluding מתוך העורק. לא יהיה שום התנגדות.
    הערה: ברוב המקרים, לא יהיה דימום. אם כמות קטנה של דימום, יפעיל לחץ על העורק באתר arteriotomy.
  6. שימוש במלקחיים כדי להפעיל לחץ על arteriotomy, כשלב הבא משחזר את זרימת הדם ICA עבור reperfusion.
  7. בזהירות להתרת הסבך המדיאלי באותה שיטה כמו בשלב 2.3.
  8. הסר את קווצת תפר מהגוף ולהחיל סוכן עוצר דמום אל arteriotomy כדי לעצור את הדימום.
  9. ודא כי הדימום פסק.
    הערה: שובו של הצורה המקורית והצבע האדום של העורק מאשרת כי זרימת הדם ICA שוחזרה.
  10. הסר את retractors ולסגור את החלל עם שלושה עד ארבעה תפרים שהופסקו של 6-0 משי קלוע.
  11. הסר את הגור מן ההרדמה ולמקם אותו על כרית חימום האוויר בחדר. נטר אותו עד שב להכרתו מספיק כדי לשמור על שכיבה sternal ולהבטיח להחלמה מלאה לפני שחזר אותו הסכר. ודא כי הגור שומר על טמפרטורת פני גוף בין 35.5 מעלות צלזיוס ו 37 מעלות צלזיוס.
  12. בדוק את הגורים יומיים עבור 5 ימים. Recprd המשקולות שלהם ולבדוק באתרי החתך מקרוב לריפוי מתאים. הסר את התפרים לאחר 7-14 ימים. פגיעה פוסט-tMCAO ניתן הדמיה עם MRI, אם 9 רצויות.
    הערה: בעלי חיים עלולים לאבד עד 1 גרם של משקל ביום הראשון אבל בדרך כלל יהיה להחזיר את המשקל ללא התערבות ולהיות בתוך דומה לשקולמגוון t לבקרות ידי ימים 4-5. לעיתים נדיר, גור עלול לאבד משקל עודף או בעלי האכלת קושי, מחייב gavage פי זנות במשך 2-3 ימים.
  13. ב p21, פציעה ניתן להעריך בצורה מהימנה עם בדיקות התנהגותיות הסנסורית, כגון rotarod או גידול צילינדר. בדיקות קוגניטיבי יכולות להתבצע מוקדם ככל בגיל 4-6 שבועות באמצעות הערכות כגון זיהוי אובייקט רומן או מבוך המים של מוריס 13.
  14. להרדים את חולדות בזריקה intraperitoneal של Euthasol (50 מ"ג / ק"ג) לקציר המוח 11, 12.
  15. ניתוח היסטולוגית להעריך נפח פציעה או בתגובה התערבויות יכול להתבצע עם סגול cresyl או H & E מכתים (איור 3) 10.

תוצאות

חומרת הנזק הנגרם מהפגיעה tMCAO תלות גבוהה הן זמן חסימה ואת הניסיון של המנתח. חסימה 90-min קרובות מייצרת קל עד בינוני דפוס פציעה, בעוד 3 h מייצר פציעה בינונית עד חמורה. חומרת הפציעה ניתן להעריך באמצעות מגוון רחב של שיטות, כולל MRI, היסטולוגיה, או ניתוחים התנהגותי ארוך טווח קצר או. איור 2 מדגים דוגמה DW-MRI שבוצעה 75 דקות לתוך חסימה 90-min, המאשר פגיעה איסכמית מעורבים בחצי הכדור ipsilateral. הדמית דיפוזיה משוקללת מדגים גדלה דיפוזיה בסטריאטום ipsilateral ואת רוב קליפת ipsilateral, ללא שינויים נגדיים, במהלך שלב איסכמי החריף. הינו תוצאה בינונית של פגיעה ארוכת טווח ומצדו של קליפת המוח לבין חומר אפור עמוק.

חסימה של תוצאות MCA ב התא למוות שמתחיל בסטריאטום עבור פציעה חמורה פחות ומפתחת החמרה פגיעה בקליפת המוח ואת היפוקמפוס פעמים כבר חסימה ו פציעה חמורה יותר. במהלך אופטימיזציה של הטכניקה הכירורגית, כגון קביעת אורך החדרת התפר, MRI מומלץ מאוד, שכן היא מאפשרת את אישור השמת תפר נכון להדמיה של בצקת והתקדמות פציעה במהלך החסימה 14, 15, 16. אם MRI אינו זמין, H & E או מכתים סגול cresyl שיטות היסטולוגית פשוטה ואמינה כדי לקבוע מורפולוגיה פציעה והוא יכול לשמש הן בנקודות זמן מוקדמים ומאוחרים לאחר tMCAO. איור 3 מדגים דפוס פציעה בינונית עד חמורה על בדיקה histopathological בעקבות חסימת 3 h, הוכחת ציסטה היווצרות ונפח בסטריאטום ואת קליפת ipsilateral.

