תצפית כימות התנהגות החיזור של נמטודות פיינווד, Bursaphelenchus xylophilus

Summary

מוצג פרוטוקול לחקירת התנהגות ההזדווגות של נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus. מאפיינים התנהגותיים של B. xylophilus מתוארים בתהליך ההזדווגות.

Abstract

שיטת התבוננות וכימות התנהגות החיזור של נמטודות עץ האורן, xylophilus Bursaphelenchus, הוקמה תחת סטראו. כדי לשפר את היעילות של ההזדווגות ב Xylophilus וכדי להגדיל את הסיכוי של התבוננות הזדווגות, מבוגרי בתולה היו בתרבית והשתמשו לחקירה. ביצים התקבלו על ידי שמירה על נמטודות במים המאפשרים הנקבות להטיל ביצים במשך 10 דקות. לנערים השלב השני (J2) סונכרנו ידי דוגרים על הביצים למשך 24 שעות ב 25 ° C בחושך, ואת מוקדם J4 התקבלו על ידי culturing J2 עם עובש אפור, בוטריטיס, עבור 52 אחר h. בנקודה זו בזמן, רוב נמטודות J4 יכול להבחין בבירור כמו להיות זכר או נקבה באמצעות מורפולוגיה גניטלי שלהם. הזכר והנקבה J4 נאספו ותרבותי בנפרד בשתי מנות שונות פטרי במשך 24 שעות כדי לקבל נמטודות מבוגר בתולה. גבר בתול ונקבה בתולה היו לזווג בטיפת וואטאה בבאר של שקופית קעורה. התנהגות החיזור שצולמה באמצעות מצלמת וידאו תחת סטראו. התקופה כולה של תהליך ההזדווגות היה 82.8 ± 3.91 דקות (ממוצע SE ±) ויכול להיות מחולק ל 4 שלבים שונים: חיפושים, פנייה, מזדווגים, ומשתהה. הפרוטוקולים הממוצעים של משך היו 21.8 ± 2.0, 28.0 ± 1.9, 25.8 ± 0.7 ו -7.2 ± 0.5, בהתאמה. תת התנהגויות Eleven תוארו: שיוט, מתקרב, נתקלים, נגיעה, הופ דאנס, איתור, מצרף, לפלוט זרע, להפרדה, קפאון, נדידה. מעניין לציין, כי תחרות תוך-מינית ברורה נצפתה כאשר ונקבה אחת הייתה מקובצים עם 3 זכרים או זכר אחד עם 3 נקבות. פרוטוקול זה שימושי ובעל ערך, לא רק חוקר את התנהגות החיזור של xylophilus ב ', אלא גם מתנהג כמו הפניה ללימודים האתולוגי של נמטודות אחרות.

Introduction

נמטודת עץ האורן, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner and Buhrer) Nickle, היא אחד המינים הפולשים ההרסניים ביותר, הגורמים לנבילה ובסופו של דבר למוות של עצי אורן. מאמינים כי הנמטודה הפתוגנית הזו מקורה בארה"ב, אך היא הועברה למספר מדינות, כולל סין, יפן, דרום קוריאה ופורטוגל. לאחרונה דווח גם בספרד, הרג מיליוני עצי אורן בהפסדים כלכליים עצומים ואיים על ייצור היער והיציבות האקולוגית^1-5.

ברגע שעץ אורן מארח נגוע בנמטודות עץ אורן, אלפי מיליוני צאצאים מתפשטים במהירות בתוך הגזע. זה גורם לתפקוד לקוי של הקסילם, וכתוצאה מכך לנבילה ובסופו של דבר למותו של העץ המארח⁶. עם זאת, אין כיום דרך יעילה לשלוט במחלה זו. התנהגות הזדווגות עשויה לשחק תפקיד חשוב בפוריות הגבוהה של נמטודה⁷ זו. לכן חקרנו את התנהגות ההזדווגות של B. xylophilus במעבדה, בניסיון למצוא דרך יעילה להפריע להזדווגות שלו ולהפחית את פוריותו.

פרוטוקול זה נועד להציג את השיטות המפורטות כיצד להשיג את הבוגרים הבתולים של B. xylophilus וכיצד להתבונן ולנתח את התנהגות ההזדווגות באמצעות מקליט וידאו וסטריאומיקרוסקופ. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כהתייחסות למחקרים התנהגותיים של נמטודות אחרות.