> כימות stereological משוחד סעיפים מוכתמים cresyl סגול, ניתן לחשב את היחס של ipsilateral נפח חצאים מוח נגדי מאשר פציעת ipsilateral איסכמי-רה-פרפוזיה. באופן ספציפי, לאחר הרדמת החיה עם Euthasol, המוח היה לקצור ידי זלוף transcardiac ב 0.1 M PBS עם 4% paraformaldehyde. בעקבות postfixation ו איזון לילה סוכרוז 30%, המוח כולו מחולק על 50 מיקרומטר במרווחים, וכל סעיף י"ב נבחר, רכוב, מוכתם סגול cresyl 10.

אפילו עם פציעה קלה, שינויים רצוניים, כגון מכתרת hemiparesis, מצוינים בתקופת החסימה. עם פציעה חמורה יותר, שינויים אלה יימשכו לאחר רה-פרפוזיה. בדיקות התנהגותיות נוספות יכול לשמש כדי להעריך את חומרת הפציעה, כולל בדיקות גידול rotarod או צילינדר עבור פונקציה הסנסורית ו מבוך המים של מוריס עבור13 פונקציה קוגניטיבית.

figure-results-1
איור 1: תמונות כירורגים חיות של נוהל tMCAO. (א) גדיל התפר הראשון מסובב סביב הרשפ"ת, כמפורט צעד 1.6. (ב) ליגטורה הזמנית הראשונה קשורה ואת ICA הוא חזר בו. גדיל התפר השני מסובב סביב הרשפ"ת, לרוחב לגדיל התפר הראשון, כמפורט צעד 1.9. (ג) תפר ספיגה מצופה סיליקון מוזן לתוך האתר arteriotomy, כמפורט צעד 1.12. (ד) ליגטורה הזמנית השנייה קשורה לאבטחת occluder במקום, כמפורט צעד 1.14. בר סולם = 1 מ"מ.

figure-results-2
איור 2: MRI במהלך Occlusion מדגים הפגיעה החד-צדדית המתאימה. קדמי אל אחורי, פרוסות תמונת עטרה של DW-MRI, שבוצעו במהלך חסימת 90 דקות, להפגין דיפוזיה מוגברת מעורבות בחצי כדור ipsilateral (החיצים), אשר עולה בקנה אחד עם פגיעת איסכמית מתמשכת בשלב החריף. הודפס מחדש באישור משבץ 11. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

figure-results-3
איור 3: פגיעה חד צדדית עירוב בסטריאטום ו- Cortex ב 4 השבועות שלאחר tMCAO. אחורי אל קדמי, סעיפי מוח עטרת cresyl-מוכתם סגול (כל 50 מיקרומטר) שנבצרו P38 חיות להפגין פציעה חמורה למדי (החצים מראים היווצרות ציסטה ipsilateral והקטינו הקורטיקליתנפח של הסטריאטום) בעקבות tMCAO 3 שעות ב P10. החור העגול בצד שמאל מייצג מזהה בחצי כדור נגדי. סרגל קנה מידה = 5 מ"מ. הודפס מחדש באישור לנוירוביולוגיה של 12 מחלות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

דיון

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

ראשית, חשוב לשמור על טמפרטורה נורמלית מן חניכה של הרדמה עד להחלמה מלאה, כפי שיש ידועים ההשפעות של שני היפותרמיה 17 ו היפרתרמיה 18 על התקדמות של פגיעה מוחית הן חיות בשלה ובוגרת. שנית, תוך הבטחת החיה שמבטלת את החתך, מיצוב אופטימלית לניטור נשימה ועל מנת להבטיח כי קנה הנשימה היא ללא דחיסה חיוני. שלישית, למנוע סחיטה או מתיחת העצב התועה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשינויים בקצב לב עם גירוי מחנק. רביעית, משום הכחשה של ICA יש צורך לשלוט דימום במהלך arteriotomy, יש לשים לב למידת המתח במהלך הכחשה כדי למנוע פגיעה בעורק. אם עורק אין לקרוע מן ההכחשה, או אם יש חתך arteriotomy עני, החיה צריכה להיות מחוץ ניתוח בשל הסיכוןשל דימום ו reperfusion העני.