Protocol

1. רכישת נמטודות למבוגרים בתולים

1. לבודד נמטודות פיינווד ותנאי תרבות
   הערה: ב xylophilus לבודד Nxy61 הופק במקור מתוך massoniana Pinus חולה באזור Ningbo במחוז Zhejiang בסין.
   1. הכן תפוחי אדמה דקסטרוז אגר (PDA, ראו טבלה של חומרים) צלחות לגידול בוטריטיס.
   2. לקבלת חיסון, אגרוף פיסת מחצלת פטרייתי עם קוטר של 10 מ"מ מן מחצלת cinerea ב והכניס אותו באמצע צלחת מחשב כף יד חדש. תרבות cinerea B. במשך 5 ד 25 מעלות צלזיוס בחושך.
   3. תרבות נמטודות עץ האורן בצלחת פטרי המוכנה המכילה cinerea ב 25 מעלות צלזיוס בחושך.
2. רכישה ב xylophilus ביצים
   1. מניח צינור גומי מהדק מתחת משפך והחזק את המשפך המוכן במעמד להרכיב אתמנגנון משפך Baermann. מניחים שתי שכבות של נייר סינון במקום גזה בפה של המשפך.
   2. מעביר את התרבויות פטרייתי להגדרות המשפך ומוסיף מים עד מחצלת פטרייתי היא שקועה. חכה 2 h, נמטודות ייצאה המתרבות פטרייתי, לחצות את נייר הסינון, ולהשתקע בחלק הנמוך ביותר של משפך Baermann.
   3. אסוף את הזוג הראשון של טיפות מים מתחתית הצינור לתוך צינור 15 מ"ל ולאסוף נמטודות על ידי שחרור מהדק לאט על הצינור.
   4. צנטריפוגה האוספים מעל 3,000 XG במשך 2 דקות ב RT.
   5. הסר את השכבה העליונה של מים עם טפטפת resuspend אותו עם 1 מ"ל של (dd) מזוקקים פעמיים סטרילי H ₂ O.
   6. עם טפטפת, להעביר את resuspension מעל לצלחת חדש זכוכית פטרי (6 ס"מ קוטר). הוסף 3 מ"ל של dd סטרילי H ₂ O כדי בצלחת פטרי כדי להבטיח כי נמטודות מסוגלים לשחות בחופשיות.
   7. שמור את נמטודות של גלאסזה צלחת פטרי במשך 10 דקות ב 25 ° C בחושך. ביצים תונח על ידי נשים בהריון. בגלל משטח גליקופרוטאין שלהם, הביצים ידבק לתחתית צלחת זכוכית פטרי.
   8. הסר את המים ותולעים בזהירות, מבלי להפריע את הביצים. הוסף 3 מ"ל של dd סטרילי H ₂ O כדי בצלחת זכוכית פטרי מיד כדי למנוע את הביצים מהתייבשות.
   9. חזור על שלב 1.2.8 3x להסיר את כל הזחלים ומבוגרים, ולקבל את הביצים הטהורות. הוסף 2 מ"ל תוספת (5 מ"ל בסך הכל) של H dd סטרילי ₂ O כדי בצלחת פטרי.
3. רכישת הקטינים הרביעי שלבית (זחלי J4)
   1. האץ את הביצים שנאספו במשך 24 שעות בחושך ב 25 ° C כדי להשיג זחלי J2.
   2. מעבירים את הזחלים J2 עם טפטפת לתוך צינור 15 מ"ל, צנטריפוגות ב 3,000 XG למשך 2 דקות, ולהסיר את שכבת המים העליונה.
   3. Resuspend הזחלים J2 עם 200 μL של dd סטרילי H ₂ O, ולאחר מכן להעביר אותםצלחת PDA המכילה cinerea ב.
   4. תרבות זחלי J2 עבור 52 שעות ב 25 ° C בחושך. בנקודה זו בזמן, רוב זחלי J2 יהיו התפתחו בשלב המוקדם של זחלי J4.
4. רכישת נמטודות מבוגרת בתולה
   1. הכין מחט עבור להרים נמטודות על ידי ציור זכוכית נימים לאחר חימום זה מעל מבער אלכוהול.
      הערה: קצה מחט נימים זה בדרך כלל צריך להיות 50 מיקרומטר קוטר, בערך רוחב הגוף של נמטודות מבוגרת, כך שהוא יכול לשמש ככלי להרים נמטודות יחיד.
   2. להרכיב משפך Baermann ולחלץ נמטודות מן התרבויות פטרייתי עבור 2 שעות, כמתואר בשלבים 1.2.1 - 1.2.3.
   3. מעביר את J4 עם מים לתוך צלחת פטרי נקיה.
   4. שים את נמטודות תחת סטראו ולהבחין בין זכרים ונקבות ידי המורפולוגיה של איברי המין, כפי שתואר על ידי ממיה ו Kiyohara ⁸ (איור 1 ). תרים נמטודות מהמין הרצוי עם מחט נימים המוכנה ולהעביר אותו לצלחת פטרייתי-התרבות המתאימה לגברים או לנשים.
      הערה: יש יותר נשים מאשר גברים, עם אחוז נקבות ב 60 - 70%. הפות הנשית היא ללא ספק שונה spicule זכר. בהשוואה המבוגרת, spicule או הפות ב J4 בשלב מוקדם הוא קטן יותר, אבל הם עדיין ניתן לראות בקלות ומכובדת. נמטודות תמיד נעות בתוך המים, שלפעמים מגביר את הקושי להבחין זכרים ונקבות.
   5. תרבות זחלי J4 במשך 24 שעות אחרות במהירות של 25 ° C בחושך.
      הערה: כל נמטודות צריך להתפתח מבוגרים, אבל מאז הם בךזוג, הם נחשבים כמבוגרים בתולה.
   6. להרכיב שני Baermann משפכים ולחלץ מבוגרי הבתולה מן התרבויות פטרייתי עבור 2 שעות, כמתואר בשלבי 1.2.1 - 1.2.3, ולהעביר את הזכרים בוגרים בתולה ונקבות לשתי מנות נפרדות, נקיות פטרי.