שינויים ופתרון בעיות

באמצעות MRI כמדריך, אורך התפר עשוי להיות מותאם על מנת להבטיח כי קצה סיליקון כמו שצריך לחסום כאן את MCA כדי ליצור את איסכמיה המוקד. אם MRI אינו זמין, גורים עלולים להיות מורדמים לפני reperfusion לנתיחה כדי להמחיש את המיקום של התפר. התאם את אורך התפר לפי צורך. משקל גור וקושר מאוד עם דרישות אורך תפר גורם לחסימה. שעת החסימה יכולה להיות שונה כדי להתאים את מידת חומרת פציעה.

בנוסף, צורת תפר ואורך הם קריטיות. עבור P10 ספראג-Dawley וחולדות לונג אוונס במשקל 19-21 גרם, 10 מ"מ הוא אורך אופטימלי של החדרת מניסיוננו. החדרת יתר של תפר occluding עלולה לגרום ניקוב של MCA. יתר על כן, העקביות בצורת הנימה הגורם לחסימה בכל ניתוח תגרום עקביות מוגברת של פגיעת pattern 19, 20. מסיבה זו, המלצנו באמצעות תפרים מתוצרת מקצועית למטרה ספציפית זו. כמו כן, חשוב לציין כי דפוס הפציעה עשוי להיות שונה בין מתרגל עקב הבדלים דקים לכאורה טכניקה.

מגבלות הטכניקה

ביצוע הטכניקה הזו מכרסם קטן, פיתוח דורש ניסיון משמעותי. אם מבוצע כהלכה, המנתח הוא מסוגל לגרום דפוס פציעה מאוד עקבי על פני בעלי חיים בגדלים שונים ולהשיג שיעור הישרדות יותר מ 95%. יתר על כן, כלי כירורגיים מתאימים קריטיים. חייבים להיות מטופח מכשירים כירורגי כדי להבטיח כי כל טיפי המכשיר משוערים כראוי.

משמעות של טכניקה זו ביחס לשיטות קיימות או חלופה

בעוד-איסכמיה היפוקסיה, או המודל רייס-מוואנוצ'י 2 , הוא נפוץ ביותר ללמוד פגיעה איסכמית-היפוקסי במוח המתפתח, חשוב לציין כי מודל זה של tMCAO הוא נבדל HI בכך שיש איסכמיה מוקד החולפת בלי היפוקסיה עולמי, ואחריו שלב reperfusion כאשר חסימת מוסר זרימת דם משוחזרת. זה גורם לפגיעה יותר עקבית לשחזור והוא יותר קליני translational ידי גרימת דפוס פציעה דומה לזו שנצפתה ב שבץ בילוד מלא טווח. זה מאפשר הלימוד של דפוסי פגיעת מוקד ותגובות מפצות ברקמה וללא כל פגע.

יישומים עתידיים לאחר מאסטרינג טכניקה זו

מודל זה דומה הגורם השכיח ביותר של שבץ בילודים אנושיים, פקיק occlusive חולף המתרחש במהלך התקופה הסבה-לידתית 11, 21. האטיולוגיה אינה ברורה לחלוטין תלויה בכמה גורמים ככל הנראה, אך ההנחה היא שברוב המקרים לאo לנבוע תסחיפים עוברים מן השליה 11. בנוסף, תינוקות רבים עם שבץ סביב לידה משוערת קרובה בהווה עם פעילות התקפים מאוחר או בדיקות נוירולוגיות מוקד עדינות מומי 22. זה הופך את השימוש במודל פציעה עקבי, translational לזהות מנגנונים של התקדמות פגיעה ואסטרטגיות טיפוליות אפשריות מכריעות.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

המימון ניתן על ידי מענקי NIH K08 NS064094 ו-UCSF REAC. המחברים מבקשים להודות לניקיטה דרגווין, זינלדה וקסלר וג'ואל פאוסטינו על עזרתם בפיתוח טכניקה זו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
איזופלואורןהנרי שיין50033חומר הרדמה, ב-3% 
Trinocular SurgioscopeWorld Precision InstrumentsPSMT5N
כרית חימוםSunbeam000731-500-000הגדרה נמוכה עד בינונית
מדחום IRExtech Instruments72-5270
ערכת נסיגה לבעלי חיים קטנים כלי מדע עדינים18200-20
CermaCut מספרייםכלי מדע עדינים14958-09
Dumont #5SF מלקחייםכלים מדעיים עדינים112522-002x
Dumont #5/45 מלקחייםכלי מדע עדינים11251-352x
B-2 מיקרו מהדקכלי מדע עדינים00398-02
תפיסות ליישום מהדקבסדר כלי מדע00072-14
מספריים מיקרו ואנותכלי מדע עדינים15000-032 מ"מ תפרי
חסימהDoccol602123PK10701712PK5Re
סרגלכלים
סוכן המוסטטי AviteneDVL1010590
6-0 חיתוך הפוך משי פרמה יד תפראתיקון769G
EuthasolVirbac7101010.22 מ"ל/ק"ג
אפליקטורים עם קצה כותנההנרי שיין100-9249
סרט מעבדהVWR89097-990
קצה חיתוך מדעיים עדינים