תצפית 2. הקלטת וידאו של התנהגות חיזור

1. הכן כמה שקופיות קעורות ולהוסיף 200 μL של H dd סטרילי ₂ O לכל אחד הבארות שלהם.
2. תרים את זכר בוגר בתולה המוכן או ונקבה עם מחט נימים ולשים רק נמטודות אחד לתוך המים של כל שקופית קעורה.
3. שמור על מבוגרי הבתולה בתוך הבאר 1 h לתת להם להסתגל לסביבה מהימית החדשה.
4. זוג זכר ונקבה בתולה ידי העברת אחד מהם מאחד היטב למשנהו בעזרת פיפטה.
5. שים את התנהגות החיזור של שילוב 1♀ + 1♂ בשקופית הקעורה תחת סטראו.
6. כדי לנתח את יעילות ההזדווגות של מבוגרי בתולה, לחשב את שיעור הצלחת ההזדווגות שלהם (R) ולהשוות אותו עם זה של זוגות מבוגרים שנבחרו באופן אקראי. חישוב R כאחוז משכפל שבו הזדווגות נצפתה בהשוואה למספר הכולל של משכפל למד.
7. כדי לחקור בחירת הזדווגות ותחרות intrasexual, קבוצה ולבחון נמטודות בתולת שני שילובים שונים: 1♀ + 3♂ ו 3♀ + 1♂.
8. על מנת לאסוף נתונים לניתוח איכותי וכמותי, לצלם את התנהגות החיזור באמצעות מיקרוסקופ וידאו. בדרך כלל, תהליך ההזדווגות כולו, מהרגע כאשר נמטודות ממוקמים הבאר של השקופית הקעורה אל הרגע שבו הם מתרחקים לאחר הזדווגות, יושלם בתוך 2 שעות. לכן, להקליט את תהליך ההזדווגות ברציפות במשך לפחות 2 שעות כפי לשכפל אחד. שלם לפחות 30 משכפל בסך הכל לכל צירוף.
   הערה: הוסף dd סטרילי יותר H ₂ O (בדרך כלל 50 μL) כל 0.5 שעות אל הבאר כדי לפצות על אידוי במהלך תהליך הצריבה.

3. איסוף נתונים

1. הצג את כל הסרטונים בקפידה על מסך מחשב ולאפיין את ההתנהגויות תת איכותי.
2. מדוד את המשך באמצעות הזדווגות המסגרת לפי מסגרת דואר פונקציה של מקליט וידאו. ידני להפחית את הזמן החל לנקודת הסיום.
3. עבור שילוב 1♀ + 1♂, לנתח כל הקלטת וידאו ולמדוד את משך אחד מהאירועים הבאים:
   1. מדדו את משך חיפוש (כלומר, הזמן וממתי הנשית והגברית מוכנסים היטב של השקופית קעורה אל הרגע הם נתקלים קשר אחד לשני).
   2. מדוד את משך פנייה (כלומר, הזמן מהמגע הראשון ועד לרגע שבו הזכר עומד בדיוק על הפות של הנקבה עבור ההזדווגות הראשונה).
   3. מדוד את משך מזדווגים (כלומר, זמן וממתי הזכר עומד בדיוק על הפות של הנקבה עד שהוא מחליק למטה מהגוף של הנקבה לאחר שפיכה). הערה: חלק נמטודות יכול להזדווג כמה פעמים ב 2 h. במקרים כאלה, למדוד את משך ההזדווגות מן ההזדווגות הראשונה סוף last אחד, כולל הזמן שביניהם.
   4. מדדו את משך וקידוח (כלומר, בתקופה שלאחר ההזדווגות עד לשחות זכר ונקבה אחד מהשני והם מופרדים על ידי מרחק של יותר מאורך הגוף 'נמטודות (בדרך כלל 1 מ"מ)).
4. ספירת תדירות ההזדווגות ומשך כל הזדווגות ומשך חיים ממוצע של כל הזדווגויות ב 2 h עבור כל אחד מהשילובים שונים (כלומר, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂, ו 1♀ + 3♂).
5. חשב את שיעור ההצלחה ההזדווגות של איש הקשר הראשון (P) עבור שילובים שונים כמו שיעור ההצלחה של הזדווגות לאחר המגע הראשון, אשר מתבצע באופן מיידי וללא כל הפסקה. בשלב הפנייה, אנשי קשר כמה עלולים להיות שנצפו לפני ההזדווגות בפועל.
   1. כאשר המרחק בין שני אנשים הוא יותר מאורך הגוף, שקול קשר אחד ייגמר. ראשית לשכפל, להקליט P 100% כשאני הזדווגותהים נצפה מייד לאחר המגע הראשון, ללא הפסקה, או 0.00% אם לא הזדווגות נצפתה או אם יש הזדווגות אבל אחרי שניים או יותר אנשי קשר.
      הערה: היו 30 משכפל עבור כל שילוב המתואר כאן.

Results

שיעור ההצלחה ההזדווגות (R) של מבוגרים בתולה היה 86.67% בממוצע, שהיה גבוה משמעותית מזה של המבוגרים שנבחרו באקראי: 13.33 ± 4.65% (F = 1301.71, df = 1, P = 0.0001) (איור 2). ממצא זה מצביע על כך שהוא קל יותר לבחון את התנהגות החיזור של B. xylophilus עם מבוגרים בתולה מאשר עם מבוגרים שנבחרו באופן אקראי.

כאשר חול...

Discussion

בדיקות התנהגות הן היבט בסיסי של אקולוגיה כימית, נוירוביולוגיה, ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה. נמטודות, ובמיוחד סי אלגנס, נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים בתחומים אלה. התנהגות החיזור של C. elegans נחקרה בעבר ^10-11. עם זאת, ב xylophilus הוא gonochoristic ושונה אלגנס hermaphroditic, ותהליך החיזור שלה יש תכונות התנהגותיות שונות ^9. לאחרונה, התנהגות החיזור של Bursaphelenchus okinawaensis, מין אחות hermaphroditic של xyloph...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B. xylophilus מבודד Nxy61			מופק מ-Pinus massoniana באזור נינגבו בסין
		עובש אפור	שהושג מהאקדמיה ליערנות של סין
משפכי ברמן צינורות	סנגונג
	סנגונג
	סנגונג
פיפטה	Sengong
סטרילי dd H2O			מעוקר בלחץ גבוה של קיטור ב-121 מעלות; C למשך 30 דקות.
צלחות פטרי	Sengong
PDA בינוני	Huankai Bio.	021050
חממה	Sengong
Laminar זרימה	Sengong
סטריאוסקופ	Leica	LED5000 RL
מיקרוסקופ סטריאו הפוך	Zeiss	A1
שקופיות קעורות	Sengong