מקורות

  1. Grunt, S., et al. Incidence and outcomes of symptomatic neonatal arterial ischemic stroke. Pediatrics. 135 (5), 1220-1228 (2015).
  2. Rice, J. E., Vannucci 3rd, R. C., Brierley, J. B. The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat. Ann Neurol. 9 (2), 131-141 (1981).
  3. Koizumi, J., Yoshida, Y., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. I: a new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Jpn J Stroke. 8 (8), (1986).
  4. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  5. Labat-gest, V., Tomasi, S. Photothrombotic ischemia: a minimally invasive and reproducible photochemical cortical lesion model for mouse stroke studies. J Vis Exp. (76), (2013).
  6. Renolleau, S., Aggoun-Zouaoui, D., Ben-Ari, Y., Charriaut-Marlangue, C. A model of transient unilateral focal ischemia with reperfusion in the P7 neonatal rat: morphological changes indicative of apoptosis. Stroke. 29 (7), 1454-1460 (1998).
  7. Perlman, J. M. Intervention strategies for neonatal hypoxic-ischemic cerebral injury. Clin Ther. 28 (9), 1353-1365 (2006).
  8. Derugin, N., Ferriero, D. M., Vexler, Z. S. Neonatal reversible focal cerebral ischemia: a new model. Neurosci Res. 32 (4), 349-353 (1998).
  9. Gonzalez, F. F., et al. Erythropoietin increases neurogenesis and oligodendrogliosis of subventricular zone precursor cells after neonatal stroke. Stroke. 44 (3), 753-758 (2013).
  10. Larpthaveesarp, A., Georgevits, M., Ferriero, D. M., Gonzalez, F. F. Delayed erythropoietin therapy improves histological and behavioral outcomes after transient neonatal stroke. Neurobiol Dis. , (2016).
  11. Rutherford, M. A., Ramenghi, L. A., Cowan, F. M. Neonatal stroke. Arch Dis Child Fetal Neonatal Ed. 97 (5), 377-384 (2012).
  12. van der Aa, N. E., Benders, M. J., Groenendaal, F., de Vries, L. S. Neonatal stroke: a review of the current evidence on epidemiology, pathogenesis, diagnostics and therapeutic options. Acta Paediatr. 103 (4), 356-364 (2014).
  13. Gonzalez, F. F., et al. Erythropoietin sustains cognitive function and brain volume after neonatal stroke. Dev Neurosci. 31 (5), 403-411 (2009).
  14. Dudink, J., et al. Evolution of unilateral perinatal arterial ischemic stroke on conventional and diffusion-weighted MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 30 (5), 998-1004 (2009).
  15. Derugin, N., et al. Magnetic resonance imaging as a surrogate measure for histological sub-chronic endpoint in a neonatal rat stroke model. Brain Res. 1066 (1-2), 46-56 (2005).
  16. Dzietko, M., Wendland, M., Derugin, N., Ferriero, D. M., Vexler, Z. S. Magnetic resonance imaging (MRI) as a translational tool for the study of neonatal stroke. J Child Neurol. 26 (9), 1145-1153 (2011).
  17. Mancuso, A., Derugin, N., Hara, K., Sharp, F. R., Weinstein, P. R. Mild hypothermia decreases the incidence of transient ADC reduction detected with diffusion MRI and expression of c-fos and hsp70 mRNA during acute focal ischemia in rats. Brain Res. 887 (1), 34-45 (2000).
  18. Kasdorf, E., Hyperthermia Perlman, J. M. Inflammation, and Perinatal Brain Injury. Pediatric Neurology. 49 (1), 8-14 (2013).
  19. Bouley, J., Fisher, M., Henninger, N. Comparison between coated vs. uncoated suture middle cerebral artery occlusion in the rat as assessed by perfusion/diffusion weighted imaging. Neurosci Lett. 412 (3), 185-190 (2007).
  20. Shimamura, N., Matchett, G., Tsubokawa, T., Ohkuma, H., Zhang, J. Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model. J Neurosci Methods. 156 (1-2), 161-165 (2006).
  21. Kirton, A., deVeber, G. Paediatric stroke: pressing issues and promising directions. Lancet Neurol. 14 (1), 92-102 (2015).
  22. Nelson, K. B. Perinatal ischemic stroke. Stroke. 38, 742-745 (2007).

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

P10ArteriotomyMRI Diffusion Weighted MRI
עורקי חלוף דגם ספיג תיכון שיתוק של שבץ ילודים אצל חולדות P10
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